Introduction
Das ubiquitär und konstitutiv exprimierten Transkriptionsfaktors Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) ist entscheidend für die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger vor allem durch die Induktion von IFN & beta;, aber auch durch die Induktion des Chemokin (CC motif) Ligand 5 (CCL5 ) und mehrere antivirale Proteine, einschließlich IFN-induzierte Protein mit tetratricopeptide wiederholt IFIT1 / 2/3 1-3. Oder Lipopolysaccharid (LPS) 4: IRF3 Aktivierung wurde nach der Infektion mit einer Vielzahl von Viren, oder durch Einwirkung von Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly-I C) angegeben. Wichtig ist, dass die meisten untersuchten Viren Mechanismen entwickelt, um die IRF3 vermittelte Reaktion entziehen und damit die Flucht der Host angeborenen Immunabwehr 5. Somit überwachen IRF3 Aktivierung ist von großer Bedeutung, um die molekularen Mechanismen der unspezifischen antiviralen Abwehr verstehen, sondern auch, um die durch Viren verwendet, um diese Antwort entgegenzuwirken Strategie zu identifizieren.
ent "> Viele veröffentlichten Berichten allerdings nur eine begrenzte Analyse IRF3 Aktivierung durch die Überwachung der IRF3-Zielgen Induktion (IFNB1 und IFIT1) durchgeführt und / oder Luciferase-Reportergen-Assay zu niedrige Auflösung Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gekoppelt ist (SDS- PAGE) -Analyse IRF3. Jedoch zahlreiche biochemische Studien zeigte die Analyse des Verhaltens verschiedener IRF3 Mutanten und Aufklärung der Kristallstruktur IRF3 6-11 haben dazu beigetragen, dass IRF3 herzustellen ist mit einer komplexen Reihe von aufeinanderfolgenden posttranslationalen Modifikationen durch Phosphorylierung an unterworfen mehreren Standorten. Die Menge der Phosphorylierung in IRF3 Aktivierung beteiligt scheint von dem Stimulus und höchstwahrscheinlich nach Zelltyp zu sein. Bei nicht infizierten Zellen, koexistiert IRF3 als nicht-phosphoryliert und hypophosphorylierten enthaltenden Arten phosphoresidues einschließlich Thr135 und Ser173, in der 1 -198 aa N-terminalen Bereich 6,12-14. Anhäufung dieser hypophosphorylierten form der IRF3 durch Stress induzieren, Wachstumsfaktoren und DNA-schädigende Mittel 6 induziert. Phosphorylierung von Ser / Thr-Reste am C-terminalen Region von IRF3 enthaltend die Transaktivierungsdomäne ausgelöst nach einer Aktivierung, die durch Viren, Poly I: C oder LPS in einer zelltypabhängig 15-17. C-terminale Phosphorylierung von IRF3 beinhaltet nicht weniger als 7 verschiedene phosphoacceptor Standorten in zwei Hauptcluster, Ser385 / Ser386 und Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 organisiert, dass jeder dazu beitragen, IRF3 Aktivierung durch Dimerisierung, Kernakkumulation, Verbindung mit dem CREB bindenden Protein (CBP) / p300 Co-Aktivatoren, DNA-Bindung an sensiblen Antwortelement (ISRE) Konsensus-Sequenzen und Transaktivierung von Zielgenen 9,10,17-19 IFN. Die Phosphorylierung von Thr390 ist auch gedacht, um virusinduzierten IRF3 Aktivierungs 20 beizutragen. Massenspektrometrie-Analysen von IRF3 haben gezeigt, dass Ser386, Thr390, Ser396 und Ser402 Reste direkt phosphorylatdurch den Inhibitor der & kgr; B-Kinase ε (IKKε) ed / TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1) Kinasen 9,10. Phosphorylierung an der C-terminalen Reste auch für die Beendigung des IRF3 Aktivierung über Polyubiquitinierung und Proteasom-vermittelten Abbau 10 erforderlich. Dieses Verfahren ist auch abhängig von der Phosphorylierung an Ser339, der für die Einstellung des propyl Isomerase Pin1 10,11 erforderlich ist. IRF3 Spezies, die mindestens Phospho-Ser339 / 386/396 Rückstände berücksichtigt werden hyperphosphorylierten Formen. Der genaue Ablauf und Funktion der Website bleibt eine Frage der Diskussion 10,21. Es ist nun klar, dass aktiviert IRF3 keinen homogenen Zustand dar, sondern dass verschiedene aktivierte Spezies ausgeprägte Phosphorylierung oder Dimerisierung Eigenschaften aufweisen vorhanden 10,22.Um ein vollständiges Verständnis der IRF3 Aktivierung in Reaktion auf bestimmte Krankheitserreger liefern, ist es daher notwendig, characterize welche der aktivierten Spezies induziert werden. Induktion IRF3 Zielgene IFNB1 und IFIT1 hat sich als zuverlässige Auslese für IRF3 Aktivierung. Jedoch Überwachen Expression dieser Gene nicht zwischen verschiedenen Aktivierungszuständen des IRF3 unterscheiden. Eine umfassende Analyse der IRF3 Aktivierungszustände in einer bestimmten Einstellung stützt sich auf die detaillierte Charakterisierung ihrer Phosphorylierung und Dimerisierung Status 10. Unphosphorylierten (Form I), hypophosphoryliert (Form II) und hyperphosphoryliertem (Formen III und IV) IRF3 Formen 6,18,23 erfolgreich durch eingeschränkte Mobilität in hoher Auflösung SDS-PAGE-Analyse aufgelöst werden. Monomeren und dimeren IRF3 Spezies effizient durch native-PAGE-Analyse identifiziert werden. Diese Ansätze werden stark verbessert, wenn es in Kombination mit phosphospecific Antikörper gegen verschiedene IRF3 phosphoacceptor Teilen geleitet verwendet.
Standardprotokolle ermöglichen eine schlechte Auflösung vonProteine, die keine wirksame Trennung von unterschiedlichen IRF3 phosphorylierten Formen zulässt. Hier beschreiben wir im Detail ein Verfahren, um die höchste Auflösung zu erreichen, um die Induktion von verschiedenen Virus-aktivierte IRF3 Spezies unter Verwendung von SDS-PAGE, native-PAGE in Kombination mit Immunoblot gekoppelt mit Gesamt und phosphospecific Antikörper zu überwachen. In vivo Diskriminierung zwischen den Aktiv Formen IRF3 wird auf der Basis ihrer in der SDS-PAGE beobachteten Mobilitätsverschiebungen durchgeführt. Zusätzlich kann IRF3 Monomer und Dimer von nicht-denaturierenden Elektrophorese unterschieden werden. Die Kombination dieser zwei komplementären Techniken mit Immunoblot erweist sich als eine kostengünstige und sensiblen Umgang mit alle notwendigen Informationen für eine vollständige Analyse der Phosphorylierung-vermittelte Aktivierung von IRF3 erwerben.
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Protocol
HINWEIS: Das Protokoll wird hier unter Verwendung von A549-Zellen mit Sendai-Virus (SeV) infiziert beschrieben. Jedoch wird das Protokoll für die SDS-PAGE und native PAGE funktioniert auch bei allen bisher untersuchten humanen und murinen Zelltypen, insbesondere Knochenmarkzellen mit verschiedenen Stimuli 9,15,19,24,25 IRF3 aktivierende stimuliert.
1. Die Infektion von A549-Zellen
- Aufrechtzuerhalten A549-Zellen in Kultur in einer 15 cm Platte bei 37 ° C / 5% CO 2 in 20 ml F12K / Ham-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (HALLO-FBS) und 1% L-Glutamin (gesamt F12K / Ham-Medium).
Hinweis: Alle für die Zellkultur und Behandlungen verwendet Lösungen müssen steril sein. - Bei 24 Stunden vor der Infektion, saugt den mittleren und die Zellen werden mit 10 ml destilliertem phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) bei RT.
- 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Platte, die Zellen abdecken und bei 37 ° C für 3 min.
- Stoppen Sie die Inkubationszeit, sobald the-Zellen beginnen, von der Platte durch Ausklopfen sanft mit einer Hand zu lösen. Inaktivierung der Trypsin durch Zugabe von 10 ml vorgewärmt komplette F12K / Ham-Medium pro Platte und übertragen Sie die Zellen auf eine 15 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifuge bei 350 × g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 8 ml komplette F12K / Ham-Medium, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Pflanzensamen, die Zellen in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen pro 60 mm Platte in 4 ml vorgewärmt komplette F12K / Ham-Medium. Inkubation für 20-24 Stunden bei 37 ° C / 5% CO 2. Nach 20 bis 24 h, bilden die Zellen eine 90% konfluenten Monolayer (das entspricht 1,5 x 10 6 Zellen).
- Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 2 ml Serum-freiem F12K / Ham-Medium (SFM). 2 ml frischem SFM pro 60 mm Platte.
- Tauwetter ein Aliquot des Sendai-Virus (SeV) (bei -80 ° C gelagert aliquotiert) auf Eis und kurz vortexen.
- Verdünnen Sie the-Virus im vorgeheizten SFM bis 60 HAU / 100 & mgr; l zu erhalten. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren sanft und fügen Sie 100 ul der verdünnten Virus pro Platte, um die Infektion bei 40 HAU / 10 6 Zellen durchzuführen. Sie Virus in der nicht infizierten Kontrollplatte hinzufügen, nicht.
- Die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2. Man schüttelt die Platten von Hand 3 oder 4 mal, oder mit Hilfe eines automatischen Orbital- oder Schüttler direkt in den Inkubator gestellt, während der ersten Stunde der Infektion.
- Bei 2 h nach der Infektion, 2 ml F12K / Ham-Medium, das 20% HALLO-FBS, um eine Endkonzentration von 10% HALLO-FBS zu erhalten.
- Die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 für eine weitere 1, 4 und 7 h auf insgesamt Infektion Zeiten von 3, 6 und 9 Stunden zu erreichen sind. An jedem dieser Zeitpunkte, fahren Sie mit Schritt 2.1.
2. Herstellung von Ganzzellextrakte (WCE)
- Entfernen Sie das Infektionsmedium. Ernte der Zellen durch Abschaben in 1 mleiskaltem D-PBS und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine vorgekühlte 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 16,000 × g bei 4 ° C für 20 sec und sorgfältig dekan alle Spuren von D-PBS.
HINWEIS: Bei diesem Schritt kann das Zellpellet direkt auf Proteinextraktion oder schockgefroren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis / Ethanol-Bad bei -80 ° C bis zur Lyse gespeichert unterworfen werden. - Vorbereitung der Lysepuffer, enthaltend 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% Glycerin und 1% Nonidet P-40 in destilliertem Wasser (ddH 2 O). Extemporarily hinzuzufügen Protease (1 ug / ml Leupeptin und 2 & mgr; g / ml Aprotinin) und Phosphatase-Inhibitoren (5 mM Natriumfluorid, 1 mM aktiviert Natriumorthovanadat, 2 mM p-Nitrophenylphosphat und 10 mM β-Glycerophosphat, pH 7,5).
HINWEIS: Der Lysepuffer ohne Inhibitoren können bei 4 ° C gelagert werden. Ein spezifisches Protokoll für die Aktivierung von Natriumorthovanadat in der Tabelle mit den spezifischen Reagenzien / Aufstellb beschriebennt. - Zellpellet in 70 & mgr; l Lysepuffer. Typischerweise ist das Lysat Konzentration wird etwa 2 ug / ul sein.
- Inkubieren auf Eis für 20 min. Flash-Einfrieren des Lysats durch Inkubation in einem Bad mit flüssigem Stickstoff für 15 Sek. Auftauen Lysat bei RT, bis es vollständig geschmolzen ist und Vortex für 10 Sekunden. Wiederholen Sie die Frost / Tau / Wirbelzyklus 3 mal.
- Alternativ führen Sie den Gefrierschritt in einem Ethanol / Trockeneis-Bad für 1 min.
- Zentrifuge bei 16.000 × g bei 4 ° C für 20 min. Den Überstand (der dem WCE) in eine neue vorgekühlte 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Halten Sie das WCE auf Eis zu allen Zeiten.
- Quantifizierung von Proteinen unter Verwendung jedes Protein Quantifizierungsverfahren mit Lysepuffer wie Bradford-Protein-Assay auf Basis 26 kompatibel.
3. Beschlussfassung der WCE Hohe Auflösung SDS-PAGE
- Bereiten Sie drei denaturierenden Elektrophorese Gele.
- Zum Nachweis vonIRF3 Formen gießen zwei Gele von mindestens 16 cm Länge mit einem Trenngel 7,5% Acrylamid / Bis-Acrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 (RT), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 O TEMED und einem Sammelgel 4% Acrylamid, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 TEMED O.
Vorsicht! Acrylamid, TEMED und SDS sind toxisch und / oder reizend. Schutzhandschuhe tragen und unter einer Abzugshaube zu manipulieren. - Zum Nachweis von SeV Proteine gießen einem Gel aus einem Minimum von 8,5 cm Länge bei, ähnlich der in 3.1.1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Trenngel enthält 12% Acrylamid-Gel Eigenschaften.
- Zum Nachweis vonIRF3 Formen gießen zwei Gele von mindestens 16 cm Länge mit einem Trenngel 7,5% Acrylamid / Bis-Acrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 (RT), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 O TEMED und einem Sammelgel 4% Acrylamid, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 TEMED O.
- Denaturieren des in Schritt 2.6 erhaltenen WCE durch Zugabe von 1: 4 (v / v) 5x Ladepuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p / v) Glycerin, 0,0005% Bromphenolblau und 25% β-Mercaptoethanol in ddH 2 O), gefolgt von Erwärmen bei 100 °C für 10 min. Schnellspin die Rohre nach unten die Kondensation, die in der Kappe bildet zu bringen.
Vorsicht! β-Mercaptoethanol ist giftig beim Einatmen. Schutzhandschuhe tragen und unter einer Abzugshaube zu manipulieren. - Montieren Sie die Gele in der Migrationsgerät. Füllen des oberen und unteren Kammern mit Laufpuffer, der 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS und 192 mM Glycin in destilliertem Wasser (dH 2 O).
- Last 14 ul der Molekulargewichtsstandard in einer Vertiefung jeder 16 cm Gel und 7 ul der Molekulargewichtsstandard in einem auch der 8,5 cm-Gel. Last 30 ug denaturierter WCE (hergestellt wie in Schritt 3.2 beschrieben) pro Vertiefung der beiden Gele in Schritt 3.1.1 IRF3 Formen Detektions hergestellt. Last 8-10 ug denaturierte WCE (hergestellt wie in Schritt 3.2 beschrieben) pro Vertiefung auf dem Gel in Schritt 3.1.2 SeV Analyse vorbereitet.
- Führen Sie die Gele bei 30 mA Konstantstrom, bis der Migrationsfront den Boden des Gels erreicht.
HINWEIS: Migration dauert in der Regel approximadig 3 Stunden für eine 16 cm-Gel und 45 min für eine 8,5 cm Gel. - Fahren Sie mit dem Transfer auf Nitrocellulosemembranen (Schritt 5).
4. Analyse der IRF3 Dimerisierung von Native-PAGE
Hinweis: Diese Methode wurde ursprünglich von der Gruppe von Dr. T. Fujita 27 beschrieben.
- Bereiten Sie die obere (-) und unteren (+) Kammer Elektrophorese-Puffer. Die obere Kammer Puffer besteht aus 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), 192 mM Glycin und 1% Natriumdeoxycholat (DOC) in ddH 2 O. Die untere Kammer Puffer enthält 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) und 192 mM Glycin in ddH 2 O.
HINWEIS: Die obere und die untere Kammer der Elektrophorese-Puffer bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. Stellen Sie jedoch sicher, dass sie auf RT vorgewärmt, bevor Sie die Elektrophorese. - Gießen eines nicht denaturierenden Trenngel von mindestens 8,5 cm Länge, enthaltend 7,5% Acrylamid / Bisacrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 (RT), 1% ammonium Persulfat und 0,1% in ddH 2 O. TEMED
- Vorlauf das Gel bei 40 mA Konstantstrom für 30 Minuten auf Eis. Drücken Sie die Laufgerät in das Eis in etwa der Höhe des unteren Kammer Elektrophorese-Puffer. Es ist wichtig, dass das Gel nicht in das Eis.
- Während Vorlauf, mischen WCE auf Eis gehalten mit 2x nativen PAGE-Ladepuffer 1: 1 (v / v), die 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% Glycerin und 0,1% Bromphenolblau in ddH 2 O.
- Last 8 - 10 & mgr; g WCE (hergestellt wie in Schritt 4.4 beschrieben) unmittelbar am Ende des Vorlauf.
- Führen Sie das Gel bei 25 mA Konstantstrom auf Eis, wie oben für den Vorlauf beschrieben, bis der Migrationsfront den Boden des Gels (ca. 40 min) erreicht.
5. Immunoblotanalyse IRF3 Species
- Vorbereitung der Transferpuffer, der 25 mM Tris-Base und 192 mM Glycin in ddH 2 O. Kühlen den Transferpuffer bei 4 ° C vor dem Gebrauch.
- Nass drei Stück Nitrocellulose-Membran auf eine Größe geringfügig größer als die Gele in einem Kunststoff / Glas-Box mit den Übertragungspuffer geschnitten. Geben Sie die Orientierung der Membran durch Abschneiden einer Ecke. Der Übertragungspuffer kann 3-mal wiederverwendet werden. Lagern Sie den Puffer bei 4 ° C zwischen den Anwendungen.
- Ungegossen die Gele (SDS-PAGE und native-PAGE) und schneiden Sie eine Ecke jedes Gel für die richtige Orientierung.
- Für native-PAGE, Inkubation des Gels bei RT unter leichtem Schütteln für mindestens 30 min in der SDS-PAGE-Laufpuffer, um das DOC vor der Übertragung auf dem Übertragungspuffer zu entfernen.
- Die Gele (SDS-PAGE und native-PAGE) in der Transferpuffer Inkubation für 5 - 10 min.
- Montieren Sie einen Transfer-Sandwich pro Gel in einer Transferkassette mit der Membran in Richtung der positiven Elektrode (Schaumstoffpolster / Filterpapier / Membran / Gel / Filterpapier / Schaumstoffunterlage). Seien Sie vorsichtig, um alle Luftblasen zwischen den Schichten des Sandwich zu entfernen.
- Führen Sie die Übertragung, wie empfohlen by der Hersteller für die Übertragungsvorrichtung verwendet wird.
HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationen und Waschungen in den nächsten Schritten auf einem Schaukel oder Orbitalschüttelvorrichtung Plattform. - Am Ende der Bewegungsphase, Inkubation der Membranen für 15 min in der Fixierungslösung, die 7% Essigsäure, 40% Ethanol und 3% Glycerin in ddH 2 O. Waschen der Membranen 3x 5 min in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 und 1,8 mM KH 2 PO 4 in dH 2 O).
Vorsicht! Essigsäure ist giftig, reizend und brennbar. Schutzhandschuhe tragen und unter dem Abzug zu manipulieren.
HINWEIS: Die Fixierungslösung kann mehrfach wiederverwendet werden. - Für die native-PAGE-Membran gehen Sie direkt zu Schritt 5.11.
- Spülen der drei SDS-PAGE Membranen schnell in dH 2 O vor dem Inkubieren für 1 min in rot ponceau Lösung, enthaltend 6,57 mM rotem Ponceau und 1% Essigsäure in ddH 2 O.
HINWEIS: Die rote ponceau Lösung r eused mehrmals. - Spülen Sie die Membranen in dH 2 O, bis der Hintergrund ist weiß genug, um die Proteinbanden in rot gefärbt sehen. Beachten Sie die Markierungen mit einem Bleistift und den überflüssigen Membran um den Proteinen. Entfärben Membranen durch Inkubation für 5 min in PBS unter Rühren.
- Die Membranen 1 h bei RT oder O / N Inkubieren bei 4 ° C in Blockierungslösung (PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 und 5% fettfreier Trockenmilch (PBS-T-Milch). Waschen der Membranen 3x 5 Minuten in PBS-T.
HINWEIS: Die PBS-T Wäsche ist optional und nur dann erforderlich, wenn die Anwendung streng Antikörper in PBS-T, enthaltend 5% Rinderserumalbumin (PBS-T-BSA) (Abbildung 1 und Tabelle 1) in der nächsten Stufe verdünnt. - Inkubieren Sie die vier Membranen (von SDS-PAGE und native-PAGE) mit den primären Antikörper gemäß der Reihenfolge in Abbildung 1 und Tabelle 1 beschrieben. Führen Sie 5x 5 min Waschen in PBS-T.
Abbildung 1. Reihenfolge der Immunoblot Analysen. Die schematische beschreibt die einzelnen SDS-PAGE und native-PAGE-Gelen erforderlich, um die verschiedenen IRF3 phosphoryliert und monomeren / dimeren Formen zu erkennen. Die spezifische Reihenfolge der Antikörper an die Membran von jedem Gel im Immunoblot Verfahren hervor angewandt ist. Beachten Sie, dass die Anti-Aktin-Antikörper werden zuerst verwendet, um eine gleiche Beladung der Proben vor Anwenden anderer spezifischer Antikörper zu gewährleisten. Die alternierende Sequenz, mit anti-Aktin-Antikörper, die nach den anti-phospho-IRF3 Antikörper aufgebracht, auch funktioniert. Stripping ist zwischen anti-Aktin und anti-SeV Antikörpern oder zwischen anti-Phospho-IRF3 und Anti-IRF3 Antikörper wegen der Größe der überlappenden Signalen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Primäre Antikörper | Verdünnung | Verdünnungspuffer | Incubation | Sekundärantikörper | Bemerkungen |
| Anti-Actin | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | 15 min bei RT | Anti-Maus- | Zu verwenden, nach SDS-PAGE Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. |
| Anti-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N bei 4 ° C | Anti-Kaninchen- | Verwenden Sie nach dem Mutter-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die verdünnte Antikörper Wiederverwendung |
| Anti-IRF3-P-Ser396 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N bei 4 ° C | Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die Wiederverwendung der verdünnten Antikörpers Anti-IRF3-P-396 ist auch von Cell Signaling. Optimale Verdünnung wurde als 1 / 1.000 für diesen Antikörper definiert, sondern kann zwischen den Chargen variieren. | |
| Anti-IRF3-P-Ser398 | 1 / 10.000 | PBS-T-BSA | O / N bei 4 ° C | Anti-Kaninchen- | Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die verdünnte Antikörper Wiederverwendung |
| Anti-IRF3 voller Länge | 1 / 7.500 | PBS-T-Milch | 3 h bei RT | Anti-Kaninchen- | Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Anti-IRF3 Antikörpers voller Länge kann nach der nativen PAGE verwendet werden, aber es ist weniger empfindlich, um das Monomer zu erkennen. Verdünnt Antikörper können mehrmals wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. |
| Anti-IRF3-NES | 0,5 ug / ml | PBS-T-Milch | 3 h bei RT | Anti-Kaninchen- | Verwenden Sie nach dem Mutter-PAGE. Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. |
| Anti-SeV | 1 / 14.000 | PBS-T-BSA | 3 h bei RT | Anti-Kaninchen- | Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. |
| HINWEIS: Verdünnung und Puffer für HRP-gekoppelten sekundären Antikörper verwendet werden, müssen optimiert werden, da sie variiert von einem Unternehmen zum anderen. | |||||
Tabelle 1. Technische Daten der Antikörper im Immunoblotting-Verfahren verwendet.
- Inkubieren der Membranen mit der Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörper, wie in Abbildung 1 und Tabelle 1 aufgeführt. Waschen der Membranen 5x 5 min in PBS-T, gefolgt von 2 x 5 min in PBS, um Spuren von Tween vollständig entfernen.
- Die Membranen 1 min Inkubieren in einem Volumen von verstärkter Chemilumineszenz-Reagenz ausreicht zur vollständigen Bedeckung der Membranen. Trocknen Sie die Membranen unter Verwendung von Filterpapier.
- Legen Sie die Membranen in einem lumineszierenden Bildes Analysator, um die immunreaktiven Banden sichtbar zu machen.
- Alternativ führen Sie den Nachweis von immunreaktiven Banden mit empfindlichen Röntgenfilme.
- Die Membranen 3x 5 min in PBS waschen.
HINWEIS: Bei diesem Schritt können die Membranen trocken gehalten werden. Ist jedoch eine weitere Abziehen erforderlich ist, ist es besser, das Strippen vor dem Trocknen der Membran durchzuführen. Membranen können auch zur kurzfristigen in PBS gelagert werden. - Für die Membranen, die nicht Strippen zwischen Inkubation mit Antikörpern erfordern (siehe Abbildung 1) gehen Sie direkt zu Schritt5.20.
- Beim Abisolieren zwischen Antikörpern (siehe Abbildung 1), Inkubation der Membranen in vorgewärmtem Ausstreiflösung, die 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT) und 0,7% β-Mercaptoethanol in ddH 2 O bei 50 ° C erforderlich für 20 min unter regelmäßiger Bewegung. Die Membranen 3x 5 min in PBS waschen.
HINWEIS: Agitation während des Stripping-Verfahren ist der Schlüssel. Strippen kann in einem Hybridisierungsofen durchgeführt werden. Alternativ Strippen kann unter Verwendung von Membranen, die in Kunststoffbeutel versiegelt und in ein Wasserbad eingetaucht werden. In diesem Fall ist es wichtig, um die Membranen 4 rühren - 5 mal während der Inkubation. - Die Membranen inkubiere 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C in PBS-T-Milch.
- Die Schritte 5,12-5,16 gemäß 1.
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Representative Results
Abbildung 2 zeigt ein typisches Bild der Immunoblot IRF3 mit IRF3 Gesamt Antikörper und IRF3-phosphospecific Antikörper gegen Ser396 und Ser398 nach der Auflösung des WCE durch hochauflösende SDS-PAGE nachgewiesen. In unstimulierten Zellen A549 wird IRF3 als zwei Banden bei 50 und 53 kDa in der SDS-PAGE entsprechend dem nicht-phosphoryliert (Form I) und der hypophosphorylierten (Form II) Spezies IRF3 detektiert. Exposition der Zellen A549 SEV für 3-9 Stunden ergibt eine zeitabhängige Verschiebung zu langsam wandernden hyperphosphorylierten Formen III und IV, die von den Formen gut unterschieden werden I und II. Die hyperphosphoryliertem Bands migrieren bei 55-57 kDa. Die Formen III und IV sind ebenfalls spezifisch mit den Antikörpern gegen phosphospecific Ser396 und Ser398 immunologisch. Die Immundetektion von Actin dient als Kontrolle der gleiche Beladung zwischen den Fahrspuren. Eine Steuerung der SeV-Infektion wird durch die Anreicherung des Virus-Nucleocapsid-p gezeigtenrotein (N), die bei 60 kDa wandert.
In Figur 3 ist das Profil der Detektion IRF3 von WCE durch native-PAGE gefolgt durch Immunoblot unter Verwendung von Anti-IRF3-NES-Antikörper und Antikörper gegen phosphospecific Ser386 gelöst erhaltenen gezeigt. In unstimulierten Zellen A549 wird IRF3 als eine einzelne Bande entsprechend der monomeren Form nachgewiesen. Bei Infektion mit SeV für 3-9 h, die Höhe der Abnahme IRF3 Monomer mit einer gleichzeitigen Ansammlung einer langsam wandernden Bande, die mit dem dimeren Form IRF3 entspricht. Die phosphospecific Antikörper gegen Ser386 nur IRF3 Dimer Arten.
Abbildung 2. Nachweis von Distinct IRF3 Phosphorylierte Species (Formular I-IV) von SeV-Infektion in A549-Zellen induziert. A549-Zellen wurden für die nicht infizierten indica links oder mit SeV infiziertted Zeiten. WCE wurden durch hochauflösende SDS-PAGE, gefolgt durch Immunoblot (IB) unter Verwendung von Anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) und Anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) phosphospecific Antikörper und anti analysiert -IRF3 Protein voller Länge Antikörpern. Die Infektion wurde unter Verwendung von anti-SeV-Antikörper überwacht (die Nukleokapsid-N-Protein ist gezeigt). Anti-Aktin-Antikörper wurden als Ladekontrolle verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3. Überwachung von phosphorylierten / dimerisierte IRF3 Induktion durch SeV in A549-Zellen. A549-Zellen wurden nicht infizierte links oder mit SeV infiziert für die angegebenen Zeiten. WCE wurden durch native-PAGE aufgetrennt und unter Verwendung von Anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) phosphospecific Antikörper und anti-IRF3-NES ANTIB durch Immunoblot zeigteodies. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Protokoll beschreiben wir hier aus einer Kombination von hochauflösenden SDS-PAGE und native-PAGE auf die Verwendung von mehreren phosphospecific Antikörper zu den monomeren / dimeren und phosphoforms I-IV IRF3 unterscheiden gekoppelt. Entsprechende Erfassung dieser IRF3 Spezies ist wichtig, um vollständig zu charakterisieren IRF3 Aktivierung in einer bestimmten Umgebung. B. LPS-Stimulierung von aktivierten Makrophagen führt zur Bildung von dimeren, Ser396 / 398 phosphoryliert IRF3 die eine hypophosphorylierten (Form II) aufweist, aber nicht hyperphosphoryliert (Form III und IV), Muster in SDS-PAGE 15. Mit dem beschriebenen Protokoll, kann das Profil von virusinduzierten hyperphosphoryliertem Formen, die zusätzliche Ser339-Phosphorylierung neben Ser386 und Ser396-Phosphorylierung 10 erfordern unterschieden werden. Wichtig ist, ermöglicht dies auch Unterscheiden zwischen Ser396 phosphoryliert Arten, die nicht zeigen Dimerisierung, sind aber transkriptionell aktiv 10. Importantly, ist anzumerken, daß die Form I-IV Muster IRF3 phosphoforms menschliche IRF3 angewendet werden. Murine IRF3 kein ähnliches Muster und somit die Aktivierung von IRF3 gekennzeichnet weisen nur durch die Verwendung von Antikörpern in phosphospecific Immunoblot nach SDS-PAGE und durch native-PAGE.
Das Erreichen einer hohen Auflösung Trennung der verschiedenen phosphorylierten Spezies IRF3 durch SDS-PAGE erfordert spezifische Parameter. Eine geeignete Lösung, ist es sehr wichtig, um Gele, die eine Mindestlänge von 16 cm besitzen. Selbst mit dieser Länge Trenngel, es ist Schlüssel der Migrationsfront den Boden des Gels zu erreichen, um eine angemessene Trennung der verschiedenen IRF3 Formen erhalten zu lassen. Auch muß die Sammelgel auf ein Minimum von 1 cm unterhalb des Kamms zu definierten Bands erhalten erstrecken. Dies ist wichtig, da die hyperphosphorylierten Formen IRF3 migrieren sehr nahe zueinander. Unscharfe Bands werden in fehlende Unterscheidung zwischen phosphoryla führented bildet ihren jeweiligen Quantifizierung zu beeinträchtigen. Zusätzlich kann die Konzentration von Ammoniumpersulfat und TEMED variieren von einem SDS-PAGE-Protokoll zu einem anderen. Variation in diesen Konzentrationen von denen, die hier angegeben wurde gefunden, dass die Auflösung in der Trennung der IRF3 Arten wesentlich beeinträchtigen.
Der Nachweis von IRF3 Dimerbildung über die native-PAGE wurde ursprünglich von der Gruppe von Dr. T. Fujita beschrieben. Dieses Protokoll verwendet Puffer mit DOC, der die Dissoziation des IRF3 Dimers aus CBP / p300 27 ermöglicht. Es wird dringend empfohlen, um native-PAGE unmittelbar nach Zelllyse als Speicher des WCE bei -80 ° C ablaufen wurde festgestellt, zu einer signifikanten Veränderung der IRF3 Monomer / Dimer-Verhältnis führen. Zusätzlich ist es sehr wichtig, dass der pH-Wert der oberen und unteren Kammer Puffer auf pH 8,4 bei Raumtemperatur eingestellt wird, und nicht bei 4 ° C nach dem Mischen aller Komponenten, um eine ordnungsgemäße Trennung des Monomers vs Dimer zu erzielen. Eine TrennungGel mit einer Mindestlänge von 8,5 cm ermöglicht angemessene Trennung der IRF3 Monomer und Dimer. Der ideale Volumen der Probe plus Ladepuffers ist ungefähr 8 & mgr; l für eine 5 mm und die Auflösung ist besser, wenn das Volumen auf ein Minimum reduziert. Somit ist es wichtig, den niedrigsten Volumen Lysepuffer verwenden WCE mit hoher Konzentration zu erhalten. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass eine effiziente Proteinextraktion erfordert Lyse in mindestens 5-fache Volumen des Zellpellets entnommen werden. Wenn das Volumen der Proben die oben angegebene Grenze überschreitet, würde dies zu einer schlechten Auflösung des Monomer / Dimer. Dies kann durch Zugabe eines Sammelgel, das 4% Acrylamid, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 O. TEMED gelöst werden Es ist sehr wichtig, die Proben ohne störende Streifenbildung zu laden. Langsam geladen mit einer Gel-Ladespitze nahe dem Boden des Brunnens gibt sehr gute Ergebnisse.
Hier beschreiben wir die in vivo detection der Phosphorylierung an spezifischen Resten mit den derzeit verfügbaren phosphospecific Antikörper gegen Ser386 9, Ser396 und Ser398 15 19. Die Verwendung von IRF3 Mutanten und Massenspektrometrie-Analysen bestätigt haben, dass diese Rückstände phosphoryliert auf Virus-Infektion oder Überexpression IKKε / TBK1 Kinasen und sind entscheidend für IRF3 Aktivierung 6,9,10,19,21. Immunodetektion von Phospho-Ser396, Phospho-Ser398 und insgesamt IRF3 nach SDS-PAGE erfordert die Verwendung von zwei identischen Gelen (Abbildung 1). Tatsächlich wird eine signifikante Sensitivitätsverlust beobachtet, wenn phosphospecific Antikörper werden nach dem Ablösen der Membran verwendet wird. Es wird daher dringend empfohlen, zunächst phosphospecific Antikörper zu verwenden. Beachten Sie, dass alternative primäre und sekundäre Antikörper können auch funktionieren, aber die spezifischen Verdünnungen und die Reihenfolge der Nutzung sollte optimiert werden. Für IRF3 Analyse, 30 & mgr; WCE ist angebracht, einen signifikanten Nachweis von IRF3 erhaltenPhosphorylierung durch Immunoblot unter Verwendung der angegebenen Antikörper bei der Verwendung von 4 mm Breite Brunnen. Obwohl in vielen Zelltypen mit verschiedenen Viren infiziert 30 ug wurde für geeignet befunden, wird diese Menge brauchen je nach Zelltyp und die Stimulation erhöht wird. Es ist bevorzugt, frischen Extrakte für SDS-PAGE verwenden, aber der Nachweis von IRF3 Phosphorylierung unter Verwendung der in diesem Dokument beschriebenen phosphospecific Antikörper ist stabil genug, um eine Runde der Lagerung des WCE bei -80 ° C vor der Analyse zu ermöglichen. Die Konzentrationen der hier beschriebenen Phosphatase-Inhibitoren wurden als ausreichend erwiesen, bei Verwendung von A549-Zellen. Höhere Konzentrationen wurden nicht gefunden, um bessere Ergebnisse zu erhalten. Jedoch diese Konzentrationen müssen möglicherweise bei der Untersuchung IRF3 Aktivierung in Zelltypen, die höher Phosphataseaktivität Ebenen aufweisen erhöht werden. Wichtig ist, dass die Phosphorylierung von IRF3 und die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch lange nicht verstanden. Daher ist eine vollständige Gruppe von Ser / Thr und Tyr-Phosphatase inInhibitoren verwendet wird, um möglichst noch nicht charakterisierten Aktivitäten, die den Nachweis von IRF3 Phosphorylierung, Dimerisation Abbau beeinflussen könnte blockieren. Zum Nachweis von IRF3 Monomer und Dimer, nachdem die meisten Virusinfektionen und in den meisten Zelltypen, 8 - wurden 10 ug WCE ausreichend erwiesen. Allerdings könnten höhere Menge an Proteinen zur Stimulation der Aktivierung IRF3 weniger effizient erforderlich. Die phosphospecific Antikörper gegen Ser386 in dieser Studie verwendet werden empfohlen, um in nativen PAGE als die Empfindlichkeit in denaturierenden SDS-PAGE verwendet werden, ist sehr schwach. Darüber hinaus wird die Phosphorylierung an Ser386 vorgeschlagen, mit der dimeren Form von IRF3 9 korrelieren, wodurch die Verwendung dieser Antikörper in nativen PAGE eine geeignete Strategie, dieses Konzept in einer bestimmten Einstellung zu bestätigen. Zu beachten ist, sind alternative Antikörper von verschiedenen Firmen und sind angeblich Phospho-Ser386 effizient erfassen nach SDS-PAGE. Phosphospecific Antikörper gegen Ser396 haben ebenfalls effizient u gewesensed IRF3 Phosphorylierung nach der nativen PAGE 20 zu erkennen. Wichtiger ist, Ser402 in der C-terminalen Cluster von phosphoacceptor Stellen wurde ebenfalls als wichtig für IRF3 Aktivierung und Phosphorylierung von Ser402 wurde durch Massenspektrometrieanalyse IKKε / TBK1 phosphoryliert IRF3 10,21,28 beobachtet werden. Trotz zwei verschiedene Versuche (NG, unveröffentlicht), sind keine phosphospecific Antikörper derzeit zur Verfügung stehen die Phosphorylierung von diesem spezifischen Rest in vivo zu folgen. Beachten Sie, dass phosphospecific Antikörper gegen Thr157 und Ser339 wurden auch beschrieben 11,13. Diese zusätzlichen phosphospecific Antikörper könnten in einem Verfahren der hochauflösenden SDS-PAGE ähnlich dem hier beschriebenen verwendet werden. In diesem Fall würden zusätzliche große SDS-PAGE-Gelen für jeden Antikörper benötigt und verarbeitet werden auf die gleiche Weise wie Gel # 2 (Abbildung 1). Nach unserer Kenntnis keine phosphospecific Antikörper gegen Ser173 oder Thr390 noch beschrieben worden ist,sie können jedoch einfach auf die hier beschriebene, sobald sie verfügbar werden 14,20 Protokoll hinzugefügt werden.
IRF3 Aktivität wird durch Proteasom-vermittelten Abbau von hyperphosphoryliertem Formen 11,17 beendet. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht auch die Überwachung des IRF3 Verschlechterung, wenn die kinetische Stimulation verlängert und ist auf die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren (MG132, Lactacystin oder bortezomid) gekoppelt ist. Typischerweise wird in A549-Zellen mit SeV infiziert bei 40 HAU / 10 6 Zellen, beginnt IRF3 Phosphorylierung, sobald 2 h nach der Infektion und SeV IRF3 Abbau beginnt nach 12 Stunden. Proteasom-vermittelten Abbau wird aus der beobachteten Abnahme der Formen III und IV Ebenen am späten Zeitpunkten, die in den Bedingungen mit Proteasom-Inhibitoren umgekehrt wird geschlossen. Dies wird auch auf nativen PAGE übersetzen in einer Verminderung der IRF3 Dimer-Werte, die auf Proteasom-Inhibitor-Behandlung 29 zurückgewonnen werden. Wichtig ist, dass die hochauflösende technique hier präsentierten erlaubt die Unterscheidung zwischen den Abbauprozess und ein Mangel an Aktivierung. So haben sowohl Abbau und fehlende Aktivierung IRF3 Ergebnis in Abwesenheit der Detektion von Dimer / Phospho-Ser386 / 396. Jedoch ist der Mangel an Aktivierung mit der Erfassung IRF3 Monomer und der Formen I und II zugeordnet sind, während diese IRF3 Spezies werden nicht erkannt, wenn IRF3 wird 30 abgebaut.
Immunpräzipitation Massenspektrometrie basierende Analyse ist eine Methode der Wahl, um die in vivo Phosphorylierung IRF3 an bestimmten Stellen zu erfassen. Diese Technik wurde verwendet, um die Phosphorylierung von Ser173 in IRF3, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 und Ser402 bestätigen Reste 10,20,21. Allerdings ist die Massenspektrometrie noch nicht eine erschwingliche / benchside Technik, die leicht für die tägliche Analyse der IRF3 Aktivierung nach mehreren Stimulationen zu verschiedenen Zeitpunkten verwendet werden kann. Daher hier beschriebene Verfahren unter Verwendung von SDS-PAGE, native-PAG verbundenE in Kombination mit Immunoblot unter Verwendung von Gesamt-und phosphospecific Antikörper stellt eine praktische, erschwingliche und sensiblen Umgang, um alle derzeit definierten Formen der actived IRF3 zu erkennen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
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