Introduction
Transfert Förster Resonance Energy (FRET) est largement utilisé pour acquérir une meilleure compréhension des fonctions cellulaires dans des cellules vivantes avec une résolution temporelle et spatiale 1. Dans FRET, de l'énergie à partir d'un fluorophore donneur excité est transférée à un fluorophore accepteur. L'efficacité de FRET dépend fortement de la distance entre le fluorophore donneur et l'accepteur et leur orientation et est donc une lecture sensible de changements conformationnels qui influent sur les deux fluorophores. Ce phénomène est exploité pour générer les biocapteurs à base de FRET pour l'imagerie de petites molécules. Des changements dans la concentration peuvent être contrôlées comme des augmentations / diminutions dans le rapport de l'intensité d'émission de l'accepteur par rapport au fluorophore donneur 2. Par exemple, les biocapteurs de calcium à base de FRET permettent pour la détection rapide et stable des concentrations de calcium libres dans les cellules 3 vivre. Autres avantages de biocapteurs basés-FRET sont l'imagerie dans les cellules de vie simples, théritier non-invasivité, leur capacité à être ciblée sur différents types de cellules et compartiments cellulaires 4.
De nombreux aspects de la dynamique des acides biliaires intracellulaire sont encore mal compris. Par exemple, on sait peu sur le mécanisme sous-jacent de la réglementation du transport des acides biliaires conjuguée et non conjuguée. Les techniques existantes pour surveiller ce transport font principalement l'utilisation de journalistes basée luciférase, les acides biliaires, radiomarqués ou fluorescentes analogues des acides biliaires. Ce dernier nécessite une modification des acides biliaires, qui pourrait affecter leurs propriétés. Reporters luciférase ont une mauvaise résolution temporelle. En outre, ces techniques se traduisent par une perte de l'échantillon et ne sont pas applicables pour l'imagerie dans des cellules individuelles. Par conséquent, il serait avantageux d'utiliser des méthodes qui permettent l'imagerie cellulaire unique en direct de l'activité de transport utilisant les biocapteurs FRET, d'autant qu'il comprend l'avantage de la détection ratiométrique 5, 6. Bien que des variantes de CFP / YFP forme la plus fréquemment utilisée paires FRET, de nouvelles stratégies en utilisant Morange et mCherry portant des mutations auto-association-induisant ont conduit à une expansion de la boîte à outils FRET avec de nouveaux capteurs, y compris un capteur d'acide biliaire décalée vers le rouge 7.
Nous avons déjà créé un FRET capteur génétiquement codé bile acide (BAS), qui se compose d'un fluorophore donneur (cerulean) et un fluorophore accepteur (citrine) qui sont fusionnés avec le récepteur de farnésoïde X (FXR) un domaine de liaison de ligand (FXR LBD) et un peptide contenant un motif LXXLL 8. Ce peptide associe à la FXR LBD d'une manière dépendante de l'acide biliaire. Lors de l'activation de FXR, la distance entre citrine et céruléen va modifier en raison d'un changement de conformation. Dans les lignées cellulaires de mammifères, des résultats d'activation de FXR à une augmentation clairement détectable dans la citrine / rapport céruléen, tandis que le capteur purifiée travaille dans la direction opposée et conduit à un ratio de FRET diminué lors de l'activation de FXR. Ce capteur (CytoBAS)permet la surveillance de la dynamique cytosoliques de l'acide biliaire. Par addition carboxy-terminale de motifs de ciblage subcellulaire, la construction d'BAS peut être ciblé vers le noyau (NucleoBAS) et les peroxysomes (PeroxiBAS), ce qui permet des mesures de concentrations d'acides biliaires dans différents compartiments cellulaires. Bien que l'ajout du motif de ciblage des peroxysomes ne porte pas atteinte à sa réactivité aux acides biliaires, cellules perméables FXR-ligands n'a pas induit de changements de FRET PeroxiBAS intérieur peroxysomes 8. Comme la nature de cette différence est inconnue, le protocole ci-dessous se concentre sur CytoBAS et NucleoBAS.
L'utilisation de ce capteur de FRET codées génétiquement a été récemment démontrée dans des cellules contenant les transporteurs hépatique des acides biliaires Na + polypeptide / taurocholate co-transport (PNT) et de soluté organique transporteur alpha / bêta (8) OSTαβ. NTCP est l'importateur hépatique de l'acide biliaire principale et OSTαβ est une bile intestinale basolatéraletransporteur d'acide qui peuvent fonctionner à la fois comme un importateur et exportateur dépend de la concentration gradient de l'acide biliaire électrochimique 9, 10. Des données récentes ont montré que, lors du transport des acides biliaires par PNAT et / ou OSTαβ, les réponses robustes et rapides dans FRET rapport à la suite de l'interaction ligand-FXR-LBD peuvent être observées.
Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour les méthodes pour mesurer FRET telles que l'analyse microscopique confocale de fluorescence et de tri des cellules activées (FACS), soulignons étapes critiques, résoudre les problèmes potentiels et de discuter des méthodes alternatives. L'utilisation de ce capteur de FRET génétiquement codé, l'interaction de l'acide biliaire avec FXR-LBD peut être quantifié et surveillé directement dans les cellules vivantes et fournit un procédé simple et rapide de visualiser la dynamique et le transport de l'acide biliaire en temps réel. Des plasmides d'expression de mammifères codant pour CytoBAS NucleoBAS et sont disponibles commercialement. Par conséquent, ce biocapteur peut en outre contribuer à lacompréhension des transporteurs d'acides biliaires ou des composés qui activent FXR et fournissent une connaissance plus approfondie de la biologie de l'acide biliaire et de signalisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transfection transitoire
Note: CytoBAS et NucleoBAS (S'il vous plaît voir tableau des matériaux) sont utilisés avec succès dans plusieurs types de cellules, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK et des cellules HEK293T). La principale exigence pour utiliser le capteur est qu'il doit être exprimé, ce qui nécessite de l'ADN codant pour entrer dans la cellule.
- Récolte de cellules à partir d'une confluence de 80% de 25 cm 2 flacon. Diluer les cellules dans du milieu de culture complet convenant à la ligne spécifique de cellules (10% de FBS, 1% de L-glutamine, 1% de pen / strep à cellules Huh7 et U2OS).
- Cellules de la plaque à la densité désirée dans un 8 bien chambré couvercle en verre stérile (0,8 cm 2). Objectif pour une sous-confluentes (60-80% de confluence) couche de cellules sur le jour de l'expérience, bien que cela ne soit pas essentiel.
- Ajouter milieu de culture complet jusqu'à un volume final de 400 ul par puits. Laisser les cellules se fixer pendant 24 h.
- Préparer le mélange de transfection dans un tube stérile en ajoutant 0,5 pg de NucleoBASou CytoBAS ADN à 100 ul de milieu de culture (sérum / antibiotique libre). Vortex bien. Ajouter un réactif de transfection et mélanger au vortex. Réactifs de transfection qui donnent une efficacité optimale sont de type cellulaire dépendante et peuvent nécessiter des essais préalables.
- Par exemple, utiliser 2,5 pi de 1 mg / ml polyéthylènimine (PEI) et incuber l'ADN / PEI mélanger pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange de transfection dans des gouttelettes vers les cellules et mélanger en agitant la plaque bien à la main. Ajouter 100 pi du mélange pour un puits de ~ 9,6 cm 2. Utiliser 10 ul du mélange de transfection pour des chambres de formation d'image individuelles pour les cellules transfectées de manière transitoire.
Note: Après 24-48 heures, les cellules expriment le capteur d'acide biliaire et peuvent être utilisés pour les expériences.
2. Transfection stable
- Récolte de cellules à partir d'une confluence de 80% de 25 cm 2 flacon. Diluer culot dans du milieu de culture complet approprié pour la lignée cellulaire spécifique (10% S bovin fœtalErum, 1% de L-glutamine, 1% de pen / strep à cellules U2OS et Huh7) à une concentration de 150.000 cellules par ml et ajouter environ 300 000 cellules par puits dans une plaque de culture à 6 puits (2 volumes ml final).
- Laisser les cellules se fixer pendant 24 h.
- Préparer le mélange de transfection dans un tube stérile, en ajoutant 0,5 pg de CytoBAS ou NucleoBAS ADN (S'il vous plaît voir tableau des matériaux) à 100 pi de milieu de culture (sérum / sans antibiotique). Vortex bien. Ajouter un réactif de transfection et mélanger au vortex.
- Par exemple, utiliser 2,5 pi de 1 mg / ml polyéthylènimine (PEI) et incuber l'ADN / PEI mélanger pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 100 pi du mélange de transfection dans des gouttelettes vers les cellules et mélanger en agitant la plaque bien à la main. Toujours inclure un contrôle non transfectées lors de la création d'une lignée cellulaire stable.
- Cultiver des cellules O / N à 37 ° C, 5% CO 2.
- Trypsiniser les cellules selon le protocole du fabricant (Incuber les cellules à 37 ° C wvec 1,5 ml préchauffé trypsine par 25 cm 2 culture cellulaire) et de spin-les à 250 xg à température ambiante pendant 5 min. Éliminer les cellules et remettre en suspension dans le surnageant 13 ml de milieu de culture complet. Diviser les cellules sur différentes boîtes de culture de diamètre 10 cm: 0,5 ml (faible densité), 1,5 ml (densité moyenne), et 4,5 ml (haute densité). Faites de même pour 6,5 ml restants.
- Ajouter milieu de culture jusqu'à un volume final de 10 ml. Pour U2OS cellules, en utilisant 800 ug / ml de G418 pour les plasmides avec la cassette de résistance à la néomycine comme les CytoBAS NucleoBAS et construit pour sélectionner les cellules positives. Cette concentration est de type cellulaire dépendante et peut être déterminée par la sélection de la plus faible antibiotique (G418) où concentration cellules non transfectées sont mortes dans les 2 à 10 jours (800 ug / ml de G418 pour les cellules U2OS).
- Actualiser le milieu de culture avec l'antibiotique approprié (G418) tous les 72 heures jusqu'à ce que les cellules non transfectées sont morts.
- Examiner la plaque de la culture sous le microscope avec un objectif 20X pourcolonies positives (de fluorescence peuvent être contrôlés en utilisant la plupart des jeux de filtres utilisés pour le vert, cyan ou fluorescence jaune).
- Marquer les colonies positives qui se trouvent isolés des autres colonies avec un stylo sur le fond extérieur de la boîte de culture.
- Laver la plaque deux fois avec du tampon phosphate salin (PBS) et on aspirer. Prenez environ 15 cylindres de clonage stériles et les tremper dans de silicone stérile. Appliquez-les autour des colonies sélectionnées en appuyant légèrement contre le boîte de Pétri et assurez-vous que pas plus d'une colonie est inclus dans l'anneau de clonage.
- Pipeter 20 ul de trypsine préchauffé (1x, 0,25%) dans le cylindre de clonage et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que la plupart des cellules ont arrondi (observe avec un microscope).
- Ajouter 150 ul de milieu de culture avec sérum et l'antibiotique approprié (10% de FBS et 800 ug / ml de G418 pour les cellules U2OS et Huh7) dans le cylindre de clonage et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour remettre en suspension les cellules et les transférer à un 96-ainsi plaque. Actualisez milieu après 4-24 h et permettent aux cellules de croître confluentes dans les prochains jours (37 ° C, 5% de CO 2 pour les cellules U2OS et Huh7).
- Actualisez moyenne avec des antibiotiques tous les 3 ou 4 jours. Lorsque les cellules confluentes ont grandi, les transférer sur une plaque bien plus grande. Répétez cette étape jusqu'à ce que la culture est assez grand pour les expériences. Cryopreserve certains flacons pour la sauvegarde. Milieu de cryoconservation se compose de 20% de FBS et 20% de DMSO dans les médias (DMEM) sans suppléments.
Remarque: Maintenant, la lignée cellulaire est monoclonal considéré et stable pour exprimer le capteur Bile Acid. La moitié de la concentration de l'antibiotique G418 (400 ug / ml) est maintenant suffisante pour maintenir l'expression dans la lignée cellulaire stable.
3. Lentiviral transduction
Remarque: Certaines lignées de cellules sont considérés comme difficiles à transfecter par des procédés plus traditionnels tels que le procédé de la polyéthylèneimine (PEI). Transduction virale des cellules est un moyen efficace outil alternatif fou d'un gène-livraison et l'expression du transgène stable.
- Récolte de cellules à partir d'une confluence de 80% de 25 cm 2 flacon. Diluer les cellules dans du milieu de culture complet approprié pour la lignée cellulaire spécifique (10% de FBS, 1% de L-glutamine, 1% de pen / strep à cellules U2OS et Huh7) et ajouter environ 200 000 cellules par puits dans une plaque de culture à 6 puits.
- Ajouter milieu de culture jusqu'à un volume final de 2 ml par puits. Laisser les cellules se fixer pendant 24 h.
- Effectuer transductions virales par les cellules d'incubation 4-6 h avec 500 CytoBAS ul contenant lentivirus moyen (disponible sur demande) rempli d'un montant total de 1 ml de milieu de culture complet contenant 10 pg / ml diéthylaminoéthyle (DEAE) -dextrane ou d'une autre lentivirus transduction activateur. Ne pas oublier d'inclure un puits avec des cellules de contrôle non transduites.
- Retirer le milieu et ajouter 2 ml de milieu de culture complet contenant l'antibiotique désiré (500 pg / ml à l'hygromycine). Utilisez une construction lentiviral pour CytoBAS transduction qui fournissents résistance à l'hygromycine à des cellules. Cultiver les cellules dans des conditions souhaitées.
- Actualiser moyen de (500 ug / ml d'hygromycine) antibiotique tous les 3 jours et diviser les cellules confluentes à 80% lorsque, jusqu'à ce que toutes les cellules témoins négatifs sont morts (prend environ 1-2 semaines pour la plupart des lignées cellulaires). La lignée cellulaire est maintenant considéré comme stable pour exprimer le capteur acides biliaires.
- Vous pouvez également utiliser les cellules pour des expériences 1-3 jours après transduction virale. Comme le virus vivant peut être présent, ceci nécessite un équipement FRET-lecture dans les chambres avec le niveau de sécurité approprié.
- En variante, pour l'isolement rapide de lignées cellulaires stables, effectuer le tri de cellules activé par fluorescence (FACS).
- Récolte de cellules à partir d'une confluence de 160 cm 2 flacon.
- Diluer les cellules dans un milieu de culture Leibovitz L-15 (moyennes) avec <5% de sérum à une concentration maximale de 5 x 10 6 cellules par ml
- Pour la collecte de cellules triées, remplissez tubes FACS avec 1 ml de milieu de collecte (L-15 moyenne + 1,5% stylo / angine, 1% de L-surabondance et 20% de sérum).
- Trier les cellules pour citrine (520-580 nm) ou azurée (450-520 nm), avec 405 excités laser.
- Après le tri d'environ 500 000 cellules, centrifuger les cellules (5 minutes, 250 x g) et les remettre en suspension dans 5 ml de milieu de culture complet normale (10% de FBS, 250 ug / ml d'hygromycine pour les cellules U2OS et Huh7 CytoBAS) et la plaque-les dans une culture de T25 ballon. Cultiver des cellules dans des conditions souhaitées (37 ° C, 5% CO 2 pour les cellules Huh7 et U2OS).
4. Imagerie de cellules vivantes du capteur acides biliaires
Remarque: Les cellules contenant les transporteurs des acides biliaires peuvent être cultivées dans un milieu avec sérum de 1 à 10% de charbon par filtration qui élimine les composés lipophiles. Sérum normal contient souvent des acides biliaires qui pourraient conduire à l'accumulation de l'acide biliaire et intracellulaire de la saturation du capteur acides biliaires.
- Mesures FRET utilisant le microscope confocal
- Plaque les cellules de manière stable ou transieexprimant ntly le capteur à la densité désirée dans un 8 ainsi lamelle fond chambre diaporama stérile (0,8 cm 2). Cultiver les cellules dans du milieu de culture complet (avec du sérum de charbon par filtration), de sorte que le jour de l'expérience, une confluence d'environ 60 à 70% est.
- Laver les cellules adhérentes dans la chambre diapositive une fois avec 200 pi 1x L-15 du milieu de culture de PBS ou Leibovitz.
- Aspirer et remplacer par 300 pi L-15 milieu de culture de Leibovitz sorte que pas de CO 2 de contrôle est nécessaire.
Note: DMEM sans rouge de phénol peut être utilisé aussi bien mais nécessite de CO 2 des conditions tamponnées. Les spectacles de capteurs d'acide biliaire (un peu) sensibilité au pH de sorte visent à maintenir le pH constant au cours de la collecte de données. - Diluer les composés à utiliser dans l'expérience d'imagerie confocale également à L-15 milieu de culture. Prenez en compte que lors de l'imagerie, des quantités relativement importantes de liquide dans les chambres doivent être ajoutés pour obtenir un mélange rapide de l'échantillon (50-100 ul),alors assurez solutions 3-5x.
- Démarrez le logiciel d'imagerie d'un microscope confocal avec une chambre C d'incubation de 37 ° et tourner sur le laser violet de 405 nm. Mettre une goutte d'huile d'immersion sur l'objectif et placez le 8-chambre sur le dessus de celui-ci. Pour l'imagerie cellulaire unique de FRET, utiliser l'objectif de l'huile 63X. Le capteur a été utilisé avec succès à la température ambiante, mais le comportement des cellules peut être modifié.
- Définissez les paramètres du microscope confocal correctement.
- Réglez le mode d'acquisition: xyt (imagerie time-lapse de simple plan focal).
- Acquérir des images toutes les 20 secondes pour permettre aux composés à ajouter entre les acquisitions sans pause l'expérience.
- Réglez gamme spectrale pour la détection d'émission: Cerulean: 450-520 nm; Citrine: 520-580 nm.
- Concentrez-vous sur la couche de cellules unique utilisant la lumière de transillumination. Commencez imagerie et d'ajuster la position z plus précisément. Régler le gain et l'offset pour chaque canal de distinguer le signal de fond pendant que restering bien en dessous de la saturation pour tous les pixels dans les cellules d'intérêt.
- Dessiner des cercles de définir la région d'intérêt (ROI). Sélectionnez les cellules qui montrent l'intensité de fluorescence similaire. Évitez les cellules qui diffèrent évidemment de la cellule de taille moyenne et la forme. Exposer les cellules à la lumière pendant un temps aussi court que possible afin de minimiser photoblanchiment du capteur. Il est conseillé de tirer ROI pas très près du périmètre de la cellule. Cette zone est la plus sensible aux changements d'intensité de fluorescence due à la dérive focale (cellules en mouvement dans la direction z) qui rend plus difficile de suivre l'évolution du ratio de fluorescence lors de l'expérience.
- Commencez mesures avec le microscope confocal. Attendez jusqu'à ce que la fluorescence céruléen et citrine est stable.
- Ajouter 50-100 ul acides biliaires ou d'autres composés à des points de temps choisis au cours de la mesure. Les quantités relativement élevées de liquide (un cinquième à un tiers du volume final) sont nécessaires pour mélanger les fluides ainsi (dans les 10 secondes) sans secouer / pipetting de haut en bas. Assurez-vous de ne pas toucher le bord de la chambre 8-bien avec la pointe de la pipette et ajouter le liquide lentement, de sorte que les cellules ne reçoivent pas de mise au point. Ne pas ajouter de nouveaux composés avant la phase de plateau est atteinte. Cela prend environ 200 secondes.
- Fin de chaque expérience, avec l'ajout de 100 ul GW4064, la concentration d'extrémité (dose de saturation du détecteur) de 5 à 10 uM et attendre jusqu'à ce que la fluorescence de la sonde est stable.
- Économisez de l'expérience et d'exporter les données dans un fichier .AVI.
- Ouvrir dans ImageJ deux fichiers AVI (canal 00, céruléen, le canal 01, citrine) en sélectionnant Plugins> Piles> Pile entrelacement. Alternativement, l'importation fichier confocale (par exemple, ou des fichiers .lif .lsm) directement dans l'image J en utilisant des plugins appropriés (disponibles à http://www.openmicroscopy.org) et passer à l'étape 4.1.14.
- Pour Stack 1: utiliser le canal 01 (citrine).
- Pour Stack 2: utiliser le canal 00 (céruléen).
- Cliquez sur Modifier> Sélection> Ajouterau gestionnaire, pour ouvrir la fenêtre du gestionnaire de ROI. Cochez la case "Afficher tous".
- Dessinez quelques régions d'intérêt (ROI) couvrant des cellules spécifiques avec l'outil de sélection ovale. Aussi attirer un cercle dans une zone à l'extérieur ou à l'intérieur des cellules une cellule qui ne reflète pas le capteur pour déterminer le signal de fond. Il est conseillé de tirer ROI pas très près du périmètre de la cellule dans des expériences lorsque des changements dans l'intensité de fluorescence due à la dérive focale (cellules en mouvement dans la direction z) ou la migration des cellules étaient évidents.
- Sélectionnez une cellule. Cliquez sur Plugins> Ratio Profiler. Cela se traduira par 3 écrans: RAW, rapport et Ratio_Profile. La fenêtre RAW montre l'augmentation de l'intensité de la citrine (ligne bleue) et une diminution de Cerulean (ligne rouge), si il est FRET. La fenêtre Rapport donne des informations sur le rapport citrine / céruléen, qui va augmenter avec une augmentation de FRET. La fenêtre Ratio_Profile donne le nombre réel d'intensité de fluorescence mesurée dans les deux canaux. Si microsface fichiers spécifiques configuration (par exemple, .lsm ou .lif lieu de .avi) fichiers sont utilisés l'ordre des chaînes peut être inversé.
- Copiez les données de la fenêtre Ratio_Profile dans le tableau joint en tant que données complémentaires. Faites de même pour toutes les autres cellules (et fond ROI).
Remarque: Dans la feuille de calcul en ligne, toutes les données est normalisée à la condition à laquelle l'activation de BAS maximale est attendue. Etant donné que l'activateur GW4064 est la plus puissante de FXR, le ratio de fluorescence après incubation avec un surplus de GW4064 prend la valeur 1. Il est donc important de mettre fin à toutes les expériences avec addition de GW4064. L'avantage de ceci est que les données ne dépend plus de l'intensité du laser ou le gain du détecteur et des expériences à des jours différents peuvent être comparés plus facilement. En outre, dans le graphique inférieur de la feuille de calcul, une moyenne mobile peut être utilisée pour lisser les courbes de bruit expérimental. Cependant, ne pas utiliser ce graphique lors de l'analyse des données cinétiques, depuis le Avera courseGE également des réponses cinétiques rapides lisses.
- Mesures FRET utilisant cellulaire activé par fluorescence (FACS)
- Diluer les composés à l'essai FACS en tampon FACS stériles absorption (0,3 mM d'EDTA, 0,5% de BSA, 0,01% de NaN3 et 10 mM de D-glucose).
- Récolte des cellules provenant d'un flacon de 2 cm de culture de cellules confluentes à 80% T-160 en utilisant de l'EDTA 5 mM dans du PBS. Centrifuger les cellules à 250 g pendant 5 min. Laver 2x culot cellulaire dans 5 ml de tampon FACS absorption à la température ambiante.
- Compter les cellules à l'aide du compteur Coulter ou une chambre de comptage.
- Diluer culot dans un tampon FACS d'absorption à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml. Pipette de haut et vers le bas pour créer une suspension homogène de cellules individuelles. Si les cellules sont difficiles à désagréger, mettre les échantillons à travers un tamis cellulaire avant le tri pour minimiser les sabots de buses.
- Pipet 200 cellules par FACS ul tube et les protéger de la lumière.
- Ajouter la concentration désirée du composé (par exemple,, Les acides biliaires, les ligands FXR synthétiques, les inhibiteurs de transporteur). Vortex. Incuber pendant 20-30 min à température ambiante tout en secouant (dans l'obscurité).
- Pendant ce temps, commencer les FACS (les lasers ont besoin de temps pour se réchauffer).
- Réglez la cytométrie de flux paramètres de déclenchement pour l'expérience (voir Figure 3):
- Chargez autour de 100,000-200,000 NucleoBAS ou CytoBAS transfectées cellules pour déterminer les portes.
- Régler d'abord les tensions FSC et SSC pour tracer les cellules dans le centre de l'intrigue.
- En utilisant le laser violet, ajuster le céruléen (450/40 nm) valeur de tension et citrine (525/20 nm) de tension et de veiller à ce que tous les NucleoBAS ou CytoBAS cellules positives sont tracées dans le nuage de points.
- Définissez les portes correctes (Porte P1 à P4 Porte), voir la figure 4.
- Utilisez porte P1 à exclure les cellules mortes, habituellement affichées dans le coin inférieur gauche en sélectionnant la population principale dans le milieu de la SSC-A / FSC Une parcelle.
- Utilisez porte P2 dansFSC-H / FSC Une fenêtre pour supprimer duolets de l'analyse. Les cellules individuelles sont présentés sur une ligne diagonale plus de doublets.
- Porte P3 dans la citrine (525/20 nm) / céruléen (450/40 nm) fenêtre peut être utilisée pour sélectionner les NucleoBAS / CytoBAS cellules positives, par gating citrine et cellules haute bleu azur, une population affiché en diagonale dans le coin supérieur droit de l'intrigue.
- Dessinez porte P4 en haut à gauche de la population, aussi près que possible et assurez-vous que pas plus de 5% des cellules entrent dans cette porte.
- Chargez certaines cellules non transfectées (pas d'expression de CytoBAS ou NucleoBAS) pour déterminer l'auto-fluorescence. La population non transfectées ne peut être situé dans la porte P3. Réglez porte P3 lorsque nécessaire pour exclure les cellules auto-fluorescent.
- Vortexer les échantillons avant de placer les tubes dans le FACS. Pour chaque échantillon, mesurer au moins 10.000 cellules porte P3.
Remarque: La Hiérarchie fenêtre population donne le nombre d'événementsl'affichage de chaque porte et la porte de% parent. En porte 4, l'% de la société mère déclare cellules avec une citrine / rapport céruléen augmenté en pourcentage de tous les NucleoBAS cellules positives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le capteur FRET-BAS présenté est basé sur le domaine de FXR (LBD-FXR) de liaison de ligand attaché à deux fluorophores citrine et bleu azur) et un motif LXXLL. Ce capteur permet les enquêtes sur le transport des acides biliaires dans les cellules avec une résolution spatiale et temporelle (figure 1 A) vivre. Des mutations dans cerulean citrin et ont été appliquées à promouvoir la formation du complexe intramoléculaire (figure 1 B). Les acides biliaires et d'autres ligands se lient à FXR FXR et de modifier ainsi la distance entre citrin cerulean et par un changement de conformation. Dans les cellules de mammifères vivants, il en résulte une augmentation de l'efficacité de FRET (augmentation de citrin, diminution cerulean) (figure 1 C, 1 D). Au cours d'une expérience de FRET quantitative de cellules vivantes basé sur l'intensité avec le microscope confocal, it On a observé que l'acide taurochénodésoxycholique (TCDCA) traité à (30 pm) cellules U2OS exprimant NucleoBAS manquant transporteurs d'acides biliaires ne présentent pas de changements dans le FRET, tandis que la citrine / rapport céruléen moyen a augmenté remarquablement après le traitement avec le GW4064 (5 M) (Figure 1 C). En revanche, U2OS cellules co-exprimant NucleoBAS, NTCP et OSTαβ ne montrent une nette augmentation de citrine / rapport céruléen après addition de TCDCA, et une augmentation encore plus grande dans un rapport après l'addition de GW4064 (figure 1 D). Ceci démontre que TCDCA est incapable de passer à travers la membrane cellulaire et ne nécessite transporteurs spécifiques à pénétrer dans la cellule.
Localisation cellulaire de la sonde est déterminée par la présence de signaux de localisation spécifiques. NucleoBAS est ciblée vers le noyau par le signal de localisation nucléaire (Figure <strong> 2 B), tandis que CytoBAS ne contient pas de signal de localisation et donc reste dans le cytosol (figure 2 A). Le biocapteur peut également être combiné avec d'autres imagerie de protéines fluorescentes, permettant des mesures de l'expression de protéine / localisation et l'activation de FXR dans la même cellule. Par exemple, la figure 2 montre des cellules C U2OS co-transfectées avec NucleoBAS et NTCP-mKate2. En outre, le capteur peut également être combiné avec d'autres capteurs pour l'imagerie subcellulaire de plus d'un paramètre simultanément. Par exemple, NucleoBAS a été exprimée avec TGR5 (clone EST IMAGE # 5221127) et un capteur AMPc cytosolique (T Epac VV) 11 pour mesurer TGR5 et l'activation de FXR dans la même cellule dans le même temps. Lors de la liaison TGR5, les taux d'AMPc augmentés dans le cytosol qui a été détecté par le capteur de cAMP, tandis que l'activation de FXR dans le noyau était de visualized simultanément. Figures 2D-F montrer une série chronologique composé de 6 images confocales des cellules de NucleoBAS-TGR5- T Epac après le traitement avec le GW4064 (5 uM) (figure 2 D), avec TCDCA (10 pM) (figure 2 E) ou avec de l'acide chénodésoxycholique (CDCA) (10 M) (Figure 2 F) à t = 0. La couleur verte représente les régions où le rapport d'émission 525/450 nm est diminué (représentant AMPc élévation) et la couleur rose représente une augmentation du taux d'émission (activation de FXR), par rapport à les rapports au début de l'expérience.
En outre, la cytométrie en flux peut être utilisé pour cribler un ensemble de cellules au niveau d'une cellule unique ou en tant que criblage à haut débit sur l'ensemble de la population. U2OS cellules exprimant NucleoBAS étaient EXCITed avec un laser violet de 405 nm et la fluorescence a été recueilli dans la gamme de 450/40 pour la gamme céruléen et 525/20 pour citrine. Afin d'améliorer l'efficacité des expériences de FRET à base de FACS, portes appropriées doivent être définis (figure 3). La porte P1 exclut les débris de cellules et la grille de P2 élimine les doublets de l'analyse. Ensuite, l'analyse se limite aux citrine (excité avec 488 laser) et céruléen (excité avec 405 laser) de cellules positives par la porte 3. Enfin, la porte P4 représente le pourcentage de cellules avec un rapport signal / bruit d'émission céruléen haute citrine (en utilisant une excitation de céruléen avec 405 nm laser). Pour chaque échantillon, au moins 10.000 cellules qui relevaient de la porte 3 ont été mesurées.
Par la suite, la cytométrie en flux FACS à base de FRET a été utilisé pour calculer une augmentation de FRET dans des cellules vivantes après 30 minutes d'incubation avec TCDCA et GW4064. Cellules U2OS traités Non exprimant NucleoBAS montré <5% des cellules dans la porte P4 (citrine / ccellules erulean-haut). En l'absence de transporteurs de l'acide biliaire, un pourcentage similaire a été observée dans les 30 cellules traitées TCDCA uM (Figure 4 A). En revanche, NucleoBAS cellules co-exprimant, NTCP et OSTαβ ont fait apparaître une quantité accrue de citrine cellules / céruléen-élevés de l'ordre de 38%. Après addition de 10 uM GW4064, près de 90% des cellules étaient citrine / céruléen haute indépendamment de l'expression de OSTαβ ou NTCP (Figure 4 B). Les données peuvent être présentées sous forme de graphiques à barres (% des cellules dans la porte 4, population 4) (figure 4 C, D) ou sous forme d'histogrammes de la population de citrine-céruléen rapport (Figure 4 E, F).
Figure 1. Conception du capteur Bile Acid (BAS). (A) Représentation structurale du mode d'action d'un capteur d'acide biliaire génétiquement codé. Il se compose d'un fluorophore donneur (cerulean) et un fluorophore accepteur (citrine) lié par l'intermédiaire du FXR LBD-et fusionné à un peptide de cofacteur FXR (motif LXXLL). (B) de l'architecture de domaine schématique des BAS. Les Q204F / V224L mutations fluorophores favorisent la formation d'interactions moléculaires entre céruléen et citrine. Le produit d'assemblage NucleoBAS contient un signal de localisation nucléaire C-terminal (NLS) et accumule donc dans le noyau, alors que la construction est dépourvue de toute CytoBAS séquence de ciblage et montre la localisation cytosolique donc. (C) représentant expérience FRET à base confocale avec BAS comme un outil pour surveiller le transport de l'acide biliaire conjugué. Aucun changement dans citrine / rapport céruléen est observée après 30 uM plus de TCDCA dans les cellules que expRessing NucleoBAS. Quand on ajoute 5 uM GW4064, une citrine / rapport céruléen fortement augmenté a été observé. (D) l'importation de TCDCA (30 uM) se traduit par une activation considérable de la sonde dans les cellules co-transfectées PNLT et OSTαβ. Après GW4064 (5 M) traitement conduit à une nouvelle augmentation de citrine / rapport céruléen. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SD, n = 6 cellules individuelles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Lieu-BAS construction FRET dans des cellules vivantes. Images de microscope confocal de cellules transfectées avec CytoBAS U2OS (A) ou NucleoBAS (B). (C) des cellules U2OS co-transfected avec NucleoBAS et NTCP-mKate2. La barre d'échelle représente 10 um. (D - F) série Temps de cellules transfectées NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV. (D) GW4064 active FXR (augmentation du rapport 525/450 nm), mais pas TGR5. (E) TCDCA TGR5 active sur la membrane plasmatique (diminution du rapport 525/450 nm), mais est incapable de pénétrer dans la cellule à activer FXR dans le noyau. (F) CDCA active TGR5 sur la membrane plasmique ainsi que FXR dans le noyau (augmentation 525/450 rapport nm dans le noyau, diminué dans le cytoplasme). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. La cytométrie en flux déclenchement parameters. (A) Le P 1 porte dans le SSC-A / FSC Une fenêtre sont utilisés pour exclure les cellules mortes. (B) Dans le FSC-H / FSC Une fenêtre, la porte P2 est attirée sur éliminer les événements du doublet de l'analyse. (C) Dans la citrine (525/20 nm) / céruléen (450/40 nm) fenêtre, NucleoBAS (et CytoBAS) des cellules positives sont sélectionnées (Porte P3). (D) Enfin, dans la citrine (525/20 nm) / céruléen (450/40 nm) fenêtre, la porte P4 contient citrine cellules / céruléen-élevés de l'expérience FACS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Figure 4. Expérience représentative FACS mesurer le transport de l'acide biliaire en utilisant NucleoBAS. (A >, B) FACS-parcelles montrant la quantité de citrine / NucleoBAS exprimant vie céruléen-hautes cellules U2OS (A) et les cellules U2OS co-exprimant NucleoBAS, OSTαβ et NTCP (B) après le traitement avec le tampon de contrôle (à gauche), 30 pm TCDCA (milieu) ou 10 uM GW4064 (à droite). (C, D) Bar graphe montrant le pourcentage de citrine cellules / céruléen haute après 30 min d'incubation avec TCDCA ou GW4064 dans les cellules exprimant U2OS NucleoBAS et co-transfectées avec (D) ou sans (C) OSTαβ et PNLT. (E, F) histogramme montrant la répartition de la citrine / rapport céruléen dans une population de cellules U2OS exprimant NucleoBAS avec ou sans OSTαβ et NTCP après 30 min d'incubation avec TCDCA (jaune), GW4064 (rouge) ou tampon de commande (bleu). Toutes les conditions ont été mesurées à trois reprises. Les barres représentent les valeurs moyennes + déviation standard (SD) (n = 3).TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Fichier supplémentaire 1:. Modèle BAS générale S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2:. Modèle BAS Zeiss Leica données importées S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l'utilisation d'un capteur d'acide biliaire selon l'invention génétiquement codé capable de contrôler la dynamique spatio-temporelles de transport de l'acide biliaire dans des cellules vivantes. Ce biocapteur est constitué de protéines fluorescentes et céruléens citrine qui sont fusionnées à FXR LBD, en formant ainsi un capteur d'acide biliaire à base de FRET (BAS).
Le capteur acides biliaires est relativement simple et pratique à utiliser lorsque ayant une expérience de base avec la culture et la cellule ou FACS (confocale) microscopie. Cependant, certains aspects pourraient nécessiter des tirs d'ennuis. Lors de l'utilisation du capteur d'acide biliaire en association avec des transporteurs des acides biliaires, il est recommandé de cellules en culture dans un milieu avec du sérum de charbon par filtration. Charbon de bois réduit en outre les niveaux d'acides biliaires par adsorption à partir du sérum. Surtout en présence des importateurs tels que NTCP, ce qui est crucial pour éviter la saturation du capteur pendant la culture, car cela est la cause la plus fréquente d'un capteur insensibleau cours des expériences. Par conséquent, un autre capteur a été créé (NucleoBAS N354K / I372V) contenant mutations altérant la sensibilité pour les acides biliaires, la création d'une plus grande dynamique 8. Pour définir si le capteur est déjà saturé, la citrine / cerulean rapport peut être comparé au rapport dans les cellules témoins exprimant des transporteurs non de l'acide biliaire, étant donné que ces cellules sont supposés avoir des niveaux d'acides biliaires intracellulaires faibles. En variante, la microscopie d'imagerie par fluorescence à vie (FLIM) mesures peuvent être effectuées pour étudier FRET d'une manière indépendante de l'intensité 12. Cette technique est au-delà de la portée de ce document, et nécessite des équipements plus spécialisés. D'autres raisons pour un capteur insensible comprennent l'utilisation de cellules qui sont auto-fluorescent et / ou qui ont perdu NucleoBAS expression. Fait à noter, les fluctuations de l'intensité de céruléen et citrine (par exemple en raison de changements focaux) pendant l'expérience peuvent occulter la visualisation directe des changements FRET lors de l'imagerie, tandis quela nature ratiométrique du capteur permet encore la surveillance de la dynamique de l'acide biliaire. Souvent, les changements d'intensité absolus sont modestes pour les fluorophores individuelles lors de l'addition de ligands de FXR, tandis que l'augmentation du ratio est évident.
Pour l'analyse FRET dans des cellules transfectées avec le capteur de BAS, la lumière et les filtres de laser appropriés doivent être choisis. L'augmentation de l'intensité de citrine cours FRET doit être mesurée avec la diode laser violet (405 nm) avec des émissions surveillés sur 450-520 (céruléen) et 520-580 (citrine). Un aspect important à prendre en compte est la sensibilité du capteur photo-blanchiment. Lorsque l'intensité d'un ou deux fluorophores diminue lentement dans le temps sans addition de ligands, il indique souvent photoblanchiment. Ce phénomène se produit essentiellement lorsque la puissance du laser est trop élevée. Pour éviter cet effet indésirable, la puissance des lasers ne doit pas dépasser 5% de la pleine puissance et les cellules doivent être gardés dans l'obscurité autant que possible. Limitez lele temps de chercher les bonnes cellules. Les fluctuations de l'intensité de fluorescence peuvent aussi être causés par la dérive focal dans l'axe z. Pour contrer cela, la taille sténopé peut être augmentée et il est conseillé de tirer ROI pas très près du périmètre de la cellule.
Le capteur de FRET pour les acides biliaires a été testée dans plusieurs types de cellules (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK et des cellules HEK293T) qui peuvent être transfectées et ont un phénotype stable. Cependant, les cellules primaires et différenciées telles que les hépatocytes sont difficiles à transfecter et de maintenir stable en termes de caractéristiques. Transduction virale peut aider avec des cellules difficiles à transfecter (construire disponible sur demande). Nous sommes en train de générer une lignée de souris pour permettre l'utilisation du capteur dans des cellules primaires fraîchement isolées qui dédifférencient rapidement lors de l'isolement.
Pour réaliser l'expérience décrite confocale, il est impératif que la lignée cellulaire choisie est adhérente à une boîte de culture et se développe dans un SIcouche de cellules ngle. Cependant, les cellules qui se développent en suspension, ou les cellules adhérentes qui peuvent être traitées à la trypsine assez facilement, peuvent également être mesurées en utilisant le FACS. Enfin, il est conseillé de sélectionner une ligne de cellules sans transport de l'acide biliaire endogène ou la synthèse lors de l'analyse d'une voie de transport spécifique. Ie, lorsque l'on mesure l'activité de certains (mutantes) protéines transporteuses transfectées.
Codés génétiquement BAS biocapteur fluorescent présenté est un outil précieux pour le suivi en direct seul transport de l'acide biliaire cellulaire. Le BAS contient un FXR-LBD qui est activé par une grande variété d'acides biliaires, ce qui permet l'imagerie de la dynamique subcellulaires d'acides biliaires 8. On obtient ainsi un grand avantage par rapport à l'utilisation d'autres techniques. Par exemple, dans des essais de rapporteurs luciférase-promoteur entraîné, le signal de luciférase dépendant de la stabilité du rapporteur dans les cellules, ne supporte pas les informations subcellulaire, et nécessite la destruction de l'échantillon
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
- Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
- van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
- Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
- Meier, P. J., Stieger, B.
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).
