Undersøkelse av Proteiner Bundet til begynnende DNA i pattedyrceller Bruke BrdU-chip-Slot-vestlig Technique

Abstract

Histone deacetylases 1 og 2 (HDAC1,2) lokaliseres til områder av DNA replikasjon. I forrige undersøkelse, ved hjelp av en selektiv inhibitor og en genetisk knockdown system, vi viste nye funksjoner for HDAC1,2 i replikasjonsgaffelen progresjon og gryende kromatin vedlikehold i pattedyrceller. I tillegg brukte vi en BrdU-Chip-Slot-vestlig teknikk som kombinerer kromatin immunopresipitering (chip) av brom-deoksyuridin (BrdU) -merket DNA med slot blot og Vest-analyser for å kvantitativt måle proteiner eller histone modifisering assosiert med begynnende DNA.

Aktivt delende celler ble behandlet med HDAC1,2 selektiv hemmer eller transfektert med sirnas mot Hdac1 og Hdac2 og deretter nysyntetiserte DNA ble merket med tymidinanalog bromdeoksyuridin (BrdU). Den BrdU Merkingen ble utført på et tidspunkt da det ikke var noen signifikant cellesyklus-stans eller apoptose på grunn av tap av HDAC1,2 funksjoner. Etter labeling av celler med BrdU, kromatin immunopresipitering (chip) av histon acetylering merkene eller kromatin-remo ble utført med spesifikke antistoffer. BrdU-merkede DNA-inngang og immunpresipitert (eller chiped) DNA ble deretter flekket på en membran ved hjelp av slissen blot teknikken og immobilisert ved hjelp av UV. Mengden av begynnende DNA i hvert spor ble deretter kvantitativt vurdert ved hjelp av Western-analyse med et anti-BrdU-antistoff. Effekten av tap av HDAC1,2 funksjoner på nivåene av nylig syntetiserte DNA-assosiert histon acetylering tegnene og kromatin remo ble deretter bestemt ved å normalisere BrdU-ChIP signal oppnådd fra de behandlede prøvene til kontrollprøvene.

Introduction

Defekt DNA reparasjon og / eller DNA-replikasjon er en vesentlig årsak til genom ustabilitet, noe som kan føre til celledød. En enkelt ureparert dobbel tråd pause er tilstrekkelig til å forårsake celledød ^en. Chromatin organisasjonen er forbigående endret under både replikasjon og reparasjon ^2,3, og unnlatelse av å opprettholde epigenetisk informasjon i løpet av disse prosessene vil resultere i en trussel mot genom integritet. Tap av HDAC3 eller HDAC1,2 funksjon hindrer S-fase progresjon, DNA replikasjon og reparasjon fører til genotoksisk belastning (DNA skade) og celledød ^4-9. Det er derfor en praktisk strategi for å bruke selektive HDAC-inhibitorer for å forstyrre replikasjon, reparasjon og kromatin i kreftceller og føre til DNA-skade, som i sin tur kan stoppe vekst og induserer celledød selektivt i raskt voksende kreftceller.

Under DNA replikasjon, er kromatin raskt demonteres og deretter satt sammen igjen etter DNA duplisering. Nylig synthesized histon H4 acetyleres på K5 og K12 rester (H4K5K12ac) og følgende avsetning på kromatin, blir de raskt deacetyleres av histon deacetylases (HDACs) ^10,11. Svikt i cellene for å opprettholde integriteten av nascerende kromatin histon-deacetylering kan føre til kollaps gaffel, som i sin tur kan føre til DNA-skade og celledød. Vi har nylig viste at selektiv hemming av HDAC1,2 øker histon acetylering (H4K5ac, H4K12ac og H4K16ac) og hemmer SMARCA5 kromatin remo aktivitet på begynnende kromatin, som korrelerer med redusert replikasjonsgaffelen progresjon, økt gaffel kollaps og økt replikering stressindusert DNA-skader ⁶ . Således kan HDAC-inhibitor behandling forandre begynnende kromatinstruktur å utløse DNA-skade og død meget raskt i kreftceller, da disse celler syklusen raskt og passerer flere ganger gjennom S-fasen. Det er derfor viktig å forstå hvordan HDACs fungere å regulere histon acetylering og protein binding for å opprettholde DNA-replikasjon i pattedyrceller.

Å kvantitativt måle mengden av histon acetylering og SMARCA5 kromatin remo assosiert med begynnende DNA ved DNA-replikasjon, har vi utviklet en modifisert ChIP assay kalt BrdU-chip-Slot-vestlig teknikk. Etter kromatin immunoutfelling (chip) for et ønsket protein eller histone modifikasjon, mengden av begynnende DNA (merket ved anvendelse av tymidinanalog, BrdU) i brikken prøve kan påvises ved hjelp av Western-analyse av BrdU-merkede ChIP DNA overført til en membran ved hjelp av en spilleautomat Blot apparat. Ved hjelp av denne teknikken, viste vi at H4K16ac (et merke som er involvert i kromatin emballasje) og ISWI familiemedlem SMARCA5 (SWI / SNF-relaterte matrix-forbundet aktin avhengig regulator av kromatin) kromatin remo er assosiert med begynnende DNA i S-fase celler ^6. Vi fant også at den gryende H4K16ac mark deacetyleres av HDAC1,2 under DNA replikasjon ^6. H4K16ac hemmerkromatin remo aktivitet av ISWI familiemedlem SMARCA5 ^12. Derfor bruker BrdU-CHIP-Slot-vestlig teknikk, kunne vi koble funksjonene for HDAC1,2 i regulering kromatin remodelle under DNA replikasjon. Derfor er BrdU-Chip-Slot-Western Blot teknikken en kraftig tilnærming til kvantitativt måle foreningen og dissosiasjon dynamikken i proteiner eller deres post-translasjonelle modifikasjoner som er bundet til begynnende DNA.

Protocol

1. Chromatin immunoutfelling (chip) følgende BrdU merking

1. Kultur NIH3T3-celler i nærvær av enten DMSO eller HDAC1,2-selektive inhibitorer som tidligere beskrevet ^seks.
2. Etter behandling med DMSO eller HDAC1,2 selektive inhibitorer, tilsett BrdU til cellene i et sterilt vevskultur hette. Inkuber 2 x 10 ⁶ NIH3T3-celler sådd ut i 10 ml NIH3T3 medier med en 20 pM sluttkonsentrasjon på bromdeoksyuridin (BrdU) i 60 minutter i en steril 37 ° C vevskulturinkubator.
3. Tverrbinding intracellulære proteiner til DNA ved å tilsette formaldehyd direkte til kulturmediet til en sluttkonsentrasjon på 1%. Inkuber 2 x 10 ⁶ NIH3T3-celler med formaldehyd ved RT i 10 min på en rister.
4. Slukke tverrbinding ved tilsetning av glycin til en sluttkonsentrasjon på 125 mM. Inkuber ved RT i 5 min på en rister.
5. Fjern de media og samle cellene i PBS i et 15 ml sentrifugerør. Spin cells ved 956 xg i 5 min ved 4 ° C. Vask cellepelleten to ganger med iskald PBS. Fjern PBS fra røret. Oppbevar det tverrbundne cellepelleten uten PBS (supernatanten) ved -80 ° C inntil bruk.
6. Klargjør lysat fra det tverrbundne cellepelleten ved tilsetning av 500 ul FA140 buffer (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 og 0,1% natrium deoksycholat) supplert med proteasehemmer cocktail.
7. Skjær kromatinet av sonicating prøvene fem ganger på 35% strøm og med en 15 sek puls, 0,9 sek på og 0,1 sek av innstillingen. Hold rørene på is etter hver runde med ultralyd å unngå oppvarming av prøvene.
   1. Sjekk klipping på en DNA gel som klipping effektivitet vil variere mellom ulike sonicators. For å sjekke lydbehandling, omvendt kryssbinding ved å legge NaCl til en konsentrasjon på 0,16 M og utføre trinnene 1.17.1. - 1.22. Kjør eluert 10 mL DNA på en 1,5% agarosegel for å sjekke om klipping ermellom 300-700 bp med en gjennomsnittlig intensitet på 500 bp.
8. Etter ultralydbehandling, sentrifugere prøven i 10 minutter ved 17.949 xg ved 4 ° C, og supernatanten overføres til et nytt rør.
   1. Utføre protein estimering ved bruk av kommersielle proteinanalysesettet i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Bruk lik mengde av lysat for chip av kontroll og eksperimentelle prøver. Vanligvis bruker 1 mg total lysatet per ChIP reaksjon.
9. Forbered 50% slurry av protein A-agarose bruker FA140 buffer som inneholder proteasehemmer cocktail. Legg 1/10 volum av protease inhibitor cocktail. Beregne volumet av perler som trengs basert på antall prøver totalt.
   1. Vask Protein A-agarose perler med buffer FA140 to ganger for å fjerne lagringsbuffer og tilsett et likt volum til FA140 buffer til kulene for å gjøre 50% suspensjon.
   2. For å fjerne proteiner som ikke-spesifikt bindes til kulene, tilsett 50 ul av 50% suspensjon av protein A-agarose og icubate prøvene ved 4 ° C med konstant ende-over-ende-rotasjon i en DRIKKE blander i 30 min.
10. Spinne prøvene ved 956 xg ved 4 ° C i et minutt. Samle supernatanten og utføre immunutfelling ved tilsetning av enten 8 mL H4K16ac antistoff eller 5 ul (5 ug) av 1 mg / ml SMARCA5 antistoff til supernatanten. Inkuberes ved 4 ° CO / N med konstant end-over-end rotasjon i en rotisserie mikser.
11. Spar 1 / 10th av ekstraktet for 'inngang' kontroll og angi det som til side ved -20 ° C. Den inngang må være omvendt tverrbundet sammen med IP-prøvene.
12. Bruk lik mengde kanin-IgG (5 pl av 1 mg / ml) som den negative kontrollprøve immunpresipitering.
13. Den følgende dag, tilsett 50 pl 50% protein A-agarose slurry til ekstraktet og inkuberes i 1 time ved 4 ° C med rotasjon.
14. Pellet agarosekuler ved sentrifugering ved 956 x g i 2 min ved 4 ° C, fjern forsiktig supernatanten og wash perler med følgende buffere sekvensielt. I buffer forberedelser, legge proteasehemmere rett før bruk.
    1. Vask med lav Salt immunkompleks vaskebuffer (FA140; sluttkonsentrasjon på 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 og 0,1% natriumdeoksycholat) for 5 minutter ved 4 ° C med ende-over-ende-rotasjon.
    2. Vask med høy saltimmunkompleks vaskebuffer (FA500; sluttkonsentrasjon på 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 og 0,1% natriumdeoksycholat) for 5 minutter ved 4 ° C med ende-over-ende-rotasjon.
    3. Vask med LiCl immunkompleks vaskebuffer (sluttkonsentrasjon på 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40, og 0,5% natriumdeoksycholat) i 5 min ved 4 ° C med ende-over-ende-rotasjon.
15. Etter vask, som beskrevet ovenfor, tilsett 200 ul elueringsoppløsning (sluttkonsentrasjon på 1% SDS og 100 mM natrium bikarbonat) og incubate ved RT i 15 min med ende-over-ende rotasjon ved RT.
16. Spin prøvene ved 956 x g ved romtemperatur og overføre eluatet til et nytt 1,5 ml rør. Gjenta steg 1,15 med ytterligere 200 ul elueringsoppløsning.
17. 400 ul av eluatet, legge NaCl til en konsentrasjon på 0,16 M og bland godt.
    1. I tillegg, tilsett 400 ul elueringsoppløsning til 10 ul inngang som ble satt til side (trinn 1.11) og legge NaCl til en konsentrasjon på 0,16 M til å reversere tverrbindingsinngangsprøver også. Omvendt fornette prøvene ved inkubering i 65 ° C vannbad i 5 timer.
18. Tilsett 1 ml 100% EtOH til den omvendte-tverrbundne eluat. Bland godt og inkuber ved -80 ° C i 2 - 3 timer, eller ved -20 ° CO / N. Spinne prøvene ved 17 949 xg i 15 min og kast etanol.
19. Legg 800 mL 70% etanol for å vaske pelleten. Spin på 17 949 xg i 15 min ved 4 ° C og kast etanol. Spinne kort for å fjerne eventuelle rester av etanol. Luft-tørke prøvene ved 37 ° C i 10 min for å fjerne gjenværende etanol.
20. Oppløs-DNA i 90 ul RNase og DNase fritt vann og tilsett 2 ul 10 mg / ml RNase på en 0,2 mg / ml sluttkonsentrasjon. Inkuber ved 37 ° C i vannbad i 30 min.
21. Tilsett 10 pl 10x proteinase K-buffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% SDS). Bland godt og tilsett 1 pl proteinase K. Inkuber ved 42 ° C i 1 time.
22. Rens inngang og chip-DNA ved hjelp av PCR kommersiell rensing kit i henhold til produsentens protokoll og elueres DNA i 50 ul vann. Lagres DNA ved -20 ° C inntil videre anvendelse.

2. Slot Blot Analyse av chip DNA

1. Mål utbyttet av input og chip-DNA ble eluert i 50 ul vann som beskrevet i trinn 1,22 ved bruk av et spektrofotometer ved 280 nm i overensstemmelse med fabrikantens protokoll.
2. Ta like volumer (50 mL) i inngangs- eller immunopresipitert DNA som er innenfor det lineære området for deteksjon.
   1. For eksempel, hvis inngangsDNA utbyttet er 1,5 ng / ul, så ta 30 pl (eller 45 ng total DNA) og lage volum til 50 ml med vann. For faktor ChIP, ta hele 50 ul eluatet fra trinn 2,1 og fortsett til trinn 2.3.
3. Denaturering 50 ul inngang eller immunopresipitert DNA ved tilsetning av 2,5 volumdeler 0,4 N NaOH, kort vortex og sentrifuger i 956 xg i 10 sek, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
4. Nøytraliser den denaturerte DNA ved tilsetning av 175 ul av 1 M Tris-HCl, pH 6,8, vortex, sentrifuger for 956 x g i 10 sek og plassere prøvene på is.
5. Tilbered en seriell fortynning av input og immunopresipitert DNA til Slot Blot analyse som beskrevet nedenfor.
   1. Følg trinn 2,3 - 2,4 for å få et totalt prøvevolum på 350 ul (dvs. 50 ul Input / ChIP DNA, 125 ul 0,4 N NaOH, 175 pl 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
      Merk: For eksempel fremgår ovenfor, vil 45 ng av innspill DNA ende opp som 0,129 ng / mL.
   2. For innspill DNA, merk tre-tubes 100, 50 og 25, og tilsett 100 ul, 50 ul og 25 ul av denaturert og nøytralisert DNA-prøve. Gjør det endelige volumet til 100 mL med nukleasefritt vann. For ChIP DNA, etiketten tre rør som 200, 100 og 50 og legge 200 mL, 100 mL og 50 mL av denaturert og nøytralisert DNA-prøve. Gjør endelig volum til 200 ml med nukleasefritt gratis vann.
6. Kutt membranen til størrelsen av Slot Blot-apparat. Pre-våte membranen og blotting papers i 20x SSC før og før du legger DNA. Sette dem sammen til Slot Blot apparatet i henhold til produsentens protokoll.
7. Pipet DNA fra trinn 2.5.2 i riktige spor. Anvend vakuum sakte å trekke DNA på zeta-probe membran. Stoppe vakuum etter alle prøvene har passert gjennom apparatet.
   1. Demontere anordningen og umiddelbart immobilisere DNA på membranen ved anvendelse av en UV-tverrbinder. Har DNA siden opp i UV kryssbinder og bruke autocrosslink innstillingen i tverrbinder. Følg produsentens protokoll.
8. Oppdage BrdU på sporet blot ved å utføre western blotting.
   1. Blokkere membranen med 5% ikke-fettholdig tørrmelk i PBS inneholdende 0,1% Tween-20 (PBST) i 1 time ved RT for å forhindre ikke-spesifikk binding av antistoffer til membranen.
   2. Legg primær anti-BrdU-antistoff (1: 500 fortynning) fortynnet i 1% fettfri tørrmelk i PBST og inkuber blot med det primære antistoff i 3 timer ved RT på en ristemaskin. Vask membran med PBST tre ganger etter det primære antistoff inkubering.
   3. Legg HRP-konjugert anti-muse-sekundært antistoff til blot (1: 5000 fortynning) og inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask membran med PBST tre ganger etter det sekundære antistoff inkubering.
      MERK: Bruk nok volum av antistoffene til å dekke membranen under primære og sekundære antistoff inkuberingene.
9. Klargjør ECL mix og legge det til blot achold til produsentens protokoll. Inkuber membranen med ECL blanding i 5 min ved RT.
   1. Plassere membranen i en røntgenkassett, utsettes membranen til røntgenfilm og utvikle blot ved anvendelse av produsentens protokoll.
   2. Kvantifisere signal oppnås for innspill og chiped DNA etter skanning blotter ved hjelp av Image J programvaren i henhold til produsentens protokoll. For kvantifisering, bruk signal som ligger innenfor det lineære området for påvisning for å sikre nøyaktigheten av målingen.

Representative Results

For å bestemme spesifisiteten av HDAC1,2-hemmere, ble Hdac1,2 ^{FL / FL} og Hdac3 ^{FL / FL} fibrosarkom celler brukes. Adenovirus-inneholdende Cre rekombinase (Ad-Cre) ble brukt til å slette Hdac1,2 og Hdac3 i disse cellene. Etter Ad-Cre infeksjon av Hdac1,2 ^{FL / FL} -celler, ble en sterk økning i H4K5ac observert. Behandling av Hdac1,2 knockout celler med 233 eller 898 resulterte ikke i noen ytterligere økning i H4K5ac bekrefter at 233 og 898 hemme Hdac1,2 og ikke Hdac3 i disse cellene. I motsetning til dette, tilsetning av 233 eller 898 for å Hdac3 knockout-celler resulterte i en betydelig økning i H4K5ac i forhold til økningen sett i Hdac3 knockout-celler på grunn av en additiv effekt på H4K5ac nivåer som resultat av inhibering av Hdac1,2 og 3. Derfor 233 og 898 er Hdac1, 2-hemmere. Disse resultater er vist iFigur 1.

Å validere BrdU-Chip-Slot teknikk, ble BrdU-puls chase analyse utført for å se på kinetikken PCNA lasting på den gryende DNA i HeLa celler. Våre resultater viste at PCNA forbindelse med begynnende DNA skjer raskt innen 15 min og forsvinner etter en 30 min jage etter avtale med tidligere publiserte resultater ^13. Disse resultatene er vist i figur 2.

BrdU-H4K16ac ChIP-Slot-Western teknikk ble anvendt for å bestemme mengden av H4K16ac assosiert med begynnende DNA i fravær av HDAC1,2 funksjon. En robust anrikning i H4K16ac assosiert med begynnende DNA ble observert sammenlignet med kanin-IgG-kontroll (figur 3A og 3B). Økningen i begynnende DNA-assosiert H4K16ac etter hemming av HDAC1,2 aktiviteter eller knockdown av Hdac1,2 er vist i figur 3C 3D og 3E.

Nivået på SMARCA5 kromatin remo på begynnende DNA ble fastsatt ved bruk BrdU-SMARCA5 ChIP-Slot-vestlig teknikk. Våre resultater viste at SMARCA5 forbinder med begynnende DNA i pattedyrceller. Videre gjorde HDAC1,2 hemming eller knockdown av Hdac1,2 ikke endre mengden av begynnende DNA-forbundet SMARCA5 kromatin remo som vist i Figur 4.

Figur 1. Bekreftelse av spesifisiteten av HDAC1,2-selektive hemmere. Western analyse av helcellelysater fremstilt fra Hdac1 ^{FL / FL} Hdac2 ^{FL / FL} eller Hdac3 ^{FL / FL} fibrosarkom celler etter Ad-Cre infeksjon og behandling med 898 eller233. Cellene ble behandlet med 3 mikrometer 898 eller 233 i 24 timer etter en 48 timers Ad-Cre infeksjon. Dette tallet er hentet fra vår tidligere publiserte arbeider ^6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Dynamics of PCNA Association med den begynnende DNA i HeLa celler. HeLa-celler ble merket med bromdeoksyuridin (BrdU) i 30 min. Cellene ble deretter vasket for å fjerne unincorporated BrdU og dyrket i media uten BrdU for angitte perioder (jage). Chromatin immunoutfelling (chip) ble utført med anti-prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) antistoff. BrdU-merket DNA som er tilstede i inngangs-DNA og de som er forbundet med PCNA ble vurdert i sporet blot analyser ved anvendelse av et anti-BrdU antistoff som vist i figur 2. Denne figuren hentet fra vår tidligere publiserte arbeider ^6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Tap av histondeacetylase 1 og 2 Øker H4K16ac på begynnende DNA. (AB) bromdeoksyuridin (BrdU) puls jage ble utført i HeLa og NIH3T3 celler for å bestemme sammenslutning av H4K16ac med begynnende DNA på angitte tidspunkter. (CD) NIH3T3-celler ble behandlet med enten DMSO eller en HDAC1,2-selektiv inhibitor (898 eller 233) i 24 timer. (E) NIH3T3 celler ble enten transfektert med ikke-targeting (NT) eller Hdac1,2 (H12) siRNA. Celler fra (C - E) ble merket med BrdU og bruktfor ChIP med anti-H4K16ac fulgt av Slot blotting. Membranen ble probet med anti-BrdU-antistoff. Tallene indikerer til Image J kvantifisering av gjennomsnittlig BrdU signal av høy og middels volum av chip DNA oppdaget. Dette tallet er hentet fra vår tidligere publiserte arbeider ^6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. SMARCA5 Associates med begynnende DNA. Mengden av SMARCA5 på gryende kromatin følgende tap av HDAC1,2 funksjonen vises. NIH3T3 celler ble enten behandlet med en HDAC1,2-selektiv inhibitor (898) eller transfektert med ikke-targeting (NT) eller Hdac1,2 (H12) siRNA. Celler ble merket med BrdU å følge de ovennevnte behandlinger og brikke med anti-SMARCA5 eller kanin IgG (negativ c-regulering) ble utført. Økende volumer av ChIP DNA ble oppdaget på sporet blot og membranen ble probet med anti-BrdU-antistoff. Dette tallet er hentet fra vår tidligere publiserte arbeider ^6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den protokoll som er beskrevet i dette manuskriptet er en relativt rask metode for å demonstrere nærværet av proteiner eller deres post-translasjonelt modifiserte former for nylig replikerte eller begynnende DNA. I tillegg tillater denne teknikken en å måle krets-dissosiasjons-kinetikk av et protein eller dets modifisert form med begynnende DNA. Denne teknikken er komplementær til den elegante iPOND teknologi ^13. I iPOND teknologi, er nylig syntetisert DNA merket med etyl deoksyuridin (Edu). En biotinkonjugatet blir deretter lagt inn på Edu bruker klikk kjemi. Biotin-merket gryende DNA blir deretter immunopresipitert bruker streptavidin perler og co-rensende proteiner blir oppdaget av western blotting. På den annen side, i vår BrdU-chip-Slot-Western teknikk, er et protein eller dets modifisert form i forbindelse med begynnende DNA-immunopresipitert ved hjelp av protein-spesifikke eller modifisert form-spesifikt antistoff og mengden av BrdU-merkede begynnende DNA bundet til protein er then bestemt kvantitativt ved slot-Western blotting ved å bruke et anti-BrdU-antistoff.

Det er viktige skritt i denne protokollen som trenger spesiell oppmerksomhet. Det er viktig å sikre at antistoffet av interesse fungerer godt i standard brikke analyser med en høy virkningsgrad. Det er viktig å teste effektiviteten av et antistoff i Chip-analyser ved kvantitativ PCR før utførelse av BrdU-CHIP-Slot-Western-analyse. For kvantifisering av den BrdU-CHIP-Slot-vestlig teknikk for å være nøyaktig, må en seriell fortynning av BrdU-merkede DNA kan anvendes for å spalte blott og western-analyse ved bruk av anti-BrdU-antistoff bør innledningsvis utført for å bestemme lineære området for gjenkjenning. Bestemmelse av DNA-konsentrasjonen av chip og Input DNA gjør det mulig å sikre at mengden av BrdU-merket DNA er innenfor det lineære området for påvisning i Western blotting. For eksempel har vi fastslått 50 ng til 12,5 ng av input DNA for å være iden lineære området i vår pilotforsøk. Også, dersom konsentrasjonen av chip prøvene er svært høy, er det viktig å fortynne ChIP DNA før du utfører sporet. Begrensningen med denne teknikken er den oppløsning, som er avhengig av effektiviteten av kromatin klipping. Skjær av kromatin ved ultralydbehandling bestemmer nærhet av et gitt protein eller dets modifisert form for den nylig syntetisert DNA.

Tidligere studier av endringer i kromatin og kromatin modifiserende enzymer under DNA replikasjon i pattedyrceller forble et vanskelig spørsmål å ta opp på grunn av utilgjengelighet av riktige teknikker. Dessuten, siden Hdac1,2-null-celler arrest i G1 fase, var det vanskelig å undersøke funksjonene for Hdac1,2 i S-fasen. I vår studie viste vi funksjoner for disse to Hdacs under DNA replikasjon ved hjelp av en kombinasjon av første-i-klassen selektive hemmere å hemme sine aktiviteter innenfor S-fasen og romanen BrdU-Chip-Smasse-vestlig teknikk. I fremtiden, kan denne teknikk også anvendes for å studere dynamikken i DNA-skade respons og DNA-reparasjons proteiner ved fastlåste gaffelen i tillegg til å ta histonmodifikasjonene og kromatin-modifiserende enzym på gaffelen. Dessuten er denne teknikken ikke begrenset til muse NIH3T3-celler. Denne teknikken kan med hell brukes i andre cellelinjer for å undersøke hvordan andre hemmere av enzymer eller proteiner som påvirker DNA-replikasjon og replikasjonsstressinduserte endringer kromatin ved replikasjonsgaffelen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20x SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators