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Biology

एक उच्च संकल्प विधि IRF3 के फोस्फोराइलेशन निर्भर एक्टिवेशन नजर रखने के लिए

Published: January 24, 2016 doi: 10.3791/53723
Automatic Translation
*1,2,3, *1,3, 1, 1,2,3
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Introduction

सर्वत्र और अनिवार्यता से व्यक्त प्रतिलेखन कारक इंटरफेरॉन (IFN) नियामक फैक्टर 3 (IRF3) मुख्य रूप से IFNβ की प्रेरण के माध्यम से रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी केमोकाइन (सीसी मूल भाव) के शामिल ligand 5 (CCL5 के माध्यम से ) और tetratricopeptide साथ IFN प्रेरित प्रोटीन सहित कई एंटीवायरल प्रोटीन IFIT1 / 2 / 01-03 मार्च को दोहराता है। या lipopolysaccharide (एलपीएस) 4: IRF3 सक्रियण polyinosinic-polycytidylic एसिड (सी पाली आई) के लिए निम्न कई वायरस से संक्रमण, या जोखिम की सूचना दी गई है। महत्वपूर्ण बात है, सबसे अधिक अध्ययन वायरस IRF3 की मध्यस्थता प्रतिक्रिया से बचने, और इस तरह मेजबान सहज प्रतिरक्षा रक्षा 5 से बचने के लिए तंत्र विकसित किया है। इस प्रकार, IRF3 सक्रियण की निगरानी जन्मजात एंटीवायरल मेजबान रक्षा के आणविक तंत्र को समझने के लिए, लेकिन यह भी इस प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया करने के लिए वायरस द्वारा इस्तेमाल के लिए रणनीति की पहचान करने के लिए बहुत महत्व का है।

ईएनटी "> कई प्रकाशित रिपोर्ट हालांकि कम संकल्प सोडियम dodecyl सल्फेट जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए युग्मित IRF3-लक्ष्य जीन प्रेरण की निगरानी (IFNB1 और IFIT1) द्वारा किया जाता IRF3 सक्रियण और / या luciferase रिपोर्टर जीन परख का केवल एक सीमित विश्लेषण प्रदान (SDS- पृष्ठ) IRF3 का विश्लेषण। हालांकि, कई जैव रासायनिक अध्ययन, विभिन्न IRF3 म्यूटेंट और IRF3 क्रिस्टल संरचना 6-11 की व्याख्या के व्यवहार के विश्लेषण पर फास्फोरिलीकरण द्वारा अनुक्रमिक बाद translational संशोधनों की एक जटिल सेट के अधीन है कि IRF3 स्थापित करने के लिए योगदान दिया है कई साइटों। IRF3 सक्रियण में शामिल फास्फोरिलीकरण के सेट सेल प्रकार पर प्रोत्साहन पर निर्भर है और सबसे अधिक संभावना प्रतीत होता है। असंक्रमित कोशिकाओं में, IRF3 गैर फॉस्फोरिलेटेड और hypophosphorylated प्रजातियों 1 में, Thr135 और Ser173 सहित phosphoresidues, युक्त के रूप में coexists -198 हूँ एन टर्मिनल क्षेत्र 6,12-14। इस hypophosphorylated च का संचयIRF3 की ORM तनाव inducers, वृद्धि कारक है और डीएनए को नुकसान पहुँचाए एजेंटों 6 से प्रेरित है। Transactivation डोमेन युक्त IRF3 के सी टर्मिनल क्षेत्र में सर्विसेज / Thr अवशेषों के फोस्फोराइलेशन वायरस से हुई सक्रियता शुरू हो रहा है, पाली मैं: एक सेल प्रकार पर निर्भर तरीके 15-17 में सी या एलपी। IRF3 के सी टर्मिनल फास्फोरिलीकरण प्रत्येक dimerization के माध्यम से IRF3 सक्रियण, परमाणु संचय, CREB के साथ सहयोग करने के लिए योगदान है, कि दो मुख्य समूहों, Ser385 / Ser386 और Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 में संगठित कोई कम से कम 7 अलग phosphoacceptor साइटों शामिल -binding प्रोटीन (सीबीपी) / P300 coactivators, संवेदनशील प्रतिक्रिया तत्व (ISRE) आम सहमति दृश्यों और लक्ष्य जीन 9,10,17-19 की transactivation IFN के लिए बाध्य डीएनए। Thr390 के फोस्फोराइलेशन भी वायरस प्रेरित IRF3 सक्रियण 20 में योगदान करने के लिए सोचा है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री IRF3 का विश्लेषण करती है Ser386, Thr390, Ser396 और Ser402 अवशेष सीधे phosphorylat हैं कि दिखा दिया हैκB काइनेज ε का अवरोध करनेवाला (IKKε) द्वारा एड / टैंक बाध्यकारी काइनेज 1 (TBK1) 9,10 kinases। सी टर्मिनल अवशेषों पर Phosphorylation भी polyubiquitination और एंटीबॉडी की मध्यस्थता गिरावट के माध्यम से 10 IRF3 सक्रियण की समाप्ति के लिए आवश्यक है। इस प्रक्रिया को भी propyl आइसोमेरेस Pin1 10,11 की भर्ती के लिए आवश्यक है जो Ser339 पर फास्फोरिलीकरण, पर निर्भर है। कम से कम phospho-Ser339 / 386/396 अवशेषों से युक्त IRF3 प्रजातियों hyperphosphorylated रूपों माना जाता है। प्रत्येक साइट का सही अनुक्रम और समारोह चर्चा 10,21 का विषय बनी हुई है। यह सक्रिय IRF3 एक सजातीय राज्य का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, लेकिन अलग फास्फोरिलीकरण या dimerization विशेषताओं का प्रदर्शन करते है कि अलग अलग सक्रिय प्रजातियों 10,22 मौजूद है कि अब यह स्पष्ट है।

विशिष्ट रोगजनक के जवाब में IRF3 सक्रियण की पूरी समझ प्रदान करने के लिए, यह चर्चा के लिए इस प्रकार आवश्यक हैप्रेरित कर रहे हैं सक्रिय प्रजातियों में से जो aracterize। IRF3 लक्ष्य जीन, IFNB1 और IFIT1 की प्रेरण, IRF3 क्रियान्वयन के लिए एक विश्वसनीय पढ़ने के लिए बाहर प्रदान करने के लिए साबित कर दी है। हालांकि, इन जीनों की अभिव्यक्ति की निगरानी IRF3 के विभिन्न सक्रियण राज्यों के बीच भेद नहीं करता। एक विशेष सेटिंग में IRF3 सक्रियण राज्यों के लिए एक व्यापक विश्लेषण इसकी फास्फोरिलीकरण और dimerization स्थिति 10 की विस्तृत लक्षण वर्णन पर निर्भर करता है। Unphosphorylated (प्रपत्र आई), (फार्म द्वितीय) और hyperphosphorylated hypophosphorylated (रूपों तृतीय और चतुर्थ) IRF3 रूपों 6,18,23 सफलतापूर्वक उच्च संकल्प एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण में कम गतिशीलता से सुलझाया जा सकता है। Monomeric और dimeric IRF3 प्रजातियों कुशलता से देशी-पृष्ठ विश्लेषण से पहचाना जा सकता है। अलग IRF3 phosphoacceptor साइटों के खिलाफ निर्देशित phosphospecific एंटीबॉडी के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जब इन तरीकों में काफी सुधार कर रहे हैं।

स्टैंडर्ड प्रोटोकॉल का एक गरीब संकल्प की अनुमति देते हैंअलग IRF3 फॉस्फोरिलेटेड रूपों के कुशल जुदाई की अनुमति नहीं देता है कि प्रोटीन। यहाँ, हम कुल और phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot के साथ संयोजन में देशी-पृष्ठ युग्मित एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर अलग वायरस सक्रिय IRF3 प्रजातियों की प्रेरण नजर रखने के लिए उच्चतम संकल्प को प्राप्त करने के लिए विस्तार में एक प्रक्रिया का वर्णन। सक्रिय विभिन्न बीच में विवो भेदभाव IRF3 के रूपों एसडीएस पृष्ठ पर मनाया उनकी गतिशीलता पारियों के आधार पर किया जाता है। इसके अतिरिक्त, IRF3 मोनोमर और डिमर गैर denaturing वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है। immunoblot के साथ इन दो पूरक तकनीक के संयोजन IRF3 के फोस्फोराइलेशन की मध्यस्थता सक्रियता का एक पूरा विश्लेषण के लिए सभी आवश्यक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक किफायती और संवेदनशील दृष्टिकोण साबित होता है।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल सेंडाइ वायरस (सेव) से संक्रमित A549 कोशिकाओं का उपयोग कर यहाँ वर्णित है। हालांकि, एसडीएस पृष्ठ और देशी पृष्ठ के लिए प्रोटोकॉल भी अब तक परीक्षण सभी मानव और murine सेल प्रकार, विभिन्न IRF3 सक्रिय उत्तेजनाओं 9,15,19,24,25 के साथ प्रेरित विशेष रूप से माइलॉयड कोशिकाओं के साथ काम करता है।

A549 कोशिकाओं के 1. संक्रमण

  1. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 के 20 में से एक 15 सेमी की थाली में संस्कृति में A549 कोशिकाओं को बनाए रखने मिलीलीटर 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एचआई-एफबीएस) और 1% एल glutamine युक्त F12K / हाम मध्यम (पूरा F12K / हाम माध्यम)।
    नोट: सेल संस्कृति और उपचार के लिए इस्तेमाल सभी समाधान बाँझ होना चाहिए।
  2. संक्रमण से पहले 24 घंटे से कम, मध्यम महाप्राण और आसुत फॉस्फेट बफर खारा आरटी पर (डी पीबीएस) के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  3. कोशिकाओं को कवर किया और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने के लिए प्रत्येक थाली करने के लिए 0.25% trypsin EDTA के समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. जैसे ही वें के रूप में ऊष्मायन बंद करोई कोशिकाओं धीरे एक हाथ से थाली दोहन से थाली से अलग करने के लिए शुरू करते हैं। प्रति प्लेट पूर्व गर्म पूरा F12K / हाम माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़कर trypsin निष्क्रिय और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण।
  5. आरटी पर 3 मिनट के लिए 350 XG पर अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और एक सजातीय एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए पूरा F12K / हाम माध्यम के 8 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
  6. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। पूर्व गर्म पूरा F12K / हाम माध्यम के 4 मिलीलीटर में 60 मिमी प्रति प्लेट 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं बीज। 20 के लिए सेते हैं - 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर 24 घंटा 20 के बाद - 24 घंटा, कोशिकाओं को एक 90% मिला हुआ monolayer (यह 1.5 x 10 6 कोशिकाओं से मेल खाती है) के रूप में।
  7. मध्यम निकालें और सीरम मुक्त F12K / हाम मध्यम 2 मिलीलीटर (SFM) के साथ कोशिकाओं को धो लें। 60 मिमी प्रति प्लेट ताजा SFM के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. संक्षेप में बर्फ और भंवर पर (संग्रहीत -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquoted) सेंडाइ वायरस (सेव) के एक विभाज्य पिघलना।
  9. वें पतलापूर्व गर्म SFM में ई वायरस 60 हाओ / 100 μl प्राप्त करने के लिए। धीरे से नीचे से ऊपर pipetting और द्वारा मिक्स और 40 हाओ / 10 6 कोशिकाओं में संक्रमण प्रदर्शन करने के प्रति प्लेट पतला वायरस के 100 μl जोड़ें। गैर संक्रमित नियंत्रण की थाली में वायरस न जोड़ें।
  10. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं। हाथ से 3 या 4 बार प्लेटों आंदोलन, या संक्रमण के पहले घंटे के दौरान, इनक्यूबेटर में रखा सीधे एक स्वत: कक्षीय या कमाल प्रकार के बरतन का उपयोग कर।
  11. 2 घंटा के बाद संक्रमण में 10% हाई-एफबीएस के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 20% हाई-FBS युक्त F12K / हाम मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  12. क्रमश: 3, 6, और 9 घंटा की कुल संक्रमण गुना तक पहुंचने के लिए एक अतिरिक्त 1, 4 और 7 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं। इन समय बिंदुओं में से प्रत्येक में 2.1 कदम आगे बढ़ना।

पूरे सेल के अर्क का 2. तैयारी (WCE)

  1. संक्रमण के माध्यम से निकालें। 1 मिलीलीटर में scraping द्वारा कोशिकाओं फसलऔर ठंडा डी पीबीएस के एक पूर्व ठंडा 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण।
  2. 20 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं और ध्यान से डी पीबीएस के सभी निशान को छानना।
    नोट: इस चरण में, सेल गोली सीधे प्रोटीन निकासी या फ्लैश जमी तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान में और सेल तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत के लिए किए जा सकते हैं।
  3. 50 मिमी HEPES पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, 10% ग्लिसरॉल और 1% Nonidet पी 40 विआयनीकृत पानी में युक्त lysis बफर तैयार (DDH 2 ओ)। Extemporarily प्रोटीज (1 माइक्रोग्राम / एमएल leupeptin और 2 माइक्रोग्राम / एमएल aprotinin) और फॉस्फेट अवरोधकों को जोड़ने (5 मिमी सोडियम फ्लोराइड, 1 मिमी सोडियम orthovanadate, 2 मिमी पी nitrophenyl फॉस्फेट और 10 मिमी β-glycerophosphate पीएच 7.5 सक्रिय)।
    नोट: अवरोधकों के बिना बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। सोडियम orthovanadate के क्रियान्वयन के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल विशिष्ट अभिकर्मकों / Equipme की तालिका में वर्णन किया गया हैNT।
  4. Lysis बफर के 70 μl में सेल गोली Resuspend। आमतौर पर lysate एकाग्रता / μl लगभग 2 ग्राम हो जाएगा।
  5. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। 15 सेकंड के लिए एक तरल नाइट्रोजन स्नान में ऊष्मायन द्वारा lysate फ्लैश फ्रीज। यह पूरी तरह से 10 सेकंड के लिए पिघल गए और भंवर जाता है जब तक आरटी पर lysate गला लें। / फ्रीज पिघलना / भंवर चक्र 3 बार दोहराएँ।
    1. वैकल्पिक रूप से, 1 मिनट के लिए एक इथेनॉल / ड्राई बर्फ स्नान में ठंड कदम प्रदर्शन करते हैं।
  6. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक नया पूर्व ठंडा 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब सतह पर तैरनेवाला (WCE के लिए इसी) स्थानांतरण। सभी समय पर बर्फ पर WCE रखें।
  7. ऐसे ब्रैडफोर्ड आधारित प्रोटीन परख 26 के रूप में lysis बफर के साथ संगत किसी भी प्रोटीन की मात्रा का ठहराव प्रक्रिया का उपयोग कर प्रोटीन यों।

उच्च संकल्प एसडीएस पृष्ठ से WCE 3. संकल्प

  1. तीन denaturing वैद्युतकणसंचलन जैल तैयार करें।
    1. का पता लगाने के लिए(1 37.5), 375 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.8 (आरटी), 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस IRF3 रूपों, 7.5% एक्रिलामाइड / बीआईएस acrylamide से बना एक जुदाई जेल के साथ 16 सेमी लंबाई की एक न्यूनतम के दो जैल डालना ), 1% अमोनियम persulfate और 0.1% DDH 2 हे में TEMED और 4% एक्रिलामाइड से बना एक स्टैकिंग जेल, 62.5 मिमी Tris एचसीएल 6.8 पीएच (आरटी), 0.05% एसडीएस, 1% अमोनियम persulfate और 0.1% DDH 2 में TEMED ओ
      चेतावनी! एक्रिलामाइड, TEMED और एसडीएस विषाक्त और / या अड़चन हैं। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनते हैं और एक धूआं हुड के तहत हेरफेर।
    2. सेव प्रोटीन का पता लगाने के लिए, जुदाई जेल में 12% एक्रिलामाइड होता है, सिवाय इसके कि 3.1.1 में वर्णित जेल करने के लिए इसी तरह की विशेषताओं के साथ 8.5 सेमी लंबाई की एक न्यूनतम से एक जेल डालना।
  2. 1 जोड़कर 2.6 चरण में प्राप्त WCE denature: 4 (वी / वी) 5x लोडिंग बफर (125 मिमी Tris एचसीएल 6.8 पीएच (आरटी), 10% एसडीएस, 20% (पी / वी) ग्लिसरॉल, 0.0005% bromophenol नीले और 100 डिग्री पर हीटिंग द्वारा पीछा DDH 2 ओ में 25% β-mercaptoethanol)10 मिनट के लिए सी। त्वरित स्पिन नलियों टोपी में है कि रूपों संक्षेपण नीचे लाने के लिए।
    चेतावनी! β-mercaptoethanol साँस लेना द्वारा विषैला होता है। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनते हैं और एक धूआं हुड के तहत हेरफेर।
  3. पलायन तंत्र में जैल माउंट। 25 मिमी Tris आधार, 0.1% एसडीएस और आसुत जल में 192 मिमी ग्लाइसिन (DH 2 हे) युक्त बफर चलाने के साथ ऊपरी और निचले कक्षों भरें।
  4. लोड हर 16 सेमी जेल के एक कुएं में आणविक वजन मानक के 14 μl और 8.5 सेमी जेल के एक कुएं में आणविक वजन मानक के 7 μl। IRF3 रूपों का पता लगाने के लिए कदम 3.1.1 में तैयार दो जैल के प्रति अच्छी तरह से विकृत WCE का भार 30 ग्राम (3.2 चरण में वर्णित के रूप में तैयार)। लोड 8 - सेव विश्लेषण के लिए कदम 3.1.2 में तैयार जेल पर अच्छी तरह से प्रति विकृत WCE की 10 माइक्रोग्राम (3.2 चरण में वर्णित के रूप में तैयार)।
  5. पलायन सामने जेल के नीचे पहुंचता है जब तक 30 मा निरंतर वर्तमान में जैल चलाएँ।
    नोट: प्रवासन आम तौर पर approxima रहता हैtely एक 16 सेमी जेल के लिए 3 घंटा और एक 8.5 सेमी जेल के लिए 45 मिनट।
  6. Nitrocellulose झिल्ली (5 कदम) पर स्थानांतरित करने के लिए आगे बढ़ें।

मूल पृष्ठ से IRF3 dimerization की 4. विश्लेषण

नोट: इस विधि को मूल रूप से डा टी फुजिता 27 के समूह द्वारा वर्णित किया गया था।

  1. (-) और निचले (+) चैम्बर वैद्युतकणसंचलन बफ़र्स ऊपरी तैयार करें। ऊपरी सदन बफर DDH 2 ओ में 25 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.4 (आरटी), 192 मिमी ग्लाइसिन और 1% सोडियम deoxycholate (डॉक्टर) के होते हैं निचले सदन बफर DDH 2 ओ में 25 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.4 (आरटी) और 192 मिमी ग्लाइसिन शामिल
    नोट: ऊपरी और निचले सदन वैद्युतकणसंचलन बफ़र्स उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। हालांकि, वे वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन से पहले आरटी के लिए पूर्व गरम कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
  2. 375 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.8 (आरटी), 1% बारूद: 7.5% एक्रिलामाइड / बीआईएस acrylamide (1 37.5) युक्त 8.5 सेमी लंबाई की एक न्यूनतम के एक गैर denaturing के समाधान जेल डालोDDH 2 ओ में TEMED nium persulfate और 0.1%
  3. बर्फ पर 30 मिनट के लिए 40 मा निरंतर वर्तमान में जेल प्री-चलाते हैं। लगभग निचले सदन वैद्युतकणसंचलन बफर के स्तर तक बर्फ में चल तंत्र दबाएं। यह जेल बर्फ में नहीं है कि महत्वपूर्ण है।
  4. 1 (वी / वी) DDH 2 में 125 मिमी Tris एचसीएल 6.8 पीएच (आरटी), 30% ग्लिसरॉल और 0.1% bromophenol नीले युक्त ओ: पूर्व चलाने के दौरान, WCE 2x देशी-पेज लोड हो रहा बफर 1 के साथ बर्फ पर रखा मिश्रण
  5. लोड 8 - तुरंत पूर्व चलाने के अंत में (कदम 4.4 में वर्णित के रूप में तैयार) 10 माइक्रोग्राम WCE।
  6. पूर्व रन के लिए ऊपर वर्णित के रूप में प्रवास सामने जेल (लगभग 40 मिनट) के नीचे पहुंचता है, जब तक बर्फ पर 25 मा निरंतर वर्तमान में जेल चला।

IRF3 प्रजाति की 5. immunoblot विश्लेषण

  1. DDH 2 ओ में 25 मिमी Tris आधार और 192 मिमी ग्लाइसिन युक्त हस्तांतरण बफर तैयार सर्द उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरण बफर।
  2. Nitrocellulose झिल्ली के गीले तीन टुकड़े स्थानांतरण बफर युक्त प्लास्टिक / कांच के बक्से में जैल की तुलना में थोड़ा बड़ा आकार में कटौती। एक कोने में कटौती करके झिल्ली के उन्मुखीकरण का संकेत मिलता है। स्थानांतरण बफर 3 बार पुन: उपयोग किया जा सकता है। उपयोगों के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर स्टोर।
  3. Uncast जैल (एसडीएस पृष्ठ और देशी-पृष्ठ) और उचित उन्मुखीकरण के लिए प्रत्येक जेल के एक कोने में कटौती।
    1. देशी-पेज के लिए, स्थानांतरण बफर करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले डॉक्टर को दूर करने के लिए एसडीएस पृष्ठ चल बफर में कम से कम 30 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर जेल सेते हैं।
  4. 10 मिनट - 5 के लिए स्थानांतरण बफर में जैल (एसडीएस पृष्ठ और देशी पृष्ठ) सेते हैं।
  5. सकारात्मक इलेक्ट्रोड (फोम पैड / फिल्टर पेपर / झिल्ली / जेल / फिल्टर पेपर / फोम पैड) की ओर झिल्ली के साथ एक हस्तांतरण कैसेट में जेल प्रति एक हस्तांतरण सैंडविच माउंट। सैंडविच की परतों के बीच में सभी बुलबुले को दूर करने के लिए सावधान रहें।
  6. सिफारिश ख के रूप में अंतरणY इस्तेमाल किया हस्तांतरण तंत्र के लिए निर्माता।
    नोट: एक घोड़ा या कक्षीय मिलाते हुए मंच पर अगले चरणों में सभी incubations और washes प्रदर्शन करना।
  7. हस्तांतरण के समय के अंत में, DDH 2 ओ में 7% एसिटिक एसिड, 40% इथेनॉल और 3% ग्लिसरॉल युक्त निर्धारण के घोल में 15 मिनट के लिए झिल्ली सेते झिल्ली धो पीबीएस में 3x 5 मिनट (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10.2 मिमी ना 2 4 HPO और 1.8 मिमी के.एच. 2 4 पीओ DH 2 हे में)।
    चेतावनी! एसिटिक एसिड विषाक्त, अड़चन और ज्वलनशील है। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें और धूआं हुड के तहत हेरफेर।
    नोट: निर्धारण समाधान के लिए कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  8. देशी-पृष्ठ झिल्ली के लिए 5.11 कदम के लिए सीधे आगे बढ़ना।
  9. DDH 2 ओ में 6.57 मिमी लाल रक्तवर्ण रंग और 1% एसिटिक एसिड युक्त लाल रक्तवर्ण रंग के घोल में 1 मिनट के लिए उन्हें incubating से पहले DH 2 हे में जल्दी से तीन एसडीएस पृष्ठ झिल्ली कुल्ला
    नोट: लाल रक्तवर्ण रंग समाधान आर किया जा सकता है कई बार eused।
  10. पृष्ठभूमि लाल रंग में दाग प्रोटीन बैंड देखने के लिए पर्याप्त सफेद है जब तक DH 2 हे में झिल्ली कुल्ला। एक पेंसिल के साथ मार्कर नोट और प्रोटीन के आसपास अतिरिक्त झिल्ली काटा। आंदोलन के तहत पीबीएस में 5 मिनट के लिए ऊष्मायन द्वारा झिल्ली Destain।
  11. अवरुद्ध समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस (पीबीएस 0.05% के बीच 20 और 5% गैर वसा शुष्क दूध युक्त पर आर टी या हे / एन पर 1 घंटे के लिए झिल्ली सेते (पीबीएस टी दूध)। में झिल्ली 3x 5 मिनट धो पीबीएस टी।
    नोट: पीबीएस टी धोने वैकल्पिक और 5% गोजातीय सीरम albumin (पीबीएस टी-बीएसए) अगले चरण में (चित्रा 1 और 1 टेबल) युक्त पीबीएस टी में पतला एंटीबॉडी आवेदन करते समय केवल सख्ती से आवश्यक है।
  12. । चित्रा 1 और 1 टेबल में विस्तृत अनुक्रमिक क्रम के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ (एसडीएस पृष्ठ और देशी-पेज से) चार झिल्ली सेते पीबीएस-टी में 5x 5 मिनट washes के प्रदर्शन करना।
"> आकृति 1
Immunoblot विश्लेषण की चित्रा 1. अनुक्रम। योजनाबद्ध विभिन्न IRF3 फॉस्फोरिलेटेड और dimeric / मोनोमेरिक रूपों का पता लगाने के लिए आवश्यक व्यक्ति एसडीएस पृष्ठ और देशी पृष्ठ जैल का वर्णन है। immunoblot प्रक्रिया में प्रत्येक जेल से उत्पन्न झिल्ली के लिए आवेदन किया एंटीबॉडी के विशिष्ट क्रम में वर्णित है। विरोधी actin एंटीबॉडी किसी अन्य विशिष्ट एंटीबॉडी लागू करने से पहले नमूने के बराबर लोड हो रहा है सुनिश्चित करने के लिए पहली बार उपयोग किया जाता है कि ध्यान दें। विरोधी actin एंटीबॉडी के साथ वैकल्पिक अनुक्रम, भी काम करता है, विरोधी phospho-IRF3 एंटीबॉडी के बाद लागू किया जा रहा है। स्ट्रिपिंग विरोधी actin और विरोधी सेव एंटीबॉडी, या विरोधी phospho-IRF3 और क्योंकि संकेतों के आकार ओवरलैपिंग के विरोधी IRF3 एंटीबॉडी के बीच के बीच किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राथमिक एंटीबॉडी घोला कमजोर पड़ने बफर ऊष्मायन माध्यमिक एंटीबॉडी टिप्पणियां
एंटी-actin 1 / 10,000 पीबीएस टी-बीएसए आरटी पर 15 मिनट एंटी माउस एसडीएस पृष्ठ के बाद का उपयोग करें
0.02% सोडियम azide की उपस्थिति में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अगर पतला antibodyies कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
एंटी IRF3-P-Ser386 1/200 पीबीएस टी-बीएसए हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर विरोधी खरगोश मूल निवासी-पृष्ठ के बाद का प्रयोग करें।
यह पतला एंटीबॉडी का पुन: उपयोग करने के लिए सिफारिश नहीं है
एंटी IRF3-P-Ser396 1 / 10,000 पीबीएस टी-बीएसए हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर एसडीएस पृष्ठ के बाद का प्रयोग करें।
यह पतला एंटीबॉडी विरोधी IRF3-P-396 भी सेल संकेतन से उपलब्ध है पुन: उपयोग करने के लिए सिफारिश नहीं है। इष्टतम कमजोर पड़ने इस एंटीबॉडी के लिए 1/1000 के रूप में परिभाषित किया गया था, लेकिन बहुत सारे के बीच भिन्न हो सकते हैं।
एंटी IRF3-P-Ser398 1 / 10,000 पीबीएस टी-बीएसए हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर विरोधी खरगोश एसडीएस पृष्ठ के बाद का प्रयोग करें। यह पतला एंटीबॉडी का पुन: उपयोग करने के लिए सिफारिश नहीं है
एंटी IRF3 पूरी लंबाई 1/7500 पीबीएस टी दूध आरटी पर 3 घंटा विरोधी खरगोश एसडीएस पृष्ठ के बाद का प्रयोग करें। एंटी IRF3 पूरी लंबाई एंटीबॉडी देशी-पृष्ठ के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह मोनोमर का पता लगाने के प्रति संवेदनशील है। 0.02% सोडियम azide की उपस्थिति में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अगर पतला एंटीबॉडी कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
एंटी IRF3-एनईएस 0.5 ग्राम / मिलीलीटर पीबीएस टी दूध आरटी पर 3 घंटा विरोधी खरगोश मूल निवासी-पृष्ठ के बाद का प्रयोग करें। 0.02% सोडियम azide की उपस्थिति में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अगर पतला antibodyies कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
एंटी सेव 1 / 14,000 पीबीएस टी-बीएसए आरटी पर 3 घंटा विरोधी खरगोश एसडीएस पृष्ठ के बाद का प्रयोग करें। 0.02% सोडियम azide की उपस्थिति में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अगर पतला antibodyies कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
नोट: एचआरपी-युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए प्रयोग किया जाता है कमजोर पड़ने और बफर यह एक कंपनी से दूसरे से भिन्न होता है के रूप में अनुकूलित करने की आवश्यकता।

एंटीबॉडी की तालिका 1. विनिर्देशों immunoblotting प्रक्रिया में इस्तेमाल किया।

  1. (मानव संसाधन हॉर्सरैडिश peroxidase साथ झिल्ली सेतेपी) चित्रा 1 और 1 टेबल में विस्तृत रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित। पूरी तरह से बीच के निशान को दूर करने के लिए झिल्ली पीबीएस में 2x 5 मिनट के द्वारा पीछा पीबीएस-टी में 5x 5 मिनट, धो लें।
  2. पूरी तरह से झिल्ली को कवर करने के लिए पर्याप्त बढ़ाया chemiluminescence अभिकर्मक की मात्रा में 1 मिनट के लिए झिल्ली सेते हैं। फिल्टर पेपर का उपयोग झिल्ली सूखी।
  3. Immunoreactive बैंड कल्पना करने के लिए एक luminescent छवि विश्लेषक में झिल्ली रखें।
    1. वैकल्पिक रूप से, संवेदनशील एक्स-रे की फिल्मों का उपयोग कर immunoreactive बैंड का पता लगाने प्रदर्शन करते हैं।
  4. पीबीएस में 5 मिनट के लिए 3x झिल्ली धो लें।
    नोट: इस चरण में झिल्ली सूखा रखा जा सकता है। आगे स्ट्रिपिंग की आवश्यकता है हालांकि, अगर यह झिल्ली सूखने से पहले स्ट्रिपिंग प्रदर्शन करने के लिए बेहतर है। झिल्ली भी पीबीएस में अल्पकालिक के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  5. एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बीच अलग करना आवश्यकता नहीं है कि झिल्ली के लिए कदम के लिए सीधे आगे बढ़ना (चित्रा 1 देखें)5.20।
  6. अलग करना एंटीबॉडी, 50 डिग्री सेल्सियस पर DDH 2 हे में 2% एसडीएस, 62.5 मिमी Tris एचसीएल 6.8 पीएच (आरटी) और 0.7% β-mercaptoethanol युक्त पूर्व गर्म अलग करना समाधान में झिल्ली सेते (चित्रा 1 देखें) के बीच आवश्यक है, जब नियमित रूप से आंदोलन के तहत 20 मिनट के लिए। पीबीएस में 5 मिनट के लिए 3x झिल्ली धो लें।
    नोट: अलग करना प्रक्रिया के दौरान आंदोलन की कुंजी है। स्ट्रिपिंग एक संकरण ओवन में किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक पानी के स्नान में प्लास्टिक की थैलियों में बंद है और डूब झिल्ली का प्रयोग किया जा सकता है अलग करना। गर्मी के दौरान 5 बार - इस मामले में, यह झिल्ली 4 आंदोलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  7. पीबीएस टी दूध में 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन पर 1 घंटे के लिए झिल्ली सेते हैं।
  8. दोहराएँ चित्रा 1 के अनुसार 5.12-5.16 कदम।

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Representative Results

चित्रा 2 उच्च संकल्प एसडीएस पृष्ठ से WCE के संकल्प के बाद Ser396 और Ser398 के खिलाफ IRF3 कुल एंटीबॉडी और IRF3-phosphospecific एंटीबॉडी के साथ पाया IRF3 का एक विशिष्ट immunoblot छवि को दर्शाता है। Unstimulated A549 कोशिकाओं में, IRF3 50 पर दो बैंड और गैर phosphorylated (प्रपत्र आई) के लिए इसी एसडीएस पृष्ठ पर 53 केडीए और hypophosphorylated (फार्म द्वितीय) IRF3 की प्रजाति के रूप में पाया जाता है। एक समय पर निर्भर पारी में 9 घंटा परिणाम धीरे-धीरे मैं रूपों से अच्छी तरह से प्रतिष्ठित हैं और द्वितीय जो hyperphosphorylated रूपों तृतीय और चतुर्थ, पलायन करने के लिए - A549 कोशिकाओं का एक्सपोजर 3 के लिए सेव करने के लिए। hyperphosphorylated बैंड केडीए 55-57 पर आ जाते हैं। रूपों तृतीय और चतुर्थ भी विशेष रूप से Ser396 और Ser398 के खिलाफ phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग immunodetected कर रहे हैं। actin के immunodetection गलियों के बीच बराबर लोडिंग के एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। सेव संक्रमण का एक नियंत्रण वायरस न्युक्लियोकैप्सिड पी के संचय से दिखाया गया है60 केडीए पर migrates जो rotein (एन),।

चित्रा 3 में, IRF3 का पता लगाने की प्रोफाइल दिखाया गया है विरोधी IRF3-एनईएस एंटीबॉडी और Ser386 के खिलाफ phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot द्वारा पीछा मूल निवासी पृष्ठ से सुलझाया WCE से प्राप्त की। Unstimulated A549 कोशिकाओं में, IRF3 मोनोमेरिक प्रपत्र को इसी एक एकल बैंड के रूप में पाया जाता है। 3 के लिए सेव साथ संक्रमण पर - 9 घंटा, IRF3 की dimeric रूप से मेल खाती है कि एक धीरे-धीरे पलायन कर बैंड के एक सहवर्ती संचय के साथ IRF3 मोनोमर कमी का स्तर। Ser386 के खिलाफ phosphospecific एंटीबॉडी केवल IRF3 डिमर प्रजातियों का पता लगा।

चित्र 2
अलग IRF3 फॉस्फोरिलेटेड प्रजाति की चित्रा 2. जांच (प्रपत्र मैं-चतुर्थ)। A549 कोशिकाओं में सेव संक्रमण से प्रेरित A549 कोशिकाओं इंडिका के लिए सेव साथ असंक्रमित छोड़ दिया है या संक्रमित थेटेड बार। WCE विरोधी IRF3-Ser396 (आईआरएफ-3-पी-Ser396) का उपयोग immunoblot (आईबी) द्वारा पीछा उच्च संकल्प एसडीएस पृष्ठ और विरोधी IRF3-Ser398 (आईआरएफ-3-पी-Ser398) phosphospecific एंटीबॉडी और विरोधी द्वारा विश्लेषण किया गया -IRF3 पूरी लंबाई प्रोटीन एंटीबॉडी। संक्रमण विरोधी सेव एंटीबॉडी का उपयोग नजर रखी थी (न्युक्लियोकैप्सिड एन प्रोटीन दिखाया गया है)। विरोधी actin एंटीबॉडी एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा A549 कोशिकाओं में सेव करके फॉस्फोरिलेटेड / dimerized IRF3 प्रेरण 3. निगरानी। A549 कोशिकाओं संकेत समय के लिए असंक्रमित छोड़ दिया है या SEV से संक्रमित थे। WCE विरोधी IRF3-Ser386 (आईआरएफ-3-पी-Ser386) phosphospecific एंटीबॉडी और विरोधी IRF3-एनईएस antib का उपयोग कर देशी-पृष्ठ से सुलझाया और immunoblot से पता चला रहे थेodies। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम यहाँ वर्णन प्रोटोकॉल IRF3 की dimeric / मोनोमेरिक और phosphoforms मैं-चतुर्थ भेद करने के लिए कई phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए मिलकर उच्च संकल्प एसडीएस पृष्ठ और देशी-पेज का एक संयोजन के होते हैं। इन IRF3 प्रजातियों के उपयुक्त पता लगाने के लिए पूरी तरह से एक विशिष्ट सेटिंग में IRF3 सक्रियण को चिह्नित करने के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, सक्रिय मैक्रोफेज की एलपीएस उत्तेजना एक hypophosphorylated (फार्म द्वितीय) दर्शाती है कि dimeric, Ser396 / 398 फॉस्फोरिलेटेड IRF3 के गठन की ओर जाता है, लेकिन एसडीएस पृष्ठ 15 में (फार्म तृतीय और चतुर्थ), पैटर्न hyperphosphorylated नहीं। वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, इस प्रोफाइल Ser386 और Ser396 फास्फोरिलीकरण 10 के अलावा अतिरिक्त Ser339 फास्फोरिलीकरण की आवश्यकता है कि वायरस प्रेरित hyperphosphorylated रूपों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, यह भी dimerization दिखा रहे हैं, लेकिन transcriptionally 10 सक्रिय हैं नहीं है कि Ser396 फॉस्फोरिलेटेड प्रजातियों के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। आईएमportantly, यह IRF3 phosphoforms के रूप मैं-चतुर्थ पैटर्न मानव IRF3 के लिए आवेदन किया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। Murine IRF3 केवल एसडीएस पृष्ठ के बाद immunoblot में phosphospecific एंटीबॉडी के उपयोग के द्वारा और देशी पृष्ठ से एक समान पैटर्न और इसलिए IRF3 के सक्रियण विशेषता है प्रदर्शन नहीं करता है।

एसडीएस पृष्ठ से IRF3 के विशिष्ट फॉस्फोरिलेटेड प्रजातियों में से एक उच्च संकल्प जुदाई की उपलब्धि विशिष्ट मानकों की आवश्यकता है। उचित समाधान के लिए, यह 16 सेमी की एक न्यूनतम लंबाई है कि जैल का उपयोग करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यहाँ तक कि जुदाई जेल के इस लंबाई के साथ, यह प्रवास सामने अलग IRF3 रूपों में से एक उचित जुदाई प्राप्त करने के लिए जेल के नीचे तक पहुँचने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, स्टैकिंग जेल अच्छी तरह से परिभाषित बैंड प्राप्त करने के लिए कंघी नीचे 1 सेमी की एक न्यूनतम करने के लिए विस्तार करना चाहिए। IRF3 की hyperphosphorylated रूपों को एक दूसरे के बहुत करीब विस्थापित के रूप में यह महत्वपूर्ण है। खराब ध्यान केंद्रित बैंड phosphoryla के बीच भेद की कमी में परिणाम होगाटेड उनके संबंधित मात्रा का ठहराव आई रूपों। इसके अतिरिक्त, अमोनियम persulfate और TEMED की एकाग्रता एक एसडीएस पृष्ठ प्रोटोकॉल से दूसरे बदलती हैं। यहाँ संकेत वालों से इन सांद्रता में परिवर्तन में महत्वपूर्ण IRF3 प्रजातियों की जुदाई में संकल्प क्षीण पाया गया।

देशी-पृष्ठ के माध्यम से IRF3 डिमर गठन की जांच मूल रूप से डा टी फुजिता के समूह द्वारा वर्णित किया गया था। इस प्रोटोकॉल P300 सीबीपी / 27 से IRF3 डिमर की हदबंदी की अनुमति देता है कि बफर युक्त डॉक्टर का उपयोग करता है। यह अत्यधिक तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर WCE के भंडारण के रूप में सेल के बाद देशी-पृष्ठ पर आगे बढ़ने के लिए सिफारिश की है IRF3 मोनोमर / डिमर अनुपात का एक महत्वपूर्ण परिवर्तन में परिणाम के लिए मिला था। इसके अतिरिक्त, यह ऊपरी और निचले सदन बफ़र्स के पीएच आरटी पर पीएच 8.4 के लिए निकाला जाता है, और न 4 डिग्री सेल्सियस पर, सभी घटकों के मिश्रण के बाद डिमर बनाम मोनोमर के समुचित जुदाई को प्राप्त करने के लिए है कि बहुत महत्वपूर्ण है। अलगाव8.5 सेमी की एक न्यूनतम लंबाई के साथ जेल IRF3 मोनोमर और डिमर का उचित जुदाई की अनुमति देता है। नमूना प्लस लोडिंग बफर की आदर्श मात्रा मात्रा कम से कम रखा जाता है जब संकल्प बेहतर है और साथ ही एक 5 मिमी के लिए लगभग 8 μl है। इस प्रकार, यह एक उच्च एकाग्रता के साथ WCE प्राप्त करने के लिए lysis बफर के सबसे कम मात्रा का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, यह कुशल प्रोटीन निकासी के लिए कम से कम सेल गोली की मात्रा 5x में सेल की आवश्यकता है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए। नमूनों की मात्रा ऊपर संकेत सीमा से अधिक है, तो यह मोनोमर / डिमर के गरीब संकल्प पर नतीजा होगा। इस DDH 2 ओ में TEMED 4% एक्रिलामाइड, 62.5 मिमी Tris एचसीएल 6.8 पीएच (आरटी), 1% अमोनियम persulfate और 0.1% से युक्त एक स्टैकिंग जेल जोड़कर हल किया जा सकता यह बैंडिंग परेशान बिना नमूने लोड करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। अच्छी तरह से नीचे करने के लिए एक जेल लोडिंग टिप करीब के साथ धीरे-धीरे लोड हो रहा है बहुत अच्छा परिणाम देता है।

यहाँ, हम वर्णन इन विवो देतेSer386 9, Ser396 19 और Ser398 15 के खिलाफ वर्तमान में उपलब्ध phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग विशिष्ट अवशेषों पर फास्फोरिलीकरण की ction। IRF3 म्यूटेंट और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग इन अवशेषों वायरस के संक्रमण या IKKε / TBK1 kinases की overexpression पर फॉस्फोरिलेटेड हैं और IRF3 सक्रियण 6,9,10,19,21 के लिए महत्वपूर्ण हैं पुष्टि की है कि विश्लेषण करती है। एसडीएस पृष्ठ के बाद phospho-Ser396, phospho-Ser398 और कुल IRF3 की immunodetection दो समान जैल (चित्रा 1) के उपयोग की आवश्यकता है। Phosphospecific एंटीबॉडी झिल्ली के स्ट्रिपिंग के बाद इस्तेमाल किया जाता है जब वास्तव में, संवेदनशीलता के महत्वपूर्ण नुकसान मनाया जाता है। इसलिए, यह अत्यधिक पहले phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। वैकल्पिक प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी भी काम कर सकते हैं कि ध्यान दें, लेकिन विशिष्ट dilutions और उपयोग के अनुक्रम अनुकूलित किया जाना चाहिए। IRF3 विश्लेषण के लिए, WCE के 30 माइक्रोग्राम IRF3 की एक महत्वपूर्ण पता लगाने प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है4 मिमी चौड़ाई कुओं का उपयोग करते समय संकेत दिया एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot द्वारा फास्फोरिलीकरण। विभिन्न वायरस से संक्रमित कई प्रकार की कोशिकाओं में 30 माइक्रोग्राम प्रति उचित होना पाया गया है, इस राशि सेल प्रकार और उत्तेजना के आधार पर वृद्धि की आवश्यकता हो सकती है। यह एसडीएस पृष्ठ के लिए ताजा निष्कर्षों का उपयोग करने के लिए बेहतर है, लेकिन इस पत्र में वर्णित phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग IRF3 फास्फोरिलीकरण का पता लगाने के विश्लेषण से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर WCE के भंडारण के एक दौर की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से स्थिर है। यहाँ वर्णित फॉस्फेट अवरोधकों की सांद्रता A549 कोशिकाओं का उपयोग करते समय पर्याप्त होना पाया गया है। उच्च सांद्रता बेहतर परिणाम के लिए नहीं पाए गए। हालांकि, इन सांद्रता उच्च फॉस्फेट गतिविधि का स्तर है कि प्रदर्शन प्रकार की कोशिकाओं में IRF3 सक्रियण का अध्ययन करते समय बढ़ाये जाने की जरूरत हो सकती है। महत्वपूर्ण बात है, IRF3 के फोस्फोराइलेशन और अंतर्निहित तंत्र अभी भी दूर समझा जा रहा से हैं। इसलिए, सर्विसेज / Thr- और Tyr-फॉस्फेट का एक पूरा पैनल मेंhibitors IRF3 फास्फोरिलीकरण, dimerization और गिरावट का पता लगाने को प्रभावित कर सकता है कि संभव अभी तक uncharacterized गतिविधियों ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सबसे वायरस के संक्रमण के बाद और सबसे प्रकार की कोशिकाओं में IRF3 मोनोमर और डिमर का पता लगाने के लिए, 8-10 ग्राम WCE पर्याप्त हो पाया था। हालांकि, प्रोटीन की उच्च राशि कम कुशलता IRF3 को सक्रिय उत्तेजना के लिए आवश्यक हो सकता है। इस अध्ययन में इस्तेमाल Ser386 के खिलाफ phosphospecific एंटीबॉडी एसडीएस पृष्ठ denaturing में संवेदनशीलता के रूप में देशी-पृष्ठ में इस्तेमाल किए जाने की सिफारिश कर रहे हैं बहुत कमजोर है। इसके अलावा, Ser386 पर फास्फोरिलीकरण इस प्रकार एक विशिष्ट सेटिंग में इस अवधारणा की पुष्टि करने के लिए देशी-पृष्ठ में इन एंटीबॉडी के उपयोग के लिए एक उपयुक्त रणनीति बना रही है, IRF3 9 की dimeric प्रपत्र के साथ संबंध स्थापित करने का प्रस्ताव है। ध्यान से, वैकल्पिक एंटीबॉडी विभिन्न कंपनियों से उपलब्ध हैं और कुशलता से एसडीएस पृष्ठ के बाद phospho-Ser386 पता लगाने के लिए दावा कर रहे हैं। Ser396 के खिलाफ Phosphospecific एंटीबॉडी भी कुशलता से यू किया गया हैदेशी-पेज 20 के बाद IRF3 फास्फोरिलीकरण पता लगाने के लिए sed। महत्वपूर्ण बात है, phosphoacceptor साइटों के सी टर्मिनल क्लस्टर में Ser402 भी IKKε / TBK1-phosphorylated IRF3 10,21,28 के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से मनाया गया IRF3 सक्रियण और Ser402 के फोस्फोराइलेशन के लिए महत्वपूर्ण हो पाया था। हालांकि, दो अलग-अलग प्रयास (एनजी, अप्रकाशित) के बावजूद कोई phosphospecific एंटीबॉडी विवो में इस विशिष्ट अवशेषों की फास्फोरिलीकरण पालन करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध हैं। Thr157 और Ser339 के खिलाफ है कि phosphospecific एंटीबॉडी भी 11,13 वर्णित किया गया है ध्यान दें। इन अतिरिक्त phosphospecific एंटीबॉडी यहाँ वर्णित एक के समान उच्च संकल्प एसडीएस पृष्ठ की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, अतिरिक्त बड़े एसडीएस पृष्ठ जैल प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए आवश्यक है और जेल # 2 (चित्रा 1) के रूप में एक ही तरह से संसाधित किया जाएगा। हमारे ज्ञान करने के Ser173 या Thr390 के खिलाफ कोई phosphospecific एंटीबॉडी अभी तक वर्णित किया गया है,लेकिन वे आसानी से वे 14,20 उपलब्ध हो जाते हैं एक बार यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा जा सकता है।

IRF3 गतिविधि hyperphosphorylated रूपों 11,17 के एंटीबॉडी की मध्यस्थता गिरावट से समाप्त होता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल भी उत्तेजना की गतिज लंबे समय तक है और एंटीबॉडी अवरोधकों (MG132, lactacystin या bortezomid) के उपयोग के लिए युग्मित है जब IRF3 गिरावट की निगरानी के लिए परमिट। आमतौर पर, A549 कोशिकाओं में 40 हाओ पर सेव से संक्रमित / 10 6 कोशिकाओं, IRF3 फास्फोरिलीकरण जैसे ही 2 घंटा के बाद सेव संक्रमण और IRF3 गिरावट 12 घंटे के बाद शुरू होता है के रूप में शुरू होता है। एंटीबॉडी की मध्यस्थता गिरावट एंटीबॉडी अवरोधकों के साथ की स्थिति में उलट है कि देर से समय बिंदुओं पर रूपों तृतीय और चतुर्थ स्तर की मनाया कमी से संपन्न हो जाएगा। यह भी एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला उपचार 29 पर बरामद कर रहे हैं कि IRF3 डिमर स्तर की एक कमी में देशी पृष्ठ पर अनुवाद करेंगे। महत्वपूर्ण बात है, उच्च संकल्प तकनीककुए यहाँ प्रस्तुत गिरावट प्रक्रिया और सक्रियण की कमी के बीच फर्क की अनुमति देता है। दरअसल, दोनों क्षरण और डिमर / phospho-Ser386 / 396 का पता लगाने के अभाव में IRF3 परिणाम की सक्रियता की कमी है। IRF3 30 अपमानित किया जाता है, जब इन IRF3 प्रजातियों का पता नहीं कर रहे हैं, हालांकि, जबकि सक्रियण की कमी है, मैं और द्वितीय IRF3 मोनोमर का पता लगाने के साथ और रूपों की जुड़ा हुआ है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित विश्लेषण के साथ युग्मित Immunoprecipitation अलग स्थलों पर IRF3 के vivo फास्फोरिलीकरण पता लगाने के लिए पसंद का एक तरीका है। इस तकनीक Ser173, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 पर IRF3 के फोस्फोराइलेशन पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और Ser402 10,20,21 अवशेष। हालांकि, मास स्पेक्ट्रोमेट्री आसानी से विभिन्न बिंदुओं पर समय कई stimulations निम्नलिखित IRF3 सक्रियण के दैनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक किफायती / benchside तकनीक अभी तक नहीं है। इसलिए, प्रक्रिया देशी-पीएजी करने के लिए मिलकर एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर यहाँ वर्णितकुल और phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot के साथ संयोजन में ई actived IRF3 के सभी वर्तमान में परिभाषित रूपों का पता लगाने के लिए एक व्यावहारिक, सस्ती और संवेदनशील दृष्टिकोण का गठन किया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
F12/Ham Life Technologies 11765-054 Warm in a 37 °C bath before use.
Fetal bovine serum Life Technologies 12483-020
L-glutamine Life Technologies 25030-081
D-PBS Life Technologies 14190-144 For cell culture.
Trypsin/EDTA 0.25% Life Technologies 25200-072
Sendai virus Cantell Strain Charles River Laboratories 600503
Hepes Bioshop HEP001
Sodium chloride (NaCl) Bioshop SOD001.5
EDTA Bioshop EDT001
Glycerol Bioshop GLY001.1 Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I7771 Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent
Leupeptin Bioshop LEU001
Aprotinin Bioshop APR600.25 
Sodium fluoride Sigma-Aldrich 201154
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C.
p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich P1585
Beta-Glycerophosphate Sigma-Aldrich G6376 
Bio-Rad Protein Assay Reagent  Bio-Rad 500-0006  Cytotoxic
Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% Bioshop ACR005  Cytotoxic
Tris-Base Bioshop DEO701
Hydrochloric acid (HCl) LabChem LC15320-4  Work under fume hood. Toxic and irritant.
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Bioshop SDS001.1  Irritant.
Amonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
TEMED Invitrogen 15524-010 Toxic and irritant.
Bromophenol blue Fisher Scientific B392-5
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system.
Glycine Bioshop GLN001.5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium hydroxide (NaOH) Bioshop SHY700  Irritant.
Nitrocellulose membrane (0.45 mm) Bio-Rad 162-0115
Acetic acid glacial Bioshop ACE222.4 Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable.
Red ponceau Sigma-Aldrich P3504  
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911  For PBS composition for immunoblot.
Na2HPO4 Bioshop SPD307.5 For PBS composition for immunoblot.
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662  For PBS composition for immunoblot.
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 For PBS-T-BSA composition for immunoblot.
Non-fat dry milk Carnation
Poly sorbate 20 (Tween) MP Biomedicals 103168 Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.
Anti-IRF-3-P-Ser386 IBL-America 18783 Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw.
Anti-IRF-3-P-Ser396 Home made19 Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw.
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) Cell Signaling Technology 4947s Store at -20 oC.
Anti-IRF-3-P-Ser398 Home made15 Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw.
Anti-IRF-3-full length Actif motif 39033 Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw.
Anti-IRF3-NES IBL-America 18781 Store aliquoted at -20 oC.
Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus Perkin-Elmer Life Sciences NEL104001EA
LAS4000mini CCD camera apparatus GE healthcare
SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range Bio-Rad 161-0317 Store aliquoted at -20 oC.

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References

  1. Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
  2. Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
  3. Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
  4. Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
  5. Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
  6. Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
  7. Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
  8. Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
  9. Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  10. Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
  11. Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
  12. Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
  13. Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
  14. Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
  15. Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
  16. Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
  17. Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
  18. Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
  19. Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
  20. Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
  21. Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
  22. Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
  23. McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
  24. Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
  25. Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  28. tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
  29. Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
  30. Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 107 IRF3 इंटरफेरॉन सहज प्रतिरक्षा एंटीवायरल फास्फोरिलीकरण एसडीएस पृष्ठ देशी-पेज dimerization उच्च संकल्प phosphospecific एंटीबॉडी immunoblot वायरस के संक्रमण।
एक उच्च संकल्प विधि IRF3 के फोस्फोराइलेशन निर्भर एक्टिवेशन नजर रखने के लिए
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Robitaille, A. C., Mariani, M. K.,… More

Robitaille, A. C., Mariani, M. K., Fortin, A., Grandvaux, N. A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3. J. Vis. Exp. (107), e53723, doi:10.3791/53723 (2016).

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