Introduction
遍在的および構成的に発現する転写因子、インターフェロン（IFN）調節因子3（IRF3）は、主に、IFNβの誘導により、病原体に対する防御の最初の行のために重要であるが、また、ケモカイン（CCモチーフ）の誘導リガンド5（CCL5を通じて）およびIFNにより誘導されるタンパク質を含むいくつかの抗ウイルスタンパク質テトラトリコペプチドとは、IFIT1 / 2/3 1〜3を繰り返します。またはリポポリサッカライド（LPS）4：IRF3の活性化は、多数のウイルスの感染、またはポリイノシン-ポリシチジル酸（CポリI）への曝露後に報告されています。重要なことは、ほとんど研究されたウイルスは、IRF3媒介応答を回避し、それによって宿主自然免疫防御5をエスケープする機構を進化させてきました。したがって、IRF3の活性化を監視する先天的抗ウイルス宿主防御の分子機構を理解するだけでなく、この応答に対抗するためにウイルスによって使用される戦略を同定するために非常に重要です。
ENT ">多くの公表された報告は、しかしながら、低解像度のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に結合IRF3標的遺伝子誘導のモニタリング（IFNB1およびIFIT1）によって実行IRF3の活性化および/ またはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの限定された分析を提供します（SDS- PAGE）IRF3の解析が、多数の生化学的研究は、様々なIRF3の変異体及びIRF3結晶構造6-11の解明の挙動の解析がでリン酸化により逐次翻訳後修飾の複雑なセットを施すことがIRF3を確立するために貢献しています複数のサイト。IRF3の活性化に関与するリン酸化のセットは、細胞型に刺激に依存して、最も可能性が高いと思われる。非感染細胞では、IRF3は1で、Thr135およびSer173を含むphosphoresiduesを含む非リン酸化および低リン酸化種として共存-198 AAのN末端 領域6,12-14。この低リン酸化Fの蓄積IRF3のORMは、ストレス誘導物質、成長因子およびDNA損傷剤6によって誘導されます。細胞型に依存した方法で15〜17℃またはLPS：トランス活性化ドメインを含むIRF3のC末端領域におけるセリン/スレオニン残基のリン酸化は、ウイルス、ポリIによる活性化、次のトリガされます。 IRF3のC末端のリン酸化は、それぞれが二量体化、核蓄積、CREBとの会合を通じてIRF3の活性化に寄与することを二つの主クラスタ、Ser385 / Ser386およびSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405、で編成一切7未満の異なるホスホサイトを伴いません-結合タンパク質（CBP）/ P300の活性化補助因子、敏感な応答要素（ISRE）コンセンサス配列と標的遺伝子9,10,17-19のトランスをIFNするDNA結合。 Thr390のリン酸化はまた、ウイルス誘導IRF3の活性化20に寄与していると考えられます。質量分析は、Ser386、Thr390、Ser396およびSer402残基が直接phosphorylatであることを実証したIRF3の分析κBキナーゼεの阻害剤（IKKε）によりED / TANK結合キナーゼ1（TBK1）は9,10キナーゼ。 C末端残基でのリン酸化はまた、ポリユビキチン化およびプロテアソーム媒介分解10を介してIRF3活性化の終了のために必要とされます。このプロセスは、プロピルイソメラーゼPin1が10,11の募集のために必要であるSer339でのリン酸化に依存します。少なくともリン酸化Ser339 / 396分の386残基を含むIRF3種は、高リン酸化形態と考えられています。各サイトの正確な配列および機能が議論10,21の問題のまま。それは活性化したIRF3が均一な状態を表すものではありませんが、個別のリン酸化または二量体化特性を示す、異なる活性種が10,22に存在することが明らかです。特定の病原体に応答して、IRF3の活性化の完全な理解を提供するために、それをCHする必要がありますaracterize活性種の誘導されます。 IRF3標的遺伝子、IFNB1およびIFIT1の誘導は、IRF3の活性化のための信頼性の高い読み出しを提供するように証明されています。しかし、これらの遺伝子の発現をモニターすることは、IRF3の異なる活性化状態を区別しません。特定の設定でIRF3活性化状態の包括的な分析は、そのリン酸化および二量体化状態10の詳細な特性に依存しています。非リン酸化（形態I）は、（フォームII）及び過低リン酸化（形態IIIおよびIV）IRF3形態6,18,23が正常に高解像度のSDS-PAGE分析を小さく移動度によって解決することができます。単量体および二量体IRF3種を効率的にネイティブPAGE分析によって同定することができます。異なるIRF3のホスホ部位に対して向けリン酸化特異的抗体と組み合わせて使用した場合、これらのアプローチは、大幅に改善されます。
標準的なプロトコルは、貧しい人々の解像度を可能にします明確なIRF3リン酸化型の効率的な分離を許可しないタンパク質です。ここでは、詳細に合計とリン酸化抗体を用いたイムノブロットとの組み合わせでネイティブ-PAGEに結合されたSDS-PAGEを使用して、個別のウイルス活性化IRF3種の誘導を監視するための最高の解像度を達成するための手順が記載されている。アクティブに異なるとの間で生体差別IRF3の形態は、SDS-PAGE上で観察され、それらの移動度シフトに基づいて行われます。また、IRF3モノマーおよびダイマーは、非変性電気泳動によって区別することができます。イムノブロットによるこれら二つの相補的な技術の組み合わせは、IRF3のリン酸化媒介活性化の完全な分析のためにすべての必要な情報を取得するための手頃な価格に敏感なアプローチであることが分かります。
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Protocol
注：プロトコルはセンダイウイルス（センダイウイルス）を感染させたA549細胞を使用してここで説明されています。しかし、SDS-PAGEおよびネイティブPAGEのためのプロトコルはまた、これまでに試験された全てのヒトおよびマウスの細胞型、さまざまなIRF3を活性化する刺激9,15,19,24,25で刺激し、特に骨髄系細胞で動作します。
A549細胞の1感染
- 10％熱不活化ウシ胎児血清（HI-FBS）と1％L-グルタミン（完全F12Kを/含む37℃/ 5％CO 2 mlの20 F12K /ハム培地で15cmのプレートに培養中のA549細胞を維持しますハム培地）。
注：細胞培養および治療のために使用されるすべてのソリューションは、無菌でなければなりません。 - 感染の24時間前に、培地を吸引し、室温で蒸留リン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）10mlで細胞を洗浄します。
- セルをカバーし、3分間37℃でインキュベートし、各プレートを0.25％トリプシン-EDTA溶液1mlを加えます。
- すぐ目のようにインキュベーションを停止しますE細胞はそっと片手でプレートをタップしてプレートから剥離し始めます。プレートあたり予備加熱し、完全なF12K /ハム培地10mlを加えることによって、トリプシンを不活性化し、15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移します。
- RTで3分間350×gで遠心します。上清を除去し、均質な単一細胞懸濁液を得るために、完全なF12K /ハム培地8mlに細胞ペレットを再懸濁します。
- 血球計数器を用いて細胞を数えます。予備加熱し、完全なF12K /ハム培地4ml中の60mmプレート当たり1×10 6細胞の密度で細胞をシード。 20後にCO 2、37℃/ 5％で24時間- - 20 24時間インキュベートし、細胞（これは1.5×10 6個の細胞に相当する）、90％のコンフルエントな単層を形成します。
- 培地を除去し、無血清F12K /ハム培地2ml（SFM）で細胞を洗浄。 60ミリメートルプレートあたりの新鮮なSFMの2ミリリットルを追加します。
- 簡単に氷と渦に（-80℃で分注し）センダイウイルス（SeVを）のアリコートを解凍します。
- 目を希釈予熱されたSFMの電子ウイルスは、60 HAU / 100μLを得ました。ダウンそっとピペッティングにより混合し、40 HAU / 10 6個の細胞で感染を行うために、プレートあたりの希釈したウイルスの100μlを添加します。非感染対照プレートにウイルスを追加しないでください。
- 37℃/ 5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。手で3または4回プレートを撹拌、または感染の最初の1時間、インキュベーター中に直接配置自動軌道やロッキングシェーカーを使用して。
- 2時間後の感染では、10％HI-FBSの最終濃度を得るために、20％HI-FBSを含むF12K /ハム培地2mlを追加します。
- それぞれ、3,6、及び9時間の合計感染回数に到達するために追加の1、4、7時間、37℃/ 5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。これらの時点の各々で、2.1に進みます。
全細胞抽出物（WCE）の調製
- 感染培地を除去します。 1mlにこすることによって細胞を回収そして氷冷D-PBSで予め冷却1.5 mlの遠心管に細胞懸濁液を移します。
- 20秒間、4℃で16,000×gの遠心分離により細胞をペレット化し、慎重にD-PBSのすべての痕跡をデカント。
注：このステップでは、細胞ペレットを直接タンパク質抽出またはフラッシュ凍結し、液体窒素またはドライアイス/エタノール浴中で、溶解するまで-80℃で保存を行うことができます。 - 50mMのHEPES pH7.4中、150mMのNaCl、5mMのEDTA、脱イオン水中の10％グリセロール及び1％ノニデットP-40（のddH 2 O）を含有する溶解緩衝液を調製します。即席プロテアーゼ（を1μg/ mlのロイペプチンおよび2 / mlのアプロチニン）およびホスファターゼ阻害剤を追加（5ミリモルのフッ化ナトリウムを、1mmのオルトバナジン酸ナトリウム、2mMのp-ニトロフェニルリン酸および10mMβグリセロリン酸pH7.5の活性化）。
注：阻害剤なしの溶解緩衝液は4℃で保存することができます。オルトバナジン酸ナトリウムの活性化のための具体的なプロトコルは、特定の試薬/ Equipmeの表に記載されていますNT。 - 溶解緩衝液70μL中で細胞ペレットを再懸濁します。通常、溶解液の濃度は、約2μgの/μlとなります。
- 20分間氷上でインキュベートします。 15秒間液体窒素浴中でのインキュベーションにより溶解液をフラッシュ凍結。それが完全に溶融し、10秒間ボルテックスするまで、室温で溶解液を解凍します。凍結/解凍/渦サイクルを3回繰り返します。
- また、1分間エタノール/ドライアイス浴中で凍結工程を行います。
- 20分間4℃で16,000×gで遠心分離します。新しい予備冷却1.5ミリリットルの遠心チューブに上清（WCEに相当）を転送します。すべての回で氷の上でWCEをしてください。
- そのようなブラッドフォードベースのタンパク質アッセイ26などの溶解緩衝液に適合する任意のタンパク質定量の手順を使用してタンパク質を定量化します。
高解像度のSDS-PAGEによるWCEの3分解能
- 3変性電気泳動ゲルを準備します。
- 検出するための（1：37.5）、375 mMトリス塩酸pHを8.8（RT）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS IRF3形態は、7.5％アクリルアミド/ビス - アクリルアミドからなる分離ゲルと16センチメートルの長さの最小値の2つのゲルを注ぎます）、1％の過硫酸アンモニウムおよび0.1％のddH 2 OでTEMEDとのddH 2中の4％アクリルアミド、62.5 mMトリス塩酸pH6.8の（RT）、0.05％SDS、1％過硫酸アンモニウムおよび0.1％TEMEDからなるスタッキングゲルO.
注意！アクリルアミド、TEMEDおよびSDSは、毒性および/または刺激性です。保護手袋を着用し、ドラフトの下で操作します。 - センダイウイルスタンパク質の検出のために、分離ゲルは、12％のアクリルアミドを含有すること以外は、3.1.1で説明したゲルに類似の特性を有する8.5センチメートルの長さの最小の1つのゲルを注ぎます。
- 検出するための（1：37.5）、375 mMトリス塩酸pHを8.8（RT）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS IRF3形態は、7.5％アクリルアミド/ビス - アクリルアミドからなる分離ゲルと16センチメートルの長さの最小値の2つのゲルを注ぎます）、1％の過硫酸アンモニウムおよび0.1％のddH 2 OでTEMEDとのddH 2中の4％アクリルアミド、62.5 mMトリス塩酸pH6.8の（RT）、0.05％SDS、1％過硫酸アンモニウムおよび0.1％TEMEDからなるスタッキングゲルO.
- 1加えることによって、ステップ2.6において得られたWCEを変性：4（v / v）の5×ローディング緩衝液（125mMのトリス-HCl pH6.8の（RT）、10％SDS、20％（p / v）のグリセロール、0.0005％ブロモフェノールブルーおよび100℃に加熱してのddH 2 O中 25％のβメルカプトエタノール）10分間、C。クイックキャップに形成結露をダウンさせるためにチューブをスピン。
注意！ βメルカプトエタノールは、吸入による毒性があります。保護手袋を着用し、ドラフトの下で操作します。 - 移行装置にゲルをマウントします。 25mMのTris塩基、0.1％SDSおよび蒸留水で192 mMグリシン（DH 2 O）を含むバッファを実行していると、上部および下部チャンバーを埋めます。
- ロード各16センチメートルゲルの1つのウェルにおける分子量標準の14μlの8.5センチゲルの1つのウェルにおける分子量標準の7μL。 IRF3のフォームを検出するためのステップ3.1.1で調製した2つのゲルのウェルあたり変性WCE（ステップ3.2に記載のように調製）の負荷30μgの。変性WCE10μgのSeVの分析のためのステップ3.1.2で調製したゲルにウェルあたり（ステップ3.2で説明したように調製した） - 負荷8。
- 移行フロントがゲルの底に到達するまで30ミリアンペア定電流でゲルを実行します。
注：移行は、一般的にapproxima続き16センチメートルゲル8.5センチゲルのために45分間tely 3時間。 - ニトロセルロース膜（ステップ5）への転写に進んでください。
ネイティブ-PAGEによるIRF3二量体化の4.分析
注：このメソッドは、もともと博士T.藤田27のグループによって説明されました。
- （ - ）（+）と下室電気泳動バッファ上位を準備します。上部チャンバーバッファーを25mMのTris-HCl pHを8.4のddH 2 Oで（RT）、192 mMグリシンおよび1％デオキシコール酸ナトリウム（DOC）からなります下室緩衝液は25mMのトリス-HCl 8.4（RT）とのddH 2 O中で192 mMグリシンを含んでいます
注：上部および下部チャンバ電気泳動緩衝液は使用するまで4℃で保存することができます。しかし、電気泳動を行う前に、それらを室温に予め温めていることを確認してください。 - 、375 mMトリス塩酸pHを8.8（RT）、1％の弾薬：7.5％アクリルアミド/ビス - アクリルアミド（1 37.5）を含む8.5センチメートルの長さの最小の非変性分離ゲルを注ぎますddH 2 O中ニウム過硫酸および0.1％TEMED
- 氷上で30分間、40ミリアンペアの定電流でゲルを事前に実行します。約下室電気泳動バッファーのレベルに氷に走行装置を押します。これは、ゲルが氷ではないことが重要です。
- 事前実行中、WCE 1 2XネイティブPAGEローディング緩衝液で氷上に維持ミックス：1（v / v）の125mMのトリス-HCl pH6.8の（RT）、30％グリセロールとのddH 2 O中の0.1％ブロモフェノールブルーを含有します
- 負荷8 - すぐに実行前の最後で（ステップ4.4に記載のように調製）を10μgのWCE。
- 実行前のために上記のように、移行前にはゲル（約40分）の底部に到達するまで、氷上で25ミリアンペアの定電流でゲルを実行します。
IRF3種の5イムノブロット分析
- ddH 2 O中の25 mMトリス塩基および192 mMグリシンを含む転写緩衝液を準備冷蔵使用前に4℃での転送バッファ。
- 転送バッファを含むプラスチック/ガラスの箱でゲルよりも若干大きいサイズにカットし、ニトロセルロース膜のウェット三枚。 1コーナーをカットすることにより、膜の向きを示します。転送バッファを3回再利用することができます。使用の間、4℃でバッファを保存してください。
- 配役未定のゲル（SDS-PAGEおよびネイティブ-PAGE）および適切な配向のために、各ゲルの一角をカット。
- ネイティブ-PAGEのために、転送バッファに転送する前にDOCを除去するために、SDS-PAGEのランニングバッファー中で少なくとも30分間、穏やかに撹拌しながら室温でゲルをインキュベートします。
- 10分 - 5の転送バッファ内のゲル（SDS-PAGEおよびネイティブ-PAGE）をインキュベートします。
- 正電極（フォームパッド/ろ紙/膜/ゲル/ろ紙/フォームパッド）に向かって膜と転送カセット中のゲルあたりの転送サンドイッチをマウントします。サンドイッチの層の間にすべての気泡を除去するように注意してください。
- 推奨bと転送を実行Y搬送装置のためのメーカーが使用されます。
注：ロッキングまたは軌道振盪台上の次のステップですべてのインキュベーションおよび洗浄を行います。 - 転送時間の終わりに、のddH 2 O中の7％酢酸、40％エタノール、3％グリセロールを含む固定液中で15分間、膜をインキュベート膜を洗浄し、PBS中で3×5分（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMのKClを、10.2ミリモルの Na 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4のdH 2 O中 ）。
注意！酢酸は、毒性、刺激性及び可燃性です。保護手袋を着用し、ドラフトの下で操作します。
注：固定溶液は、複数回再利用することができます。 - ネイティブPAGEの膜の場合は5.11のステップに直接進みます。
- ddH 2 Oに6.57 mMの赤ポンソー、1％酢酸を含有する赤色のポンソー溶液中で1分間、それらをインキュベートする前のdH 2 Oにすばやく3 SDS-PAGE膜をすすぎます
注：赤ポンソーソリューションは、rすることができます数回eused。 - 背景が赤に染色されたタンパク質バンドを確認するのに十分な白になるまでのdH 2 Oで膜を洗浄します。鉛筆でマーカーに注意し、タンパク質の周りの余分な膜をカット。攪拌下、PBS中で5分間インキュベートすることによって膜を脱色。
- 0.05％のTween 20および5％脱脂粉乳（PBS-T-乳）を含有するブロッキング溶液（PBS中、室温でまたはO / Nで4℃で1時間、膜をインキュベートする。で膜を3回5分間洗浄PBS-T。
注：PBS-T洗浄は任意であり、次のステップで5％のウシ血清アルブミン（PBS-T-BSA）（ 図1、表1）を含有する PBS-Tで希釈した抗体を適用した場合にのみ、厳密に必要。 - 。 図1および表1に詳述順番に従って、一次抗体（SDS-PAGEおよびネイティブPAGEから）4膜をインキュベートし、PBS-Tで5回5分の洗浄を行います。
イムノブロット分析の図1のシーケンス。図に、各種IRF3リン酸化及び二量体/単量体の形態を検出するために必要な個々のSDS-PAGEおよびネイティブ-PAGEゲルを示しています。イムノブロット手順の各ゲルから得られた膜に適用される抗体の特定の順序が記述されています。抗アクチン抗体は、他の特異的抗体を適用する前に、サンプルの等しい負荷を確実にするために最初に使用されていることに注意してください。抗アクチン抗体を用いた別の配列は、また動作し、抗ホスホIRF3抗体の後に適用されます。ストリップは、抗アクチンおよび抗センダイウイルス抗体、または抗リンIRF3とための信号の大きさの重複抗IRF3抗体の間に使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 一次抗体 | 希釈 | 希釈バッファー | インキュベーション | 二次抗体 | コメント |
| 抗アクチン | 1 /万 | PBS-T-BSA | RTで15分間 | 抗マウス | SDS-PAGEの後に使用します 0.02％アジ化ナトリウムの存在下、4℃で保存した場合に希釈antibodyiesを複数回再利用することができます。 |
| アンチIRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N 4℃で | 抗ウサギ | ネイティブ-PAGEの後に使用します。 これは、希釈した抗体を再利用することは推奨されません |
| アンチIRF3-P-Ser396 | 1 /万 | PBS-T-BSA | O / N 4℃で | SDS-PAGEの後に使用します。 これは、希釈した抗体、抗IRF3-P-396はまた、細胞シグナルから入手することができる再利用することは推奨されません。最適な希釈は、この抗体のために1 /千と定義したが、ロット間で異なる場合があります。 | |
| アンチIRF3-P-Ser398 | 1 /万 | PBS-T-BSA | O / N 4℃で | 抗ウサギ | SDS-PAGEの後に使用します。これは、希釈した抗体を再利用することは推奨されません |
| アンチIRF3全長 | 1 / 7,500 | PBS-Tミルク | 室温で3時間 | 抗ウサギ | SDS-PAGEの後に使用します。抗IRF3完全長抗体は、ネイティブPAGEの後に使用することができるが、それはモノマーを検出するために感度が低いです。 0.02％アジ化ナトリウムの存在下、4℃で保存した場合に希釈された抗体は、複数回再利用することができます。 |
| アンチIRF3-NES | 0.5 / mlの | PBS-Tミルク | 室温で3時間 | 抗ウサギ | ネイティブ-PAGEの後に使用します。 0.02％アジ化ナトリウムの存在下、4℃で保存した場合に希釈antibodyiesを複数回再利用することができます。 |
| アンチのSeV | 1 / 14,000 | PBS-T-BSA | 室温で3時間 | 抗ウサギ | SDS-PAGEの後に使用します。 0.02％アジ化ナトリウムの存在下、4℃で保存した場合に希釈antibodyiesを複数回再利用することができます。 |
| 注 ：希釈し、HRP結合二次抗体に用いた緩衝液は、それが一つの会社から他に変化する最適化する必要があります。 | |||||
イムノブロッティング手順で使用される抗体の表1の仕様。
- 西洋ワサビペルオキシダーゼで膜をインキュベート（HRP）は、図1および表1に詳述するように、二次抗体を抱合。完全にトゥイーンの痕跡を除去し、PBSで2倍、5分間、続いてPBS-T中で膜を5倍5分、洗います。
- 完全に膜をカバーするのに十分な高感度化学発光試薬の容量で1分間、膜をインキュベートします。濾紙を用いて膜を乾燥します。
- 免疫反応性バンドを可視化するために、発光画像解析装置で膜を配置します。
- 代替的に、敏感なX線フィルムを用いて、免疫反応性バンドの検出を行います。
- PBS中の5分の3倍の膜を洗ってください。
注：このステップでは、膜が乾燥し維持することができます。さらに、ストリッピングが必要な場合は、それは、膜を乾燥させる前に、ストリッピングを行った方がよいです。膜はまた、PBS中で短期間保存することができます。 - 抗体とのインキュベーションの間の剥離を必要としない膜のためのステップに進んで（ 図1参照 ）5.20。
- ストリッピングは、（ 図1参照）の抗体との間に必要とされる場合、2％SDS、62.5 mMトリス塩酸pH6.8の（RT）及び50℃でのddH 2 O中の0.7％βメルカプトエタノールを含有する予め温めた剥離液中で膜をインキュベートします定期的に攪拌しながら20分間。 PBS中の5分の3倍の膜を洗ってください。
注：ストリッピング手順の間の攪拌が鍵となります。ストリッピングは、ハイブリダイゼーションオーブン内で行うことができます。あるいは、ストリッピングは、ビニール袋に密封された膜を使用して実行し、水浴に浸漬することができます。インキュベーションの間に5回 - この場合には、膜4を攪拌することが重要です。 - PBS-T-ミルクで4℃でRTまたはO / Nで1時間膜をインキュベートします。
- 繰り返しは 、図1によれば5.16から5.12を繰り返します。
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Representative Results
図2は、高解像度のSDS-PAGEによるWCEの決議後にIRF3総抗体およびSer396およびSer398に対するIRF3、リン酸化抗体を用いて検出されたIRF3の代表的なイムノブロット像を示します。刺激されていないA549細胞では、IRF3は50で二つのバンドと非リン酸化（I型）に対応し、SDS-PAGE上の53kDaの低リン酸化及び（II型）IRF3の種として検出されます。 3のためのSeVにA549細胞の曝露 - 時間依存シフトで9時間の結果が徐々に形IおよびIIからよく区別されている過リン酸化形態のIIIおよびIVを、移行します。高リン酸化バンドは55-57 kDaのに移行します。フォームIIIとIVはまた、特にSer396およびSer398に対するリン酸特異的抗体を使用して免疫検出されています。アクチンの免疫検出は、レーン間の等しい負荷の対照として働きます。センダイウイルス感染の制御は、ウイルスヌクレオPの蓄積によって示されています60kDaので移動rotein（N）、。
図3では 、Ser386に対する抗IRF3-NES抗体とリン酸化抗体を用いたイムノブロットに続くネイティブPAGEによって分離WCEから得IRF3の検出のプロファイルが示されています。刺激していないA549細胞において、IRF3は、単量体形態に対応する単一のバンドとして検出されます。 9時間、IRF3の二量体形態に対応してゆっくりと移動するバンドの同時蓄積とIRF3モノマー減少のレベル - 3用のSeVの感染時に。 Ser386に対するリン酸特異的抗体は、IRF3の二量体種を検出。
A549細胞におけるセンダイウイルス感染により誘導される個別IRF3リン酸化種の図2の検出（フォームI-IV）。A549細胞は、感染していない左またはインディカのためのSeVを感染させましたテッド回。 WCEは、抗IRF3-Ser396（IRF-3-P-Ser396）を用いたイムノブロット（IB）、続いて高解像度のSDS-PAGEおよび抗IRF3-Ser398（IRF-3-P-Ser398）リン酸化抗体および抗により分析しました-IRF3全長タンパク質抗体。感染は、抗センダイウイルス抗体を用いてモニターした（ヌクレオカプシドNタンパク質が示されています）。抗アクチン抗体は、ローディングコントロールとして使用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図A549細胞におけるセンダイウイルスによってリン酸化/二量化しIRF3誘導の3モニタリング。A549細胞は、示された時間のために、感染していない左またはセンダイウイルスを感染させました。 WCEは、抗IRF3-Ser386（IRF-3-P-Ser386）リン酸特異的抗体と抗IRF3-NES antibを使用して、ネイティブPAGEによって分離し、イムノブロットによって明らかにされましたodies。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちはここで説明するプロトコルは、IRF3の二量体/単量体とphosphoforms I〜IVを区別するためのいくつかのリン酸化抗体の使用に結合された高解像度のSDS-PAGEおよびネイティブPAGEの組み合わせで構成されます。これらIRF3の種の適切な検出が完全に特定の設定でIRF3の活性化を特徴づけるために不可欠です。例えば、活性化マクロファージのLPS刺激は、低リン酸化（II型）を示すが、（III型およびIV）過剰リン酸化はない、SDS-PAGE 15内のパターンの二量体、Ser396 / 398のリン酸化IRF3の形成につながります。記載されているプロトコルを使用して、このプロファイルは、Ser386およびSer396リン酸化10に加えて、追加のSer339のリン酸化を必要とするウイルス誘導性過リンのフォームと区別することができます。重要なことは、これはまた、二量体化を示すが、10転写活性ありませんSer396リン酸化種の間の識別ができます。イムportantlyは、IRF3のphosphoformsの形式I-IVのパターンがヒトIRF3に適用することを留意する必要があります。マウスIRF3は、同様のパターンを示さないため、IRF3の活性化は、唯一の、SDS-PAGE後のイムノブロットでリン酸化抗体の使用によりネイティブ-PAGEによって特徴付けられます。
SDS-PAGEによるIRF3の明確なリン酸化種の高分解能分離の達成には、特定のパラメータが必要です。適切な解像度のために、それは16 cmでの最小長さを有するゲルを使用することが非常に重要です。でも分離ゲルのこの長さで、それは、移行前は、異なるIRF3形の適切な分離を得るために、ゲルの底に達するようにするキーです。また、スタッキングゲルは、明確に定義されたバンドを得るために、櫛より1cm下の最小値に拡張する必要があります。 IRF3の過リン酸化形態は、互いに非常に近くに移動するので、これは重要です。焦点の合っていないバンドはphosphorylaの区別がないことになりますテッドは、それぞれの定量化を損なう形成しています。また、過硫酸アンモニウムおよびTEMEDの濃度は、一SDS-PAGEプロトコルから別のものに変化します。ここに示されたものとこれらの濃度のばらつきが大きくIRF3種の分離の分解能を損なうことが判明しました。
ネイティブ-PAGEを通じてIRF3の二量体形成の検出は、もともと博士T.藤田のグループによって説明されました。このプロトコルは、/ P300 27 CBPからIRF3の二量体の解離を可能にDOCを含むバッファを使用しています。それは非常直ちに-80℃でのWCEのストレージとして細胞溶解後にネイティブのページに進むことが推奨されIRF3モノマー/二量体比の有意な変化をもたらすことが見出されました。さらに、それは、上部及び下部チャンバーの緩衝液のpHは、二量体対単量体の適切な分離を達成するためにすべての成分を混合した後、室温ではなく、4℃でpHを8.4に調整することが非常に重要です。分離8.5センチメートルの最小の長さを有するゲルは、IRF3モノマーおよびダイマーの適切な分離を可能にします。サンプルプラスローディングバッファーの理想的なボリュームは、ボリュームが最小に保たれているときに、解像度が優れているだけでなくとして5ミリメートルのための約8μlです。これにより、高濃度のWCEを得るために、溶解緩衝液の最低量を使用することが重要です。しかし、効率的なタンパク質抽出は、少なくとも細胞ペレットの体積で5倍の溶解を必要とすることを考慮すべきです。試料の体積は、上記で示した制限を超えた場合、これは単量体/二量体の不十分な分解能をもたらします。これは、のddH 2 O中で4％アクリルアミド、62.5 mMトリス塩酸pH6.8の（RT）、1％の過硫酸アンモニウムおよび0.1％TEMEDを含有スタッキングゲルを添加することにより解決することができますこれは、バンディングを乱すことなく、サンプルをロードすることは非常に重要です。井戸の底に近いゲルローディングチップでゆっくりロードすると、非常に良好な結果を与えます。
ここでは、説明のインビボ DETESer386 9、Ser396 19およびSer398 15に対して現在利用可能なリン酸特異的抗体を使用して、特定の残基でのリン酸化のction。 IRF3の変異体および質量分析法を使用すると、これらの残基が、ウイルス感染またはIKKε/ TBK1キナーゼの過剰発現時にリン酸化されると、IRF3の活性化6,9,10,19,21のために重要であることを確認した分析します。 SDS-PAGE後のリン酸化Ser396、Ser398リン酸化および総IRF3の免疫検出は、2つの同一のゲル（ 図1）を使用する必要があります。ホスホ抗体は、膜の剥離後に使用されるとき実際、感度の有意な喪失が観察されます。したがって、それは非常に最初にリン酸特異的抗体を使用することをお勧めします。代替一次および二次抗体はまた働くかもしれないが、使用量の特定の希釈液とのシーケンスを最適化する必要があることに注意してください。 IRF3分析のために、30μgのWCEは、IRF3の有意な検出を得るために適切です4 mmの幅のウェルを使用する場合に示した抗体を用いたイムノブロットによるリン酸化。種々のウイルスに感染した多くの細胞型において30μgのが適切であることが見出されたが、この量は、細胞型および刺激に依存して大きくする必要があるかもしれません。これは、SDS-PAGEのために新鮮な抽出物を使用することが好ましいが、この論文に記載されリン酸化特異的抗体を用いて、IRF3のリン酸化の検出は、分析前に-80℃でWCEの貯蔵のラウンドを可能にするのに十分に安定です。ここで説明するホスファターゼ阻害剤の濃度は、A549細胞を使用する場合に十分であることが見出されました。より高い濃度は、より良い結果を得るために見つかりませんでした。しかし、これらの濃度は、より高いホスファターゼ活性のレベルを示す細胞タイプにIRF3の活性化を研究する際に増加することが必要になる場合があります。重要なことは、IRF3のリン酸化および基礎となるメカニズムはまだ遠い理解されているからです。したがって、セリン/ Thr-およびTyr-ホスファターゼのフルパネルでhibitorsは、IRF3のリン酸化、二量体化および劣化の検出に影響を与える可能性がある可能性はまだ特徴付けられていない活動を阻止するために使用されます。ほとんどのウイルス感染の後、ほとんどの細胞型でIRF3モノマーおよび二量体の検出のために、8 - を10μgのWCEは十分であることが見出されました。しかし、タンパク質の高い量が少なく効率的にIRF3を活性化刺激に必要になることがあります。本研究で用いたSer386に対するリン酸特異的抗体は、変性SDS-PAGEでの感度が非常に弱いようネイティブ-PAGEで使用することを推奨します。また、Ser386でのリン酸化は、このように特定の設定では、この概念を確認するために、ネイティブPAGEにおけるこれらの抗体の使用に適切な戦略を作り、IRF3 9の二量体形態と相関することが提案されています。注目すべきは、代替抗体は、様々な会社から入手可能であり、効率的に、SDS-PAGE後にリン酸化Ser386を検出することが主張されています。 Ser396リン酸化に対する抗体はまた、効率的にUされていますネイティブPAGEの20の後にIRF3のリン酸化を検出するために、sedは。重要なことには、ホスホ部位のC末端のクラスタ内のSer402もIKKε/ TBK1リン酸化IRF3 10,21,28の質量分析で観察したIRF3の活性化、およびSer402のリン酸化に重要であることが見出されました。しかし、2つの異なる試み（NG、未発表）にもかかわらず、リン酸特異的抗体は 、in vivoで、この特定の残基のリン酸化に従って、現在利用可能ではありません。 Thr157およびSer339リン酸化に対する抗体はまた、11,13に記載されていることに注意してください。これらの付加的なリン酸特異的抗体は、ここに記載したものと同様の高解像度のSDS-PAGEの手順で使用することができます。この場合、追加の大SDS-PAGEゲルを、各抗体のために必要とゲル＃2（図1）と同じ方法で処理されます。我々の知る限りSer173またはThr390に対してはリン酸特異的抗体は、まだ記載されていません、しかし、彼らは簡単に彼らが14,20利用できるようになったら、ここで説明されたプロトコルに追加することができます。
IRF3活性が過剰リンの形態11,17のプロテアソームによる分解によって終了します。プロトコルは、刺激の運動が長くなると、プロテアソーム阻害剤（MG132、ラクタシスチンまたはbortezomid）の使用に結合されたときにIRF3劣化のモニタリングを可能にするにも、ここで説明。一般的に、40 HAU / 10 6個の細胞でのSeVを感染させたA549細胞に、IRF3のリン酸化は、すぐに2時間後のSeV感染及びIRF3の劣化が12時間後に開始するように起動します。プロテアソーム媒介分解はプロテアソーム阻害剤での状態で反転される後期の時点で形態III及びIVレベルの減少が観察から結論されます。これはまた、プロテアソーム阻害剤治療の際に回収される29 IRF3ダイマーレベルの減少でネイティブPAGEに変換されます。重要なことには、高解像度のテクニックQUEは、ここに提示分解プロセスと活性化の欠如を区別することができます。実際、両方の劣化及び二量体/リン酸化Ser386 / 396の検出の不存在下でIRF3結果の活性化の欠如。 IRF3が30低下しているときに、これらのIRF3種が検出されないながらしかし、活性化の欠如は、IRF3モノマーの検出とし、フォームIおよびIIの関連しています。
質量分析法ベースの分析と結合した免疫沈降は、異なる部位でIRF3 のインビボでのリン酸化を検出するための最適な方法です。この技術はSer173、Ser175、Ser386、Thr390、Ser396およびSer402残基10,20,21でIRF3のリン酸化を確認しました。しかし、質量分析を容易に異なる時点で、いくつかの刺激次IRF3の活性化を毎日分析するために使用することができる手頃な価格/ benchside技術はまだありません。したがって、この手順は、ネイティブPAGに結合されたSDS-PAGEを使用して、ここに記載さ合計とリン酸化抗体を用いたイムノブロットと組み合わせたEはactived IRF3の現在定義されているすべての形態を検出するための、実用的な手頃な価格に敏感なアプローチを構成しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
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