Introduction
Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) è ampiamente utilizzato per ottenere una migliore comprensione delle funzioni cellulari in cellule viventi con alta risoluzione temporale e spaziale 1. In FRET, l'energia da un fluoroforo donatore eccitato è trasferita ad un fluoroforo accettore. Efficienza FRET è fortemente dipendente dalla distanza tra il donatore e accettore fluoroforo e il loro orientamento ed è quindi una lettura sensibile cambiamenti conformazionali che influenzano i due fluorofori. Questo fenomeno viene sfruttato per generare biosensori basati FRET per l'imaging di piccole molecole. Cambiamenti nella loro concentrazione può essere monitorato come aumenta / diminuisce nel rapporto di intensità di emissione del fluoroforo accettore rispetto al donatore 2. Ad esempio, biosensori a base di calcio-FRET consentono il rilevamento veloce e stabile di concentrazioni di calcio liberi nelle cellule viventi 3. Altri vantaggi di biosensori basati su FRET sono imaging singole cellule viventi, terede non invasività, la loro capacità di essere mirata a diversi tipi di cellule e compartimenti cellulari 4.
Molti aspetti della dinamica degli acidi biliari intracellulare sono ancora poco conosciuti. Ad esempio, poco si sa circa il meccanismo di regolazione di base del trasporto degli acidi biliari coniugati e non coniugata. Tecniche esistenti per monitorare questo trasporto in primo luogo fanno uso di giornalisti basati luciferasi-, acidi biliari radioattivi, o gli analoghi degli acidi biliari fluorescenti. Quest'ultima richiede la modifica degli acidi biliari, possibilmente che interessano le loro proprietà. Giornalisti basato luciferasi-hanno scarsa risoluzione temporale. Inoltre, queste tecniche comportano la perdita del campione e non sono applicabili per l'imaging in cellule singole. Pertanto, sarebbe utile usare metodi che consentano vivo imaging cellulare unico di attività di trasporto utilizzando biosensori FRET, soprattutto dal momento che comprende il vantaggio di rilevamento raziometrici 5, 6. Mentre varianti del CFP / form YFP utilizzato più frequentemente coppie FRET, nuove strategie utilizzando Morange e mCherry trasportano mutazioni auto-associazione-inducono hanno portato ad un ampliamento della toolbox FRET con nuovi sensori, tra cui un sensore di acido biliare rosso-spostato 7.
Abbiamo già creato un FRET bile sensore acido geneticamente codificato (BAS), che consiste in un fluoroforo donatore (ceruleo) e un fluoroforo accettore (citrino) che si fonde con il recettore X farnesoid (FXR) ligando dominio di legame (FXR-LBD) e un peptide contenente un motivo LXXLL 8. Questo peptide si associa con il FXR-LBD in maniera acido-dipendente biliari. Dopo l'attivazione FXR, la distanza tra citrino e ceruleo cambierà a causa di un cambiamento conformazionale. In linee cellulari di mammifero, FXR risultati di attivazione in un aumento chiaramente rilevabile nel / rapporto di ceruleo citrino, mentre il sensore purificato opera nella direzione opposta e porta ad un rapporto di FRET diminuita al momento dell'attivazione FXR. Questo sensore (CytoBAS)consente il monitoraggio delle dinamiche degli acidi biliari citosoliche. Con carbossi-terminale aggiunta di motivi di targeting subcellulare, il costrutto BAS può essere mirata al nucleo (NucleoBAS) e perossisomi (PeroxiBAS), consentendo misurazioni delle concentrazioni di acidi biliari nei diversi compartimenti cellulari. Anche se l'aggiunta del motivo di targeting perossisomale non altera la sua capacità di risposta agli acidi biliari, cellulari permeabili FXR-ligandi non ha indotto alcun Fret cambiamenti di PeroxiBAS dentro perossisomi 8. Come la natura di questa discrepanza non è noto, il protocollo seguito è focalizzata su CytoBAS e NucleoBAS.
L'uso di questo sensore FRET geneticamente codificato è stato recentemente dimostrato in cellule contenenti i trasportatori epatici acidi biliari Na + polipeptide / taurocolato co-trasportatore (NTCP) e organica soluto trasportatore alfa / beta (OSTαβ) 8. NTCP è il principale importatore epatica acidi biliari e OSTαβ è un bile intestinale basolateraletrasportatore acido che può funzionare sia come importatore ed esportatore dipende dal gradiente di concentrazione degli acidi biliari elettrochimico 9, 10. Dati recenti hanno mostrato che al trasporto degli acidi biliari da NTCP e / o OSTαβ, risposte robuste e veloci in rapporto FRET come risultato dell'interazione ligando-FXR-LBD possono essere osservati.
Qui, descriviamo protocolli dettagliati per i metodi per misurare FRET quali confocale analisi microscopica e la fluorescenza delle cellule attivate (FACS), segnalano passaggi critici, affrontare potenziali problemi e discutere metodi alternativi. L'utilizzo di questo sensore FRET geneticamente codificato, l'interazione degli acidi biliari con FXR-LBD può essere quantificata e monitorata direttamente nelle cellule viventi e fornisce un metodo rapido e semplice di visualizzare trasporto degli acidi biliari e le dinamiche in tempo reale. Plasmidi di espressione di mammifero che codificano CytoBAS e NucleoBAS sono disponibili in commercio. Pertanto, questo biosensore in grado di contribuire ulteriormente allacomprensione dei trasportatori degli acidi biliari o composti che attivano FXR e fornire una più profonda comprensione della biologia e la segnalazione degli acidi biliari.
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Protocol
1. Trasfezione transitoria
Nota: CytoBAS e NucleoBAS (Vedere materiali Tabella) sono utilizzati con successo in diversi tipi di cellule, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK e cellule HEK293T). Il requisito principale di utilizzare il sensore è che deve essere espressa, richiede il DNA codifica per entrare nella cellula.
- Celle di raccolta da un confluenti 80% 25 cm 2 pallone. Diluire le cellule nel mezzo di coltura completo adatti per la linea cellulare (10% FBS, 1% L-glutammina, 1% pen / strep per celle U2OS e Huh7).
- Cellule piatto alla densità desiderata in una sterile 8 vetro di copertura bene a camera (0,8 cm 2). Obiettivo per un sub-confluenti (60-80% di confluenza) strato di cellule il giorno dell'esperimento, anche se questo non è essenziale.
- Aggiungere mezzo di coltura completo per un volume finale di 400 microlitri per pozzetto. Consentono alle cellule per attaccare per 24 ore.
- Preparare la miscela di trasfezione in una provetta sterile aggiungendo 0,5 mg di NucleoBASo DNA CytoBAS per 100 ml di terreno di coltura (siero / antibiotico gratuito). Vortex bene. Aggiungere un reagente di trasfezione e mescolare nel vortex. Reagenti di transfezione che danno la massima efficienza sono tipo di cellula dipendente e potrebbero richiedere test preliminare.
- Per esempio, utilizzare 2,5 ml di 1 mg / ml polyethylenimine (PEI) e incubare il DNA / PEI miscela per 15 minuti a RT.
- Aggiungere la miscela di trasfezione nelle goccioline alle cellule e mescolare scuotendo leggermente il piatto ben a mano. Aggiungere 100 microlitri della miscela per un pozzo di ~ 9.6 cm 2. Utilizzare 10 ml di miscela di trasfezione per camere di imaging individuali per cellule trasfettate.
Nota: Dopo 24-48 ore, le cellule esprimeranno il sensore degli acidi biliari e può essere utilizzato per gli esperimenti.
2. Trasfezione stabile
- Celle di raccolta da un confluenti 80% 25 cm 2 pallone. Diluire pellet in mezzo di coltura completo adatto per la linea cellulare specifico (10% fetale bovino SERUM, 1% L-glutammina, 1% pen / strep per celle U2OS e Huh7) ad una concentrazione di 150.000 cellule per ml e aggiungere circa 300.000 cellule per pozzetto in una piastra di coltura da 6 pozzetti (2 ml di volume finale).
- Consentono alle cellule per attaccare per 24 ore.
- Preparare la miscela di trasfezione in una provetta sterile con l'aggiunta di 0,5 mg di CytoBAS o DNA NucleoBAS (Vedere materiali Tabella) per 100 ml di terreno di coltura (siero / antibiotico gratuito). Vortex bene. Aggiungere un reagente di trasfezione e mescolare nel vortex.
- Per esempio, utilizzare 2,5 ml di 1 mg / ml polyethylenimine (PEI) e incubare il DNA / PEI miscela per 15 minuti a RT.
- Aggiungere 100 ml di miscela trasfezione nelle goccioline alle cellule e mescolare scuotendo leggermente il piatto ben a mano. Includere sempre un controllo untransfected durante la creazione di una linea cellulare stabile.
- Crescere le cellule O / N a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Trypsinize cellule secondo il protocollo del produttore (Incubare le cellule a 37 ° C with 1,5 ml preriscaldata tripsina per 25 cm 2 coltura cellulare) e girano giù a 250 xg a temperatura ambiente per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 13 ml di terreno di coltura completo. Dividere le celle su vari 10 cm piatti della cultura diametro: 0,5 ml (a bassa densità), 1,5 ml (media densità), e 4.5 ml (ad alta densità). Fare lo stesso per restante 6,5 ml.
- Aggiungere terreno di coltura ad un volume finale di 10 ml. Per U2OS celle, utilizzare 800 mg / ml G418 per plasmidi con la cassetta di resistenza alla neomicina, come i CytoBAS e NucleoBAS costruisce selezionare per cellule positive. Questa concentrazione è tipo di cellula dipendente e possono essere determinati selezionando l'antibiotico più basso (G418) concentrazione in cui le cellule untransfected morti entro 2 a 10 giorni (800 mg / ml G418 per le cellule U2OS).
- Aggiornare il terreno di coltura con l'appropriato antibiotico (G418) ogni 72 ore fino a quando le cellule untransfected sono morti.
- Esaminare la piastra di coltura sotto il microscopio con un obiettivo 20X percolonie positive (fluorescenza possono essere monitorati utilizzando la maggior parte set di filtri utilizzati per la verde, ciano o fluorescenza gialla).
- Segnare i colonie positive che si trovano isolata dalle altre colonie con una penna sul fondo esterno del piatto di coltura.
- Lavare la piastra due volte con tampone fosfato (PBS) e aspirare esso. Prendere circa 15 cilindri di clonazione sterili e immergerli in silicone sterile. Applicarle attorno alle colonie selezionate premendo leggermente contro la piastra di Petri e fare in modo che non più di una colonia è incluso nel ring clonazione.
- Pipettare 20 ml di tripsina pre-riscaldato (1x, 0,25%) nel cilindro clonazione e incubare a 37 ° C finché la maggior parte delle cellule sono arrotondati (osservare con un microscopio).
- Aggiungere 150 ml di terreno di coltura con siero e l'antibiotico appropriato (il 10% FBS e 800 mg / ml G418 per le cellule U2OS e Huh7) nel cilindro clonazione e pipettare su e giù più volte per sospendere nuovamente le cellule e di trasferire a un 96-pozzetti. Aggiornare media dopo 4-24 ore e consentono alle cellule di crescere confluenti nei prossimi giorni (37 ° C, 5% di CO 2 per le celle U2OS e Huh7).
- Aggiorna media con antibiotici ogni 3 o 4 giorni. Quando le cellule sono cresciuti confluenti, trasferirli su un piatto ben più grande. Ripetere questa operazione fino a quando la cultura è abbastanza grande per gli esperimenti. Cryopreserve alcune fiale per il backup. Crioconservazione medio è costituito da 20% FBS e il 20% DMSO nei media (DMEM) senza supplementi.
Nota: Ora, la linea cellulare è monoclonale e considerato stabile per esprimere Bile Acid sensore. Metà della concentrazione del G418 antibiotico (400 mcg / ml) è ora sufficiente a mantenere espressione nella linea cellulare stabile.
3. lentivirali trasduzione
Nota: alcune linee cellulari sono considerati difficili da trasfettare con metodi più tradizionali come il metodo polyethylenimine (PEI). Trasduzione virale di cellule è un efficace strumento alternativo fo gene-consegna e di espressione del transgene stabile.
- Celle di raccolta da un confluenti 80% 25 cm 2 pallone. Diluire le cellule nel mezzo di coltura completo adatto per la linea cellulare specifico (10% FBS, 1% L-glutammina, 1% pen / strep per celle U2OS e Huh7) e aggiungere circa 200.000 cellule per pozzetto in una piastra di coltura da 6 pozzetti.
- Aggiungere terreno di coltura ad un volume finale di 2 ml per pozzetto. Consentono alle cellule per attaccare per 24 ore.
- Eseguire trasduzioni virali da parte delle cellule incubando per 4-6 ore con 500 microlitri CytoBAS lentivirus contenente medio (disponibile su richiesta) riempito fino ad un importo totale di 1 ml con mezzo di coltura completo contenente 10 mg / ml dietilamminoetil (DEAE) -dextran o un'altra lentivirali trasduzione enhancer. Non dimenticare di includere un pozzo con cellule di controllo non trasdotte.
- Rimuovere medie e aggiungere 2 ml di terreno di coltura completo contenente l'antibiotico desiderata (500 mg / ml Hygromycin). Utilizzare un costrutto lentivirale per CytoBAS trasduzione che fornisconos Hygromycin resistenza alle cellule. Crescere le cellule in condizioni desiderate.
- Refresh media con (500 mg / ml Hygromycin) antibiotico ogni 3 giorni e dividere le celle in cui l'80% confluenti, fino a quando tutte le cellule di controllo negativo sono morti (richiede circa 1-2 settimane per la maggior parte delle linee di cellule). La linea cellulare è ormai considerato stabile per esprimere Bile Acid sensore.
- In alternativa, usare le cellule per gli esperimenti di 1-3 giorni dopo la trasduzione virale. Come virus vivo potrebbe essere presente, questo richiede attrezzature FRET-lettura in ambienti con il livello di sicurezza adeguato.
- In alternativa, per un rapido isolamento di linee cellulari stabili, eseguire la fluorescenza delle cellule attivate (FACS).
- Celle di raccolta da un confluente 160 centimetri 2 fiasco.
- Diluire le cellule nel mezzo di coltura (Leibovitz L-15) con <5% di siero ad una concentrazione di massimo 5 x 10 6 cellule per ml
- Per la raccolta di cellule ordinati, riempire i tubi FACS con 1 ml di terreno collezione (L-15 media + 1,5% penna / strep, 1% di L-saturazione e% di siero 20).
- Celle di ordinamento per citrino (520-580 nm) o ceruleo (450-520 nm), eccitato con 405 laser.
- Dopo la cernita circa 500.000 cellule, centrifugare le cellule (5 min, 250 xg) e risospendere in 5 ml di normale mezzo di coltura completo (10% FBS, 250 mg / ml Igromicina per le cellule U2OS e Huh7 CytoBAS) e piastra in una cultura T25 pallone. Crescere le cellule in condizioni desiderate (37 ° C, 5% CO 2 per le celle U2OS e Huh7).
4. Imaging cellulare dal vivo di Bile Acid sensore
Nota: Le celle che contengono i trasportatori degli acidi biliari possono essere coltivate in terreno con siero carbone filtrata 1-10% che rimuove composti lipofilici. Siero normale spesso contiene acidi biliari che potrebbero portare ad accumulo intracellulare degli acidi biliari e la saturazione del Bile Acid sensore.
- Misure FRET utilizzando il microscopio confocale
- Piastra le cellule stabilmente o transiente esprimendo il sensore alla densità desiderata in una sterile 8 ben vetrino fondo vetrino da camera (0,8 cm 2). Crescere le cellule in mezzo di coltura completo (utilizzando siero carbonella-filtrato) in modo che il giorno dell'esperimento, confluenza è circa il 60-70%.
- Lavare le cellule aderenti a scivolo camera una volta con 200 microlitri 1x PBS o Leibovitz di L-15 terreno di coltura.
- Aspirare e sostituirlo con 300 ml L-15 terreno di coltura di Leibovitz in modo che nessun controllo di CO 2 è necessario.
Nota: DMEM senza rosso fenolo può essere utilizzato come bene, ma richiede di CO 2 condizioni buffer. Gli spettacoli sensore acidi biliari (alcuni) pH-sensibilità in modo mirano a mantenere costante il pH durante la raccolta dei dati. - Diluire i composti da utilizzare nell'esperimento confocale anche in L-15 terreno di coltura. Tener presente che durante l'imaging, relativamente grandi quantità di liquido nelle camere devono essere aggiunti per garantire una rapida miscelazione del campione (50-100 ml),così rendere le soluzioni 3-5x.
- Avviare il software di imaging di un microscopio confocale con un 37 ° C camera di incubazione e accendere il nm laser viola 405. Mettere una goccia di olio di immersione sul oggettivo e posizionare la camera 8 su di esso. Per l'imaging singola cella di FRET, utilizzare l'obiettivo di olio 63X. Il sensore è stato utilizzato con successo a temperatura ambiente, ma il comportamento delle cellule potrebbe essere alterato.
- Impostare le impostazioni del microscopio confocale correttamente.
- Impostare la modalità di acquisizione: xyt (time-lapse imaging di piano focale singola).
- Acquisire immagini a intervalli di 20 secondi per permettere composti da aggiungere tra le acquisizioni senza pause l'esperimento.
- Imposta campo spettrale per la rilevazione delle emissioni: Cerulean: 450-520 nm; Citrino: 520-580 nm.
- Concentrarsi sullo strato singola cella utilizzando la luce transilluminazione. Avviare imaging e regolare la posizione z più precisamente. Regolare il guadagno e offset per ogni canale di distinguere il segnale da sfondo mentre restanoing ben al di sotto di saturazione per tutti i pixel in cellule di interesse.
- Disegnare cerchi di definire la regione di interesse (ROI). Selezionare le celle che mostrano simile intensità di fluorescenza. Evitare di cellule che, ovviamente, differiscono dalla cella di medie dimensioni e forma. Esporre cellule alla luce per un tempo più breve possibile per minimizzare photobleaching del sensore. Si consiglia di disegnare ROI non molto vicino al perimetro della cella. Questa zona è più sensibile alle variazioni di intensità di fluorescenza a causa di drift focale (cellule si spostano in direzione z) rendendo più difficile monitorare variazioni rapporto di fluorescenza durante l'esperimento.
- Avviare misure con il microscopio confocale. Attendere che la fluorescenza ceruleo e citrino è stabile.
- Aggiungere 50-100 acidi biliari microlitri o altri composti in momenti scelti durante la misurazione. Sono necessari per miscelare fluidi ben (entro 10 secondi) le quantità relativamente elevate di liquido (un quinto ad un terzo del volume finale) senza agitare / pipetting su e giù. Assicurarsi di non toccare il bordo della camera 8-bene con la punta della pipetta e aggiungere il liquido lentamente in modo che le cellule non si ottiene fuori fuoco. Non aggiungere nuovi composti prima del raggiungimento della fase di plateau. Questo richiede circa 200 secondi.
- Fine di ogni esperimento con l'aggiunta di 100 microlitri GW4064, concentrazione finale 5-10 mM (dose saturante sensore) e attendere sensore di fluorescenza è stabile.
- Salvare l'esperimento ed esportare i dati come file .AVI.
- Open in ImageJ entrambi i file AVI (canale 00, ceruleo, canale 01, citrino) selezionando Plugin> Stack> Stack interleaver. In alternativa, l'importazione di file confocale (ad esempio, .lsm o file .lif) direttamente in Image J utilizzando i plugin appropriati (disponibili a http://www.openmicroscopy.org) e passare al punto 4.1.14.
- Per Stack 1: utilizzare Canale 01 (citrino).
- Per Stack 2: utilizzare Canale 00 (ceruleo).
- Clicca su Modifica> Selezione> Aggiungial responsabile, per aprire la finestra di gestione del ROI. Seleziona la casella 'Mostra tutto'.
- Trarre alcune regioni di interesse (ROI) che coprono cellule specifiche con lo strumento di selezione ovale. Disegnare anche un cerchio in una zona al di fuori delle cellule o all'interno di una cella che non esprime il sensore per determinare il segnale di fondo. Si consiglia di disegnare ROI non molto vicino al perimetro delle cellule in esperimenti quando le variazioni di intensità di fluorescenza a causa di deriva focale (le cellule che si muovono in direzione z) o la migrazione delle cellule erano evidenti.
- Selezionare una cella. Clicca su Plugins> Rapporto Profiler. Questo si tradurrà in 3 schermate: RAW, il rapporto e Ratio_Profile. La finestra RAW mostra l'aumento di intensità di citrino (linea blu) e una diminuzione ceruleo (linea rossa) in caso di FRET. La finestra Rapporto fornisce informazioni sul rapporto di citrino / ceruleo, che aumenterà con un aumento della FRET. La finestra Ratio_Profile dà il numero effettivo di intensità di fluorescenza misurata in entrambi i canali. Se microsaffrontare file specifici di configurazione (ad esempio, .lsm o .lif invece di avi) file vengono utilizzati l'ordine dei canali potrebbe essere invertito.
- Copiare i dati dalla finestra Ratio_Profile nel foglio di calcolo allegata come dati supplementari. Fare lo stesso per tutte le altre celle (ROI) e lo sfondo.
Nota: Nel foglio di calcolo online, tutti i dati sono normalizzati per la condizione in cui si prevede l'attivazione massimo BAS. Dato che GW4064 è il più potente attivatore FXR, il rapporto di fluorescenza dopo incubazione con un surplus di GW4064 è impostato su 1. È quindi importante chiudere tutti gli esperimenti con aggiunta di GW4064. Il vantaggio di questo è che i dati non è più dipendente da intensità del laser o il guadagno del rivelatore e esperimenti in giorni diversi possono essere confrontati più facilmente. Inoltre, nel grafico inferiore del foglio, una media corrente può essere utilizzato per agevolare le curve per rumore sperimentale. Tuttavia, non utilizzare questo grafico quando si analizzano i dati cinetici, dal momento che il Avera esecuzioneGE anche le risposte cinetiche veloci lisce.
- Misure FRET utilizzando Fluorescence Activated Cell Ordinamento (FACS)
- Diluire tutti i composti per l'esperimento in FACS FACS tampone sterile assorbimento (0,3 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,01% NaN 3 e 10 mM D-glucosio).
- Celle di raccolta da un cm 2 pallone di coltura cellulare 80% confluenti T-160 con 5 mM EDTA in PBS. Cellule centrifugare a 250 xg per 5 min. Lavare 2x pellet in 5 ml FACS tampone assorbimento a temperatura ambiente.
- Contare le cellule utilizzando il contatore vomere o di una camera di conteggio.
- Diluire pellet in tampone FACS assorbimento ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml. Pipettare su e giù per creare una sospensione omogenea di cellule singole. Se le cellule sono difficili da disaggregare, mettere i campioni attraverso un colino cella prima di smistamento per ridurre al minimo gli zoccoli ugelli.
- Dispensare 200 microlitri cellule per provetta FACS e li protegge dalla luce.
- Aggiungere la concentrazione desiderata del composto (ad esempio, Acidi biliari, leganti sintetici FXR, inibitori trasportatore). Vortice. Incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente agitando (al buio).
- Nel frattempo, avviare il FACS (i laser hanno bisogno di tempo per riscaldarsi).
- Impostare la citometria a flusso parametri di gating per l'esperimento (vedi figura 3):
- Caricare intorno 100.000-200.000 NucleoBAS o CytoBAS cellule trasfettate per determinare i cancelli.
- Prima regolare le tensioni FSC e SSC per tracciare le cellule al centro della trama.
- Utilizzando il laser viola, regolare il ceruleo (450/40 nm) valore della tensione e citrino (525/20 nm) Tensione e assicurarsi che tutti i NucleoBAS o CytoBAS cellule positive sono tracciati all'interno del diagramma a dispersione.
- Impostare le porte corrette (Porta P1 fino a Porta P4), vedere la Figura 4.
- Utilizzare porta P1 per escludere le cellule morte, di solito visualizzate nell'angolo in basso a sinistra selezionando la popolazione principale al centro del CSD-A / FSC Una trama.
- Utilizzare porta P2FSC-H / FSC Una finestra per rimuovere duine dall'analisi. Singole cellule sono presentati in una linea più diagonale di doppiette.
- Porta P3 nel citrino (525/20 nm) / Cerulean (450/40 nm) finestra può essere utilizzato per selezionare per NucleoBAS / CytoBAS cellule positive, da gating citrino e cellule di alta ceruleo, una popolazione mostrato in diagonale nell'angolo in alto a destra della la trama.
- Disegnare porta P4 in alto a sinistra della popolazione, il più vicino possibile e assicurarsi che non più del 5% delle cellule rientrano in questa porta.
- Caricare alcune cellule untransfected (senza espressione di CytoBAS o NucleoBAS) per determinare l'auto-fluorescenza. La popolazione untransfected non può essere situato in porta P3. Regolare porta P3, se necessario, di escludere le cellule auto-fluorescente.
- Agitare i campioni prima di mettere i tubi nel FACS. Per ogni campione, misurare almeno 10.000 cellule porta P3.
Nota: La Popolazione Finestra Gerarchia dà il numero di eventiessendo visualizzato per ciascuna porta e% del cancello genitore. In gate 4, la% del genitore afferma cellule con un'aumentata citrino / rapporto ceruleo come percentuale di tutte NucleoBAS cellule positive.
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Representative Results
Il sensore FRET-BAS presentato si basa sul dominio di FXR (LBD-FXR) legame ligando attaccato a due fluorofori citrino e cerulee) e un motivo LXXLL. Questo sensore permette indagini trasporto degli acidi biliari in cellule con alta risoluzione spaziale e temporale (Figura 1 A) vivono. Mutazioni in ceruleo e citrino sono stati applicati per promuovere la formazione del complesso intramolecolare (Figura 1 B). Gli acidi biliari e altri ligandi FXR legano a FXR e quindi alterano la distanza tra citrino e ceruleo da un cambiamento conformazionale. Nel vivere cellule di mammifero, questo si traduce in una maggiore efficienza FRET (aumento citrino, diminuzione ceruleo) (Figura 1 C, 1 D). Nel corso di un esperimento di cellule vive quantitativa basata intensità FRET con il microscopio confocale, it è stato osservato che l'acido taurochenodeoxycholic (TCDCA) -treated (30 micron), le cellule che esprimono U2OS NucleoBAS privi trasportatori degli acidi biliari non presentano variazioni di FRET, mentre la media citrino / rapporto ceruleo è aumentato notevolmente dopo il trattamento con GW4064 (5 micron) (Figura 1 C). Al contrario, U2OS cellule co-esprimono NucleoBAS, NTCP e OSTαβ hanno mostrato un chiaro aumento della citrino / rapporto Cerulean dopo l'aggiunta di TCDCA, e un aumento ancora più grande in rapporto dopo l'aggiunta di GW4064 (Figura 1 D). Ciò dimostra che TCDCA è in grado di passare attraverso la membrana cellulare e richiede trasportatori specifici per entrare nella cellula.
Localizzazione cellulare del sensore è determinata dalla presenza di segnali di localizzazione specifici. NucleoBAS si rivolge al nucleo dal segnale di localizzazione nucleare (Figura <strong> 2 B), mentre CytoBAS non contiene alcun segnale di localizzazione e quindi rimane nel citosol (Figura 2). Il biosensore può anche essere combinato con l'imaging di altre proteine fluorescenti, per misure di proteina espressione / localizzazione e attivazione FXR nella stessa cella. Ad esempio, la Figura 2 C mostra U2OS cellule co-trasfettate con NucleoBAS e NTCP-mKate2. Inoltre, il sensore può anche essere combinato con altri sensori per l'imaging subcellulare di più parametri contemporaneamente. Per esempio, NucleoBAS stato espresso con TGR5 (EST clone IMAGE # 5.221.127) ed un sensore cAMP citosolico (T Epac VV) 11 per misurare TGR5 ed attivazione FXR nella stessa cella allo stesso tempo. Su TGR5 vincolante, aumentati livelli di cAMP nel citosol che è stato rilevato dal sensore cAMP, mentre l'attivazione FXR nel nucleo era visCrown perso- nalizzate contemporaneamente. I dati 2D-F mostrare una serie temporale di 6 immagini confocali di cellule NucleoBAS-TGR5- T Epac vv dopo il trattamento con GW4064 (5 mM) (Figura 2 D), con TCDCA (10 mM) (Figura 2 E) o con acido chenodesossicolico (CDCA) (10 micron) (Figura 2 F) a t = 0. Il colore verde rappresenta le regioni in cui il rapporto di emissione 525/450 nm è diminuita (in rappresentanza di elevazione cAMP) e il colore rosa, rappresenta un aumento del rapporto di emissione (attivazione FXR), rispetto a i rapporti all'inizio dell'esperimento.
Inoltre, la citometria a flusso può essere utilizzato per lo screening di un pool di cellule a livello di singola cellula o come screening ad alto rendimento su tutta la popolazione. Cellule che esprimono U2OS NucleoBAS erano excited con un laser viola 405 nm e la fluorescenza è stato raccolto nella gamma 450/40 per la gamma ceruleo e 525/20 per citrino. Al fine di migliorare l'efficienza di FRET esperimenti basati FACS, cancelli appropriati devono essere impostati (Figura 3). Il cancello P1 esclude detriti cellulari e la porta P2 rimuove duine dall'analisi. Successivamente, l'analisi è limitata a citrino (emozionato con 488 laser) e ceruleo (emozionato con 405 laser) cellule positive per cancello 3. Infine, la porta P4 rappresenta la percentuale di cellule con un / rapporto di emissione ceruleo alto citrino (usando eccitazione del ceruleo con 405 nm laser). Per ciascun campione, almeno 10.000 cellule che rientravano gate 3 sono stati misurati.
Successivamente, a base di citometria a flusso FACS FRET è stato utilizzato per calcolare un aumento delle FRET nelle cellule viventi dopo 30 minuti di incubazione con TCDCA e GW4064. Le cellule non trattate U2OS esprimono NucleoBAS mostrato <5% di cellule porta P4 (citrino / ccellule erulean-alta). In assenza di trasportatori di acidi biliari, una percentuale simile è stata osservata in 30 mM TCDCA cellule trattate (Figura 4 A). Al contrario, NucleoBAS cellule co-esprimono, NTCP e OSTαβ fatto mostrano una maggiore quantità di citrino / ceruleo-alte cellule di circa 38%. Dopo l'aggiunta di 10 mM GW4064, quasi il 90% delle cellule erano citrino / ceruleo-alta indipendentemente espressione di OSTαβ o NTCP (Figura 4 B). I dati possono essere presentati in grafici a barre (cellule% in porta 4, la popolazione 4) (Figura 4 C, D) o come istogrammi di popolazione di rapporto citrino-ceruleo (Figura 4 E, F).
FIGURA 1. Progettazione della Bile Acid sensore (BAS). (A) rappresentazione strutturale del modo di azione di una geneticamente codificato Bile Acid sensore. Si compone di un fluoroforo donatore (ceruleo) e un accettore fluoroforo (citrino) collegato tramite il FXR-LBD e fuso con una FXR-cofattore peptide (LXXLL motivo). (B) architettura di dominio schematica delle BAS. I / V224L mutazioni fluoroforo Q204F promuovono la formazione delle interazioni intramolecolari tra ceruleo e citrino. Il costrutto NucleoBAS contiene un segnale di localizzazione nucleare c-terminale (NLS) e quindi si accumula nel nucleo, mentre il costrutto CytoBAS priva di qualsiasi sequenza di targeting e quindi mostra la localizzazione citosolica. (C) esperimento FRET basato confocale-Rappresentante con BAS come strumento per monitorare il trasporto degli acidi biliari coniugati. Nessun cambiamento in citrino / rapporto ceruleo si osserva dopo 30 micron TCDCA Inoltre nelle cellule solo expressing NucleoBAS. Quando è stato aggiunto 5 micron GW4064, è stato osservato un forte aumento citrino / Rapporto ceruleo. (D) di importazione TCDCA (30 mM) comporta una notevole attivazione del sensore in cellule co-trasfettate NTCP e OSTαβ. GW4064 (5 mM) Trattamento successivo porta ad un ulteriore aumento citrino / rapporto ceruleo. I risultati sono espressi come media ± SD, n = 6 singole celle. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Localizzazione FRET-BAS costrutto in cellule viventi. Immagini microscopio confocale di cellule U2OS transfettate con CytoBAS (A) o NucleoBAS (B). (C), le cellule U2OS co-transfected con NucleoBAS e NTCP-mKate2. La barra della scala rappresenta 10 micron. (D - F) Serie temporali di cellule trasfettate NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV. (D) GW4064 attiva FXR (aumento 525/450 rapporto nm), ma non TGR5. (E) TCDCA attiva TGR5 sulla membrana plasmatica (525/450 diminuito rapporto nm), ma non è in grado di entrare nella cellula per attivare FXR nel nucleo. (F) CDCA attiva TGR5 sulla membrana plasmatica, nonché FXR nel nucleo (aumento del rapporto di 525/450 nm nel nucleo, è diminuito nel citoplasma). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Citometria a flusso gating parameters. (A) Il P 1 cancello in / FSC Una finestra SSC-A viene utilizzato per escludere le cellule morte. (B) Nel FSC-H / FSC Una finestra, la porta P2 è disegnato per eliminare gli eventi doppietto di analisi. (C) Nel citrino sono selezionati (525/20 nm) / Cerulean (450/40 nm) finestra, NucleoBAS (e CytoBAS) cellule positive (Porta P3). (D) Infine, nella citrino (525/20 nm) / Cerulean (450/40 nm) finestra, la porta P4 contiene citrino / ceruleo-alti cellule dell'esperimento FACS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Figura 4. Esperimento rappresentativo FACS misura trasporto degli acidi biliari con NucleoBAS. (A >, B) FACS-trame che mostrano la quantità di citrino / NucleoBAS-esprimono ceruleo-alti viventi cellule U2OS (A) e le cellule U2OS co-esprimono NucleoBAS, OSTαβ e NTCP (B) dopo il trattamento con il tampone di controllo (a sinistra), 30 micron TCDCA (al centro) o 10 micron GW4064 (a destra). (C, D) Grafico a barre che mostra la percentuale di cellule / cerulee-alta citrino dopo 30 minuti di incubazione con TCDCA o GW4064 in cellule che esprimono U2OS NucleoBAS e co-trasfettate con (D) o senza (C) OSTαβ e NTCP. (E, F) Istogramma mostra la distribuzione del citrino / rapporto ceruleo in una popolazione di cellule che esprimono U2OS NucleoBAS con o senza OSTαβ e NTCP dopo 30 minuti di incubazione con TCDCA (giallo), GW4064 (rosso) o buffer di controllo (blu). Tutte le condizioni sono stati misurati tre volte. Barre rappresentano valori medi + deviazione standard (DS) (n = 3).TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1:. Modello BAS generale Cliccate qui per scaricare il file.
File supplementare. 2: Modello BAS Zeiss Leica importati dati Cliccate qui per scaricare il file.
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Discussion
Presentiamo qui un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un romanzo geneticamente codificato sensore acido biliare capace di monitorare le dinamiche spazio-temporali di trasporto degli acidi biliari in cellule viventi. Questo biosensore è costituito da proteine fluorescenti cerulee e citrino che sono fusi per FXR-LBD, formando così un sensore acido biliare basato FRET-(BAS).
Bile Acid sensore è relativamente semplice e conveniente in uso quando si ha esperienza di base con colture cellulari e FACS o (confocale) microscopia. Tuttavia, alcuni aspetti potrebbero richiedere qualche risoluzione dei problemi. Quando si utilizza il sensore acido biliare in combinazione con trasportatori degli acidi biliari, si raccomanda di cellule in coltura in terreno con siero carbone filtrata. Carbone riduce ulteriormente i livelli di acidi biliari per adsorbimento dal siero. Soprattutto in presenza di importatori come NTCP, questo è fondamentale per evitare la saturazione del sensore durante la coltura, poiché questa è la causa più comune di un sensore insensibiledurante gli esperimenti. Pertanto, un altro sensore è stato creato (NucleoBAS N354K / I372V) contenente mutazioni alterano la sensibilità per acidi biliari, la creazione di una gamma dinamica più ampia 8. Per definire se il sensore è già saturo, il / rapporto di ceruleo citrino può essere paragonato al rapporto in cellule di controllo non esprimono alcun trasportatori degli acidi biliari, dal momento che tali cellule sono presume che bassi livelli di acidi biliari intracellulari. In alternativa, la microscopia imaging di fluorescenza-vita (FLIM) misurazioni possono essere eseguite per indagare FRET in maniera intensità indipendente 12. Questa tecnica va oltre lo scopo di questo articolo, e richiede attrezzature più specializzate. Altre ragioni per un sensore insensibile includono l'uso di cellule che sono auto-fluorescente e / o hanno perso NucleoBAS espressione. Da segnalare, fluttuazioni di intensità del ceruleo e citrino (per esempio a causa di spostamenti focali) durante l'esperimento possono oscurare la visualizzazione diretta di FRET modifiche durante l'imaging, mentrela natura raziometrica del sensore consente ancora monitoraggio delle dinamiche acidi biliari. Spesso variazioni di intensità assolute sono modeste per i singoli fluorofori dopo l'aggiunta di leganti FXR, mentre l'aumento del rapporto è evidente.
Per l'analisi FRET in cellule trasfettate con il sensore BAS, dovrebbero essere selezionati appropriata luce laser e filtri. L'incremento di intensità citrino durante FRET deve essere misurato con il laser con emissioni monitorate oltre 450-520 (ceruleo) e 520-580 (citrino) viola diodo (405 nm). Un aspetto importante prendere in considerazione è la sensibilità del sensore di photobleaching. Quando l'intensità di uno o entrambi i fluorofori diminuisce lentamente nel tempo senza aggiunta di leganti, indica spesso photobleaching. Questo fenomeno si verifica soprattutto quando la potenza del laser è troppo alta. Per evitare questo effetto indesiderato, la potenza laser non deve superare il 5% di tutta la potenza e le cellule devono essere tenuti al buio per quanto possibile. Limitare ilil tempo per cercare le cellule giuste. Fluttuazioni intensità di fluorescenza possono essere causate da deriva focale l'asse z. Per contrastare questo, la dimensione del foro stenopeico può essere aumentato ed è opportuno elaborare ROI non molto vicino al perimetro delle cellule.
Il sensore FRET per acidi biliari è stato testato in più tipi di cellule (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK e cellule HEK293T) che possono essere transfettate e hanno un fenotipo stabile. Tuttavia, le cellule primarie e differenziate quali epatociti sono difficili da trasfettare e mantenere stabile in termini di caratteristiche. Trasduzione virale può aiutare con difficili da trasfezione cellule (costruire disponibile su richiesta). Attualmente stiamo generando una linea di mouse per consentire l'uso del sensore in cellule primarie appena isolate che rapidamente dedifferentiate sull'isolamento.
Per eseguire l'esperimento descritto confocale, è indispensabile che la linea cellulare selezionata è aderente ad una piastra di coltura e cresce in un SIstrato di cellule ngle. Tuttavia, le cellule che crescono in sospensione, o cellule aderenti che può essere tripsinizzate piuttosto facilmente, possono essere misurate con i FACS. Infine, si consiglia di selezionare una linea cellulare senza trasporto degli acidi biliari endogena o sintesi quando si analizza un percorso specifico di trasporto. Cioè, quando si misura l'attività di alcune (mutanti) trasportatore proteine transfettate.
Il presentato geneticamente codificato BAS biosensore fluorescente è uno strumento prezioso per il monitoraggio singolo trasporto degli acidi biliari cellule vive. Il BAS contiene un FXR-LBD che viene attivato da una grande varietà di acidi biliari, permettendo imaging dinamiche subcellulari degli acidi biliari 8. Questo dà un grande vantaggio in relazione all'uso di altre tecniche. Per esempio, in saggi di luciferasi promotore-driven, il segnale luciferasi dipende dalla stabilità del reporter all'interno delle cellule, non supporta le informazioni subcellulare, e richiede la distruzione del campione
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
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- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
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- Meier, P. J., Stieger, B.
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
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