Introduction
Le facteur de transcription ubiquitaire et exprimé de façon constitutive interféron (IFN) Facteur de réglementation 3 (IRF3) est crucial pour la première ligne de défense contre les agents pathogènes principalement par l'induction d'IFNß, mais aussi grâce à l'induction de la chimiokine (CC motif) ligand 5 (CCL5 ) et de plusieurs protéines, y compris la protéine antivirale de l'IFN-induite avec tétratricopeptide répète IFIT1 / 2/3 de 1-3. Activation de IRF3 a été rapporté ci-après infection avec de nombreux virus, ou l'exposition à l'acide polyinosinique-polycytidylique (poly I: C) ou un lipopolysaccharide (LPS) 4. Surtout, les virus les plus étudiés ont développé des mécanismes pour échapper à la réponse de IRF3 médiation, et ainsi échapper à l'hôte de la défense immunitaire innée 5. Ainsi, le suivi de l'activation IRF3 est d'une grande importance pour comprendre les mécanismes moléculaires de la défense de l'hôte antivirale innée, mais aussi d'identifier la stratégie utilisée par les virus pour contrer cette réponse.
ent "> De nombreux rapports publiés fournissent cependant seule une analyse limitée de l'activation du IRF3 effectuée par la surveillance de l'induction du gène IRF3-cible (IFNB1 et IFIT1) et / ou de dosage de gène rapporteur de luciférase couplée à une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de Polyacrylamide à faible résolution de sodium (SDS- PAGE) analyse des IRF3. Cependant, de nombreuses études biochimiques, l'analyse du comportement des différents mutants IRF3 et l'élucidation de la structure cristalline de IRF3 6-11 ont contribué à établir que IRF3 est soumis à un ensemble complexe de modifications post-traductionnelles séquentielles par phosphorylation au plusieurs sites. L'ensemble de phosphorylation impliqué dans l'activation des IRF3 semble être dépendante de la stimulation et le plus probable sur le type cellulaire. Dans les cellules non infectées, IRF3 coexiste comme espèce non phosphorylés et hypophosphorylé contenant phosphoresidues, y compris Thr135 et Ser173, dans la 1 -198 aa région N-terminale 6,12-14. L'accumulation de cette hypophosphorylé form de IRF3 est induite par des inducteurs de stress, des facteurs de croissance et des agents endommageant l'ADN 6. La phosphorylation de résidus Ser / Thr dans la région C-terminale de IRF3 contenant le domaine de transactivation est déclenchée suite à l'activation par des virus, le poly I: C, ou le LPS dans un type de cellules de manière dépendante de 15 à 17. C-terminal phosphorylation de IRF3 implique pas moins de 7 sites de phosphoacceptor distincts organisés en deux groupes principaux, Ser385 / Ser386 et Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, qui contribuent chacun à l'activation de IRF3 par dimérisation, accumulation nucléaire, association avec le CREB protéine liant le (CBP) / co-activateurs p300, se liant à l'IFN élément de réponse sensible (ISRE) des séquences consensus et la transactivation de gènes cibles 9,10,17-19 ADN. La phosphorylation de Thr390 est également pensé pour contribuer à IRF3 activation induite par le virus 20. Analyses de spectrométrie de masse IRF3 ont démontré que les résidus Ser386, Thr390, Ser396 et Ser402 sont directement phosphorylated par l'inhibiteur de kinase kB ε (IKKε) / TANK contraignant kinase 1 (TBK1) kinases 9,10. Phosphorylation sur les résidus C-terminal est également nécessaire pour la terminaison de l'activation de IRF3 travers polyubiquitination et le protéasome de dégradation 10. Ce processus est également dépendante de la phosphorylation sur Ser339, qui est nécessaire pour le recrutement du propyle isomérase Pin1 10,11. Espèces IRF3 contenant au moins phospho-Ser339 / 386/396 résidus sont considérés comme des formes hyperphosphorylées. La séquence exacte et la fonction de chaque site reste un sujet de discussion 10,21. Il est maintenant clair que IRF3 activé ne représente pas un état homogène, mais que les différentes espèces activées présentant des caractéristiques de phosphorylation ou dimérisation distinctes existent 10,22.Pour fournir une compréhension complète de l'activation de IRF3 en réponse à des agents pathogènes spécifiques, il est donc nécessaire de characterize laquelle des espèces activées sont induites. L'induction de gènes cibles, de IRF3 IFNB1 et IFIT1, est révélée fournir une lecture fiable de l'activation du IRF3. Toutefois, le suivi expression de ces gènes ne fait pas de distinction entre les différents états d'activation du IRF3. Une analyse complète des états d'activation IRF3 dans un contexte particulier repose sur la caractérisation détaillée de sa phosphorylation et dimérisation état 10. Phosphorylée (formulaire I), hypophosphorylée (forme II) et (hyperphosphorylées formes III et IV) de formes IRF3 6,18,23 peut être résolu avec succès par une mobilité réduite en haute résolution analyse SDS-PAGE. Espèces IRF3 monomères et dimères peuvent être efficacement identifiés par analyse PAGE natif. Ces approches sont grandement améliorées lorsqu'il est utilisé en combinaison avec des anticorps dirigés contre les sites phosphospécifiques IRF3 de phosphoacceptor distinctes.
Les protocoles standard permettent une faible résolution deprotéines qui ne permettent pas une séparation efficace des IRF3 distincte formes phosphorylée. Ici, nous décrivons en détail une procédure pour obtenir la plus haute résolution pour surveiller l'induction d'espèces IRF3 de virus activé distinctes en utilisant SDS-PAGE couplé à PAGE natif en combinaison avec immunoblot utilisant des anticorps totaux et phosphospécifiques. In vivo discrimination entre les différentes activé formes de IRF3 est effectuée sur la base de leurs quarts de mobilité observées sur SDS-PAGE. En outre, le monomère et le dimère IRF3 peuvent être distingués par électrophorèse non dénaturantes. La combinaison de ces deux techniques complémentaires avec immunotransfert révèle être une approche abordable et sensible à l'acquisition de toutes les informations nécessaires pour une analyse complète de l'activation de la phosphorylation médiée par IRF3.
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Protocol
REMARQUE: Le protocole est décrit ici en utilisant des cellules A549 infectées avec le virus Sendai (SeV). Toutefois, le protocole de SDS-PAGE et PAGE natif travaille également avec tous les types humains et murins cellulaires testées jusqu'à présent, en particulier les cellules myéloïdes stimulées par divers stimuli 9,15,19,24,25 IRF3 activation.
1. L'infection de cellules A549
- Maintenir cellules A549 en culture dans une plaque de 15 cm à 37 ° C / 5% CO 2 dans 20 ml F12K moyen / Ham contenant 10% de sérum inactivé par la chaleur de veau fœtal (HI-FBS) et 1% de L-glutamine (F12K complet / moyen Ham).
NOTE: Toutes les solutions utilisées pour la culture et les traitements cellules doivent être stériles. - À 24 h avant l'infection, aspirer le milieu et laver les cellules avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate distillée (D-PBS) à température ambiante.
- Ajouter 1 ml de solution de trypsine-EDTA à 0,25% à chaque plaque pour couvrir les cellules et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
- Arrêtez l'incubation dès que ee cellules commencent à se détacher de la plaque en tapotant doucement la plaque avec une seule main. Inactiver la trypsine par addition de 10 ml de milieu complet F12K préchauffé / Ham par plaque et transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml.
- Centrifuger à 350 g pendant 3 min à température ambiante. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 8 ml de milieu complet F12K / Ham pour obtenir une suspension cellulaire unique homogène.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Ensemencer les cellules à une densité de 1 x 10 6 cellules par 60 mm plaque dans 4 ml d'F12K moyen / Ham complète pré-chauffé. Incuber pendant 20 - 24 heures à 37 ° C / 5% de CO 2. Après 20 à 24 h, les cellules forment une monocouche confluente à 90% (ce qui correspond à 1,5 x 10 6 cellules).
- Retirer le moyen et laver les cellules avec 2 ml d'F12K sans sérum / milieu Ham (AFD). Ajouter 2 ml de GDF frais par 60 mm plaque.
- Décongeler une aliquote de virus Sendai (SeV) (stockée en aliquotes à -80 ° C) sur de la glace et le vortex brièvement.
- Diluer evirus de la e en pré-chauffée GDF pour obtenir 60 HAU / 100 pi. Mélanger en pipetant doucement et ajouter 100 ul de virus dilué par plaque pour effectuer l'infection à 40 HAU / 10 6 cellules. Ne pas ajouter de virus dans la plaque témoin non infecté.
- Incuber les cellules dans l'incubateur à 37 ° C / 5% CO 2. Agiter à la main les plaques 3 ou 4 fois, ou en utilisant un agitateur orbital à bascule ou automatique placé directement dans l'incubateur, pendant la première heure de l'infection.
- À 2 heures post-infection, ajouter 2 ml de milieu F12K / Ham contenant 20% HI-FBS pour obtenir une concentration finale de 10% HI-FBS.
- Incuber les cellules dans l'incubateur à 37 ° C / 5% de CO 2 pour un montant supplémentaire de 1, 4 et 7 heures pour atteindre le temps total d'infection de 3, 6, et 9 h, respectivement. À chacun de ces points dans le temps, passez à l'étape 2.1.
2. Préparation des extraits de cellules entières (WCE)
- Enlever le milieu d'infection. Récolter les cellules par grattage dans 1 mlrefroidi à la glace de D-PBS et transférer la suspension cellulaire à un tube de 1,5 ml centrifugeuse pré-refroidi.
- Pellet les cellules par centrifugation à 16 000 xg à 4 ° C pendant 20 s et décanter soigneusement toutes les traces de D-PBS.
NOTE: À cette étape, le culot cellulaire peut être soumis directement à l'extraction des protéines ou surgelé dans de l'azote liquide ou de glace / bain d'éthanol sec et stocké à -80 ° C jusqu'à ce que la lyse. - Préparer le tampon de lyse contenant 50 mM de HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 10% de glycerol et 1% de Nonidet P-40 dans de l'eau désionisée (ddH 2 O). Ajouter Extemporarily protease (1 pg / leupeptine ml et 2 ug / ml d'aprotinine) et la phosphatase inhibiteurs (fluorure de sodium à 5 mM, 1 mM activé orthovanadate de sodium, 2 mM de phosphate de p-nitrophényle et 10 mM de β-glycérophosphate, pH 7,5).
NOTE: Le tampon de lyse sans inhibiteurs peut être conservé à 4 ° C. Un protocole spécifique pour l'activation de l'orthovanadate de sodium est décrite dans le tableau des réactifs spécifiques / Equipment. - Remettre en suspension le culot cellulaire dans 70 ul de tampon de lyse. Typiquement, la concentration du lysat sera d'environ 2 ug / ul.
- Incuber sur de la glace pendant 20 min. Flash gel du lysat par incubation dans un bain d'azote liquide pendant 15 secondes. Décongeler le lysat à température ambiante jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu et vortex pendant 10 sec. Répétez le dégel cycle de congélation / / Vortex 3 fois.
- Sinon, effectuer l'étape de congélation dans un / bain de glace sèche d'éthanol pendant 1 min.
- Centrifuger à 16 000 xg à 4 ° C pendant 20 min. Transférer le surnageant (correspondant à la WCE) à 1,5 ml d'un nouveau tube de centrifugation de pré-refroidi. Gardez le WCE sur la glace en tout temps.
- Quantifier les protéines en utilisant une procédure de quantification de protéine compatible avec le tampon de lyse tel que à base de protéines de Bradford 26 dosage.
3. Résolution du WCE par High Résolution SDS-PAGE
- Préparer trois gels d'électrophorèse dénaturant.
- Pour la détection deFormes IRF3, verser deux gels d'au moins 16 cm de longueur avec un gel de séparation, composé de 7,5% d'acrylamide / bis-acrylamide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS ), 1% de persulfate d'ammonium et 0,1% de TEMED à ddH 2 O et d'un gel d'empilement composé de 4% d'acrylamide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% de SDS, 1% de persulfate d'ammonium et 0,1% de TEMED à ddH 2 O.
Prudence! Acrylamide, TEMED et SDS sont toxiques et / ou irritants. Porter des gants et manipuler sous une hotte. - Pour la détection des protéines SEV, verser un gel d'au moins 8,5 cm de longueur avec des caractéristiques similaires au gel décrit dans 3.1.1, sauf que le gel de séparation contient 12% d'acrylamide.
- Pour la détection deFormes IRF3, verser deux gels d'au moins 16 cm de longueur avec un gel de séparation, composé de 7,5% d'acrylamide / bis-acrylamide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS ), 1% de persulfate d'ammonium et 0,1% de TEMED à ddH 2 O et d'un gel d'empilement composé de 4% d'acrylamide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% de SDS, 1% de persulfate d'ammonium et 0,1% de TEMED à ddH 2 O.
- Dénaturer le WCE obtenu à l'étape 2.6 en ajoutant de 1: 4 (v / v) de tampon 5x de chargement (Tris-HCl 125 mM, pH 6,8 (température ambiante), 10% de SDS, 20% (p / v) de glycerol, 0,0005% de bleu de bromophénol et β-mercaptoéthanol 25% en ddH 2 O) puis on chauffe à 100 °C pendant 10 min. Rotation rapide des tubes pour faire baisser la condensation qui se forme dans le capuchon.
Prudence! β-mercaptoéthanol est toxique par inhalation. Porter des gants et manipuler sous une hotte. - Montez les gels dans l'appareil de la migration. Remplir les chambres supérieure et inférieure avec un tampon contenant 25 mM Tris-base, 0,1% de SDS et 192 mM de glycine dans de l'eau distillée (dH 2 O) en cours d'exécution.
- La charge 14 pi de standard de poids moléculaire dans un puits de chaque gel de 16 cm et 7 ul de standard de poids moléculaire dans un puits du gel 8,5 cm. Charge 30 pg de WCE dénaturé (préparé comme décrit dans l'étape 3.2) par puits des deux gels préparés à l'étape 3.1.1 pour la détection des formes de IRF3. Charge 8-10 pg de WCE dénaturé (préparé comme décrit dans l'étape 3.2) par puits sur le gel préparé dans l'étape 3.1.2 pour l'analyse de SeV.
- Faire passer les gels à 30 mA de courant constant jusqu'à ce que le front de migration atteigne le fond du gel.
Remarque: La migration dure généralement approximationdiatement 3 h pour un gel de 16 cm et 45 min pour un gel de 8,5 cm. - Procéder au transfert sur des membranes de nitrocellulose (étape 5).
4. Analyse des IRF3 dimérisation par Native-PAGE
NOTE: Cette méthode a été décrite par le groupe du Dr T. Fujita 27.
- Préparer les supérieurs - (+) des tampons d'électrophorèse et de la chambre inférieure (). Le tampon de la chambre supérieure est constituée de 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), 192 mM de glycine et 1% de désoxycholate de sodium (DOC) en ddH 2 O. Le tampon de la chambre inférieure contient 25 mM de Tris-HCl pH 8,4 (RT) et 192 mM de glycine dans ddH 2 O.
REMARQUE: Les tampons d'électrophorèse chambre supérieure et inférieure peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à utilisation. Cependant, assurez-vous qu'ils sont pré-chauffés à température ambiante avant d'effectuer l'électrophorèse. - Pour un gel non dénaturant de résoudre une longueur minimum de 8,5 cm contenant 7,5% d'acrylamide / bis-acrylamide (37,5: 1), 375 mM de Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% munitionsnium persulfate et de 0,1% dans TEMED ddH 2 O.
- Pré-exécuter le gel à 40 mA de courant constant pendant 30 minutes sur la glace. Appuyez sur l'appareil en cours d'exécution dans la glace à environ le niveau du tampon d'électrophorèse de la chambre inférieure. Il est important que le gel se trouve pas dans la glace.
- Pendant la pré-course, mélanger WCE conservés sur la glace avec 2x PAGE natif tampon de charge 1: 1 (v / v) contenant 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% de glycérol et 0,1% de bleu de bromophénol dans ddH 2 O.
- Charge 8 - 10 pg WCE (préparé comme décrit dans l'étape 4.4) immédiatement à la fin de la pré-course.
- Exécuter le gel à 25 mA de courant constant sur de la glace, comme décrit ci-dessus pour la pré-course, jusqu'à ce que le front de migration atteigne le fond du gel (environ 40 min).
5. Analyse par immunoblot de IRF3 espèces
- Préparer le tampon de transfert contenant 25 mM Tris-base 192 mM et de la glycine en ddH 2 O. Réfrigérer le tampon de transfert à 4 ° C avant utilisation.
- Wet trois morceaux de membrane de nitrocellulose coupés à une taille légèrement plus grande que les gels dans une boîte en plastique / verre contenant le tampon de transfert. Indiquer l'orientation de la membrane en coupant un coin. Le tampon de transfert peut être réutilisé 3 fois. Stocker le tampon à 4 ° C entre les utilisations.
- Les gels Uncast (SDS-PAGE et PAGE natif) et couper un coin de chaque gel pour une orientation correcte.
- Pour PAGE natif, incuber le gel à température ambiante avec agitation douce pendant au moins 30 min dans le tampon SDS-PAGE courante pour enlever le DOC avant de les transférer dans la mémoire tampon de transfert.
- Incuber les gels de SDS-PAGE (natif et-PAGE) dans le tampon de transfert de 5 - 10 min.
- Monter un sandwich de transfert par gel dans une cassette de transfert avec la membrane vers l'électrode positive (mousse papier pad / filtre / membrane / gel / papier filtre / tapis de mousse). Veillez à retirer toutes les bulles entre les couches du sandwich.
- Effectuer le transfert que b recommandéy le fabricant pour l'appareil de transfert utilisé.
REMARQUE: Effectuer toutes les incubations et lavages dans les prochaines étapes sur une plate-forme à bascule ou secouer orbitale. - A la fin du temps de transfert, incuber les membranes pendant 15 min dans la solution de fixation contenant de l'acide acétique à 7%, 40% d'éthanol et 3% de glycerol dans ddH 2 O. Laver les membranes 3x 5 min dans du PBS (137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10,2 mM Na 2 HPO 4 et 1,8 mM KH 2 PO 4 en DH 2 O).
Prudence! L'acide acétique est toxique, irritant et inflammable. Porter des gants et manipuler sous la hotte.
NOTE: La solution de fixation peut être réutilisé plusieurs fois. - Pour la membrane PAGE natif passer directement à l'étape 5.11.
- Rincer les membranes trois SDS-PAGE rapidement dans dH 2 O avant de les faire incuber pendant 1 minute dans une solution de rouge ponceau contenant 6,57 mM de rouge Ponceau et de l'acide acétique à 1% dans ddH 2 O.
NOTE: La solution de ponceau rouge peut être r eused plusieurs fois. - Rincer les membranes dans dH 2 O jusqu'à ce que le fond est assez blanche pour voir les bandes de protéines colorées en rouge. Notez les marqueurs avec un crayon et couper la membrane excès autour de protéines. Destain les membranes par incubation pendant 5 min dans du PBS sous agitation.
- Incuber les membranes pendant 1 heure à la température ambiante ou O / N à 4 ° C dans la solution de blocage (PBS contenant 0,05% de Tween 20 et de lait en poudre 5% non gras (PBS-T-lait). Laver les membranes 3x 5 min à PBS-T.
NOTE: Le lavage PBS-T est en option et nécessaire seulement lors de l'application stricte des anticorps dilué dans du PBS-T contenant 5% d'albumine de sérum bovin (PBS-BSA-T) (figure 1 et tableau 1) dans l'étape suivante. - Incuber les quatre membranes (par SDS-PAGE et PAGE natif) avec les anticorps primaires selon l'ordre séquentiel indiqué dans la Figure 1 et le Tableau 1. Effectuer 5x 5 min lavages dans du PBS-T.
Figure 1. Séquence des analyses immunoblot. Le schéma décrit les SDS-PAGE et PAGE natif gels individuels nécessaires pour détecter les différentes formes phosphorylées et monomères / dimères IRF3. L'ordre spécifique des anticorps appliqués à la membrane obtenue à partir de chaque gel dans la procédure d'immuno-empreinte est décrite. On notera que les anticorps anti-actine sont utilisés d'abord à assurer l'égalité de chargement des échantillons avant l'application d'autres anticorps spécifiques. La séquence alternée, avec des anticorps anti-actine étant appliquée après que les anticorps anti-phospho-IRF3, fonctionne aussi. Décapage est utilisé entre anti-actine et des anticorps anti-SEV, ou entre anti-phospho-IRF3 et des anticorps anti-IRF3 en raison du chevauchement taille des signaux. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Les anticorps primaires | Dilution | Tampon de dilution | Incubation | Anticorps secondaires | commentaires |
| Anti-actine | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | 15 min à température ambiante | Anti-souris | Utilisez après SDS-PAGE Antibodyies dilué peuvent être réutilisés plusieurs fois si elle est stockée à 4 ° C en présence de 0,02% d'azoture de sodium. |
| Anti-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N à 4 ° C | Anti-lapin | Utilisez après Native-PAGE. Il est recommandé de ne pas réutiliser l'anticorps dilué |
| Anti-IRF3-P-Ser396 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N à 4 ° C | Utilisez après SDS-PAGE. Il est recommandé de ne pas réutiliser l'anticorps anti-IRF3-P-396 dilué est également disponible auprès de Cell Signaling. Dilution optimale a été définie comme 1 / 1.000 pour cet anticorps, mais peut varier entre les lots. | |
| Anti-IRF3-P-Ser398 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N à 4 ° C | Anti-lapin | Utilisez après SDS-PAGE. Il est recommandé de ne pas réutiliser l'anticorps dilué |
| Pleine longueur Anti-IRF3 | 1/7500 | PBS-T-lait | 3 heures à température ambiante | Anti-lapin | Utilisez après SDS-PAGE. Anticorps pleine longueur Anti-IRF3 peut être utilisé après PAGE natif, mais il est moins sensible pour détecter le monomère. Anticorps dilué peuvent être réutilisés plusieurs fois si elle est stockée à 4 ° C en présence de 0,02% d'azoture de sodium. |
| Anti-IRF3-NES | 0,5 pg / ml | PBS-T-lait | 3 heures à température ambiante | Anti-lapin | Utilisez après Native-PAGE. Antibodyies dilué peuvent être réutilisés plusieurs fois si elle est stockée à 4 ° C en présence de 0,02% d'azoture de sodium. |
| Anti-SEV | 1 / 14.000 | PBS-T-BSA | 3 heures à température ambiante | Anti-lapin | Utilisez après SDS-PAGE. Antibodyies dilué peuvent être réutilisés plusieurs fois si elle est stockée à 4 ° C en présence de 0,02% d'azoture de sodium. |
| REMARQUE: Dilution et tampon utilisé pour Anticorps secondaires HRP-couplées doivent être optimisés car il varie d'une entreprise à l'autre. | |||||
Tableau 1. Spécifications d'anticorps utilisés dans la procédure Immunoblotting.
- Incuber les membranes avec la peroxydase de raifort (RHP) conjugué à des anticorps secondaires comme détaillé sur la figure 1 et le tableau 1. Laver les membranes 5 fois 5 min dans du PBS-T, suivi de 2 x 5 min dans du PBS pour éliminer complètement les traces de Tween.
- Incuber les membranes pendant 1 min dans un volume de réactif de chimioluminescence amélioré suffisante pour couvrir complètement les membranes. Sécher les membranes à l'aide du papier filtre.
- Placer la membrane dans un analyseur d'image luminescent pour visualiser les bandes immunoréactives.
- Sinon, effectuer la détection des bandes immunoréactives utilisant sensibles films X-Ray.
- Laver les membranes 3x 5 min dans du PBS.
NOTE: À cette étape, les membranes peuvent être gardés au sec. Cependant, si d'autres décapage est requis, il est préférable d'effectuer le décapage avant le séchage de la membrane. Les membranes peuvent également être stockées à court terme dans le PBS. - Pour les membranes qui ne nécessitent pas de décapage entre incubation avec des anticorps (voir la figure 1) de procéder directement à l'étape5.20.
- Lorsque le décapage est nécessaire entre des anticorps (voir Figure 1), incuber les membranes dans une solution pré-chauffé décapage contenant 2% de SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) et de 0,7% β-mercaptoéthanol dans le trou DDH 2 O à 50 ° C pendant 20 min sous agitation régulière. Laver les membranes 3x 5 min dans du PBS.
REMARQUE: Agitation pendant la procédure de décapage est la clé. Décapage peut être effectué dans un four à hybridation. Alternativement, le décapage peut être effectuée en utilisant des membranes scellés dans des sacs en plastique et immergé dans un bain d'eau. Dans ce cas, il est important d'agiter les membranes 4 - 5 fois au cours de l'incubation. - Incuber les membranes pendant 1 heure à température ambiante ou O / N à 4 ° C dans du PBS-T-lait.
- Répéter les étapes 5,12 à 5,16 selon la figure 1.
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Representative Results
La figure 2 montre une image typique de immunoblot IRF3 détecté avec IRF3 anticorps totaux et des anticorps IRF3-phosphospécifiques contre Ser396 et Ser398 après la résolution de WCE par haute résolution SDS-PAGE. Dans les cellules non stimulées A549, IRF3 est détecté comme deux bandes à 50 et 53 kDa sur SDS-PAGE correspondant à la non-phosphorylée (formulaire I) et le hypophosphorylé (forme II) espèces de IRF3. L'exposition des cellules A549 au SEV pour les 3 - 9 résultats de RH dans un déplacement en fonction du temps de migrer lentement formes hyperphosphorylées III et IV, qui sont bien distingués des formes I et II. Les bandes hyperphosphorylées migrent à 55-57 kDa. Les formes III et IV sont également spécifiquement immunodétectées à l'aide des anticorps phosphospécifiques Ser396 et Ser398 contre. L'immunodétection de l'actine sert de témoin de charge égale entre les voies. Un contrôle de l'infection par le SeV est représenté par l'accumulation de la nucléocapside du virus de protein (N), qui migre à 60 kDa.
Sur la figure 3, le profil de détection obtenu à partir de IRF3 WCE résolu par PAGE native suivie par immunoblot en utilisant des anticorps anti-IRF3-NDA et des anticorps phosphospécifiques contre Ser386 est représenté. Dans les cellules non stimulées A549, IRF3 est détecté comme une seule bande correspondant à la forme monomère. Lors de l'infection avec SeV pour 3 - 9 h, les niveaux de IRF3 diminution de monomère avec une accumulation concomitante d'une bande migrant lentement qui correspond à la forme dimère de IRF3. Les anticorps contre phosphospécifiques Ser386 ne détectent espèces IRF3 dimères.
Figure 2. Détection de IRF3 Distinct phosphorylés Espèce (formulaire I-IV) induite par SeV infections dans les cellules A549. Les cellules A549 ont été laissés non infecté ou infecté par SeV pour l'indicaTED fois. WCE ont été analysés par haute résolution SDS-PAGE suivie par immunoblot (IB) en utilisant des anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) et anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) anticorps phosphospécifiques et anti -IRF3 pleins anticorps de protéines de longueur. L'infection a été contrôlée en utilisant des anticorps anti-SeV (la nucléocapside N protéine est représentée). Les anticorps anti-actine ont été utilisés comme un contrôle du chargement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Suivi de l'induction de IRF3 phosphorylée / dimérisé par SeV dans les cellules A549. Les cellules A549 ont été laissés non infectées ou infectées avec SeV pendant les temps indiqués. WCE ont été résolus par PAGE natif et révélé par immunoblot utilisant des anticorps anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) anticorps phosphospécifiques et anti-IRF3-NES ANTIBOdies. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole que nous décrivons ici se compose d'une combinaison de haute résolution SDS-PAGE et PAGE natif couplé à l'utilisation de plusieurs anticorps phosphospécifiques à distinguer le monomère / dimère et phosphoforms I-IV de IRF3. Détection approprié de ces espèces IRF3 est essentiel pour caractériser complètement l'activation de IRF3 dans un contexte spécifique. Par exemple, LPS stimulation de macrophages activés conduit à la formation de dimères, Ser396 / 398 IRF3 phosphorylée qui présente une hypophosphorylé (forme II), mais pas hyperphosphorylé (formulaire III et IV), modèle en SDS-PAGE 15. En utilisant le protocole décrit, ce profil peut être distinguée de formes hyperphosphorylées induites par un virus qui exigent la phosphorylation de Ser339 supplémentaire en plus de la phosphorylation de Ser386 et Ser396 10. Fait important, ce qui permet également une discrimination entre Ser396 phosphorylé espèces qui ne présentent pas la dimérisation, mais qui sont 10 transcriptionnellement actif. Importante, il convient de noter que le modèle formulaire I-IV de phosphoforms de IRF3 appliqué à IRF3 humaine. Murine IRF3 ne présente pas une tendance similaire et par conséquent l'activation de IRF3 est caractérisé uniquement par l'utilisation d'anticorps phosphospécifiques en immunoblot après SDS-PAGE et par PAGE natif.
La réalisation d'une séparation à haute résolution des espèces distinctes de phosphorylés IRF3 par SDS-PAGE nécessite des paramètres spécifiques. Pour une résolution appropriée, il est très important d'utiliser des gels qui ont une longueur minimale de 16 cm. Même avec cette longueur de gel de séparation, il est essentiel de laisser le front de migration atteint le bas du gel pour obtenir une séparation appropriée des différentes formes de IRF3. En outre, le gel d'empilement doit se prolonger à un minimum de 1 cm en dessous du peigne pour obtenir des bandes bien définies. Ceci est important car les formes hyperphosphorylées de IRF3 migrent très près les uns des autres. Groupes ciblés mal vont entraîner un manque de distinction entre phosphorylaTed forme de compromettre leur quantification respective. En outre, la concentration du persulfate d'ammonium et TEMED varient d'un protocole SDS-PAGE à l'autre. Variation de ces concentrations de ceux indiqués ici a été trouvé de nuire sensiblement à la résolution de la séparation des espèces IRF3.
Détection de la formation IRF3 dimère par la PAGE natif a été décrite par le groupe du Dr T. Fujita. Ce protocole utilise un tampon contenant DOC qui permet la dissociation du dimère de IRF3 de CBP / p300 27. Il est fortement recommandé de procéder à PAGE natif immédiatement après lyse cellulaire comme le stockage de la WCE à -80 ° C a été trouvé pour entraîner une altération significative du rapport monomère IRF3 / dimère. En outre, il est très important que le pH des tampons de chambre supérieure et inférieure est ajustée à pH 8,4 à température ambiante, et non à 4 ° C, après avoir mélangé tous les composants pour obtenir une séparation correcte du monomère vs dimère. Une séparationgel avec une longueur minimale de 8,5 cm permet une séparation appropriée des IRF3 monomère et dimère. Le volume idéal de l'échantillon plus tampon de charge est d'environ 8 pi pour un 5 mm ainsi que la résolution est meilleure lorsque le volume est maintenu à un minimum. Ainsi, il est important d'utiliser le plus faible volume de tampon de lyse pour obtenir WCE avec une concentration élevée. Toutefois, il convient de prendre en compte le fait que l'extraction des protéines dans la lyse efficace exige au moins 5 fois le volume du culot cellulaire. Si le volume des échantillons est supérieure à la limite indiquée ci-dessus, cela se traduirait par une faible résolution du monomère / dimère. Ceci peut être résolu par l'addition d'un gel d'empilement à 4% d'acrylamide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 1% de persulfate d'ammonium et 0,1% de TEMED à ddH 2 O. Il est très important de charger les échantillons sans déranger baguage. Chargement lentement avec un gel de chargement pointe près du fond du puits donne de très bons résultats.
Ici, nous décrivons l'in vivo detection de phosphorylation sur des résidus spécifiques utilisant des anticorps phosphospécifiques actuellement disponibles contre la Ser386 9, 19 et Ser398 Ser396 15. L'utilisation de mutants de IRF3 et spectrométrie de masse analyses ont confirmé que ces résidus sont phosphorylés à l'infection virale ou la surexpression de IKKε kinases / de TBK1 et sont essentiels pour 6,9,10,19,21 d'activation de IRF3. L'immunodétection de phospho-Ser396, phospho-Ser398 et IRF3 total après SDS-PAGE nécessite l'utilisation de deux gels identiques (Figure 1). En effet, la perte de sensibilité significative est observée lorsque des anticorps phosphospécifiques sont utilisés après le décapage de la membrane. Par conséquent, il est fortement recommandé d'utiliser des anticorps de phosphospécifiques premier. Notez que les anticorps primaires et secondaires alternatives peuvent également fonctionner, mais les dilutions et la séquence d'utilisation spécifiques devraient être optimisés. Pour l'analyse de IRF3, 30 ug de WCE est approprié pour obtenir une détection significative de IRF3phosphorylation par immunoblot en utilisant les anticorps indiqués lors de l'utilisation de 4 mm de largeur puits. Bien que dans de nombreux types de cellules infectées par différents virus 30 pg a été jugée appropriée, ce montant pourrait être augmenté en fonction du type de cellule et de stimulation. Il est préférable d'utiliser des extraits frais pour SDS-PAGE, mais la détection de IRF3 phosphorylation en utilisant les anticorps de phosphospécifiques décrits dans le présent document est suffisamment stable pour permettre à une partie de stockage de la WCE à -80 ° C avant l'analyse. Les concentrations des inhibiteurs de phosphatase décrits ici se sont avérés suffisants pour l'utilisation de cellules A549. Des concentrations plus élevées sont introuvables pour obtenir de meilleurs résultats. Toutefois, ces concentrations pourraient devoir être augmenté lorsque l'on étudie l'activation de IRF3 dans les types de cellules qui présentent des niveaux d'activité plus élevés de phosphatase. Surtout, la phosphorylation de IRF3 et les mécanismes sous-jacents sont encore loin d'être compris. Par conséquent, un panneau plein de Ser / Thr et Tyr-phosphatase dansinhibiteurs est utilisé pour bloquer les activités possibles encore non caractérisées qui pourraient affecter la détection de IRF3 phosphorylation, la dimérisation et de la dégradation. Pour la détection de monomère et dimère IRF3 après la plupart des infections par le virus et dans la plupart des types de cellules, 8-10 ug WCE a été jugée suffisante. Cependant, plus grande quantité de protéines peut être nécessaire pour l'activation de la stimulation IRF3 moins efficacement. Les anticorps contre phosphospécifiques Ser386 utilisées dans cette étude sont recommandés pour être utilisés dans PAGE natif que la sensibilité dans dénaturant SDS-PAGE est très faible. Par ailleurs, la phosphorylation sur Ser386 est proposé de mettre en corrélation avec la forme dimère de IRF3 9, ce qui rend l'utilisation de ces anticorps dans PAGE natif d'une stratégie appropriée pour confirmer ce concept dans un contexte spécifique. Fait à noter, les anticorps de rechange sont disponibles auprès de diverses entreprises et sont réclamés pour détecter efficacement phospho-Ser386 après SDS-PAGE. Phosphospécifiques anticorps contre Ser396 ont également été efficacement used pour détecter IRF3 phosphorylation après PAGE natif 20. Fait important, Ser402 de la grappe de sites de phosphoacceptor C-terminal a été également révélée être importante pour l'activation du IRF3 et la phosphorylation de Ser402 a été observé par spectrométrie de masse d'analyse de IKKε / TBK1-phosphorylé IRF3 10,21,28. Cependant, en dépit de deux tentatives différentes (NG, non publié), aucun anticorps phosphospécifiques sont actuellement disponibles pour suivre la phosphorylation de ce résidu spécifique in vivo. Notez que les anticorps contre phosphospécifiques Thr157 et Ser339 ont également été décrits 11,13. Ces anticorps phosphospécifiques supplémentaires pourraient être utilisés dans une procédure de haute résolution SDS-PAGE similaire à celui décrit ici. Dans ce cas, les grands gels SDS-PAGE supplémentaires seraient nécessaires pour chaque anticorps et traitées de la même manière que le gel n ° 2 (figure 1). À notre connaissance, aucun anticorps contre phosphospécifiques Ser173 ou Thr390 n'a encore été décrit,mais ils pourraient être facilement ajoutés au protocole décrit ici une fois qu'ils deviennent disponibles 14,20.
IRF3 activité se termine par la dégradation par le protéasome des formes hyperphosphorylées 11,17. Le protocole décrit ici permet aussi le suivi de la dégradation des IRF3 lorsque la cinétique de stimulation se prolonge et est couplée à l'utilisation d'inhibiteurs de protéasome MG132 (, lactacystine ou bortezomid). Typiquement, dans les cellules A549 infectées avec SeV à 40 HAU / 10 6 cellules, IRF3 phosphorylation commence dès 2 heures post-infection et SeV IRF3 dégradation commence après 12 h. La dégradation par le protéasome sera conclu de la diminution observée des formes III et IV niveaux aux points de temps de retard qui est inversée dans des conditions avec des inhibiteurs de protéasome. Cela permettra également de traduire sur PAGE natif dans une diminution des niveaux de dimères IRF3 qui sont récupérés lors d'un traitement inhibiteur de protéasome 29. Surtout, la haute résolution TechniQue présentée ici permet la distinction entre le processus de dégradation et un manque d'activation. En effet, à la fois la dégradation et de l'absence d'activation du résultat de IRF3 en l'absence de détection de dimère / phospho-Ser386 / 396. Cependant, l'absence d'activation est associée à la détection de monomère IRF3 et des formes I et II, tandis que ces espèces ne sont pas détectés IRF3 lorsque IRF3 30 est dégradée.
Immunoprécipitation couplée à l'analyse comparative par spectrométrie de masse est une méthode de choix pour détecter la phosphorylation in vivo de IRF3 à des sites distincts. Cette technique a été utilisée pour confirmer la phosphorylation de Ser173 à IRF3, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 et Ser402 résidus 10,20,21. Cependant, la spectrométrie de masse est une technique pas encore abordable / benchside qui peut être facilement utilisé pour l'analyse de l'activation de tous les jours IRF3 après plusieurs stimulations à différents points dans le temps. Par conséquent, la procédure décrite ici en utilisant SDS-PAGE natif couplé à-PAGE en combinaison avec immunoblot utilisant des anticorps totaux et phosphospécifiques constitue une approche pratique, abordable et sensible pour détecter toutes les formes actuellement définis de actived IRF3.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
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