Summary
一种用于获得从土壤获得的X射线计算机断层扫描数据的视觉和定量根部结构信息的方法，提出。
Abstract
植物根系在植物 - 土壤 - 微生物相互作用发生在根际的重要作用，以及与处理气候变化和作物管理具有重要意义。在他们自然环境对根的定量大小的信息是非常宝贵的学习根系生长，在涉及植物环境过程。 X射线计算机断层扫描（XCT）已被证明是用于原位根扫描和分析的有效工具。我们的目的是开发一种没有成本和高效率的工具，从三维（3D）断层扫描数据，而不管其形状接近根部的表面和体积。一个草原dropseed的根结构（ 鼠尾heterolepis）标本用XCT成像。根被重建，并且使用许可和开源软件的组合从数据萃取主根结构。等值面多边形网格然后为便于分析创建。我们已经开发Ť他独立的应用程序imeshJ，在MATLAB 1中产生，以计算从网格根体积和表面积。 imeshJ的输出是表面积（以mm 2）和体积（毫米3）。的过程中，利用从成像定量根分析的工具的独特的组合，进行说明。证明了XCT的结合，开源软件是一个强大的组合，以非侵入性的图像植物根系样品，段根数据，并从中提取三维数据的定量信息。处理三维数据的这种方法应适用于在有相似的X射线衰减的部件和困难之间具有分割产生连接的其他材料/样品的系统。
Introduction
根，作为根际2-5的一部分，代表植物生物学的“看不见”的一部分，因为土壤使得难以图像根非侵入6,7，但是，研究土壤环境中的根生长和相互作用是理解临界根/植物的生长和养分循环，进而影响造林，粮食安全和气候。 X射线计算机断层扫描（XCT）已被证明是在其本地环境8植物根样本的非侵入性成像的有价值的工具。为了测量在不同条件下的根发育和尺寸的变化，并且可以比较从不同的数据集/标本数据，需要提取该断层摄影数据的定量信息。从周围的土壤的根数据的分割，即，基础图像的从一切它周围其他的隔离（包括，例如，一个相邻植物）是ACCU前一个关键步骤率大小分析可以做到的。然而，一个简单的阈值的方法是经常不可行的根数据。在土壤成像植物根部有关的挑战包括在根材料的X射线衰减特性的变化，和引起的水和有机物质的根和土壤之间的衰减值的重叠。这些问题已被寄望Mairhofer 等近期解决。在他们的视觉跟踪工具RooTrak 7,9。成功的分割后的下一步是根体积和表面积的准确测定。体积可以通过计数的体素的数量并作为7之前所示的体素“尺寸的立方相乘来估计。为了更准确地测定根表面积和体积的，所述分段根系的等值面可以由三角形网格使用被称为移动立方体10的算法表示。开源的ImageJ 11可以采用近似第基于对移动立方体算法E根卷。据我们所知，致力于在厘米范围计算为根基于标本断层体积/表面数据只有开放源代码软件数量有限，以上是目前可用12。我们看了13张开源软件侧重于根系生长，旨在细胞特征在单细胞分辨率，可以定量分析的体积。一些专门为整根系统14开源软件是极好的基础上近似，他们的造型实际上是管小口径管的根部系统。然而，随着二维图像一些工作，无法处理3D堆栈14。此外，当表面粗糙和不均匀的形状，如那些树根系统，进行了研究，管状形状近似可能是无效的。另一种方法15使用创新绕过第二维（2D）旋转图像序列Ë需要昂贵的CT扫描仪。它可以测量，记录和显示根系长度。我们从那些仅可以买到16-18测试的软件;一个不出现，以便能够处理三维图像栈16，第二是一个叶面积和根长度测量工具17，而第三个是基于颜色分析18。在此基础上的调查，我们建议，从3D断层扫描数据，而不管其形状接近根部的表面和体积的无成本的选择是理想的。
上可免费获得的RooTrak和ImageJ的基础上，我们已经开发出一种方案，名为imeshJ（参见补充编码文件），其处理来自分段根数据产生的等值面目（表面立体文件），并通过计算该根的体积和表面积做网格上的三角形索引数据简单的几何计算。在这里，我们报告说，综合运用XCT成像的方法，数据重建和可视化（软件CT临3D和VG工作室），从3D数据（开源软件ImageJ的和RooTrak）土壤样品的根分割，并且表面和体积信息提取从三角形网格（ImageJ的和计算机代码imeshJ）。
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Protocol
注意：X射线断层摄影扫描仪的操作需要两个一般辐射训练，和特定仪器的辐射安全训练。相关实验者的实验室所有相应的程序应遵循。
1.根成像
注意：此步骤描述了在管状塑料盆原文土壤保持的草标本的摄像（塑料管，其直径为40毫米，210毫米的高度，以及约2mm壁厚）。
- 放在仪器的样品操纵器盆栽植物在期望目标倍率的距离。在一个2英寸直径的支架的植物中，样品到源的距离应为约3英寸（7厘米）。
- 调整所述X射线扫描设置，以达到最佳的颜色（灰度级）的检测器图像的对比度。注意：这些设置中使用的仪器控制软件可用。
- 一套X射线电源设置; 85千伏和190μA在这次考试中使用PLE。
- 设置曝光时间。这里，被用于更好信噪比1秒的相对长的曝光时间。
- 集数每个投影预测和帧;每个投影4帧，共计3,142预测建议为良好的数据统计。
- 使用运行通过选择“阴影校正”选项卡，并单击“创建”上面设置的测量条件阴影校正。
注意：当具有恒定集合X射线通量的照亮变化在成像装置的像素的响应的阴影校正补偿。这个过程需要空白图像（与光束路径移除样品）与X射线束接通，并且与梁关闭。这种校正被施加到收集到的所有图像。 - 选择“最小化环假象”选项（也称为“穿梭模式”）;样品将在角的步骤，而在投影图像获取旋转。这导致的DAT一个采集以较慢的速度，但有助于消除环假象。
- 通过点击采集标签下的“采集”按钮开始扫描（与上面列出的设置，图像采集将需要大约4小时）。
2.数据重构
注意：本节介绍了从原始图像（从CT扫描X光片）三维数据的重建。
- 加载的原始数据到程序中。
- 比较第一和最后一个图像，以确保样品不移动或扫描设置数据采集过程中没有改变（作为最后图象被检体的360°旋转后取它们应该是几乎相同）。
- 通过选择“旋转中心”选项卡，并单击“开始”计算旋转（COR）的中心;使用选项“自动”COR寻找具有“高品质”的精度，而“双反”（上，下）片小号选举COR计算。
- 选择样本量进行重构：选择“音量”选项卡，并编辑使用缩略图音量选择窗口。
- 执行重建通过单击“开始”，以创建一个包含3D数据的卷文件。
3.数据处理/分割
注：这部分描述了要采取的步骤，以在程序RooTrak跟踪根准备用于进一步处理重建的数据，因为他们从任何周围材料分支通过土壤，并隔离根部产生的仅仅是二进制图像的堆叠根本身。
- 在ImageJ的数据量的处理准备一个RooTrak处理的图像堆栈：
- 加载卷文件到ImageJ的。
- 通过调整亮度和对比度设置优化根系与土壤之间的图像对比（点击图像/调整/亮度/对比度）。当的图像内感兴趣的区域是可见的和clearly区分，设置将被视为进行了优化。
- 保存为JPEG，BMP，或PNG格式的图像堆栈。
- 处理RooTrak分割的根源：
- 加载图像进栈RooTrak（进入“工具”选项卡，然后按“跟踪”）。
- 内根设置种子点：点击内的各相关根段卷中的数据的顶视图切片可见的几个点。
- 设置跟踪参数“平滑度”和“相似性”分别为0.3和0.8。
- 运行跟踪功能。这会跟随根从顶部图像切片一路底部片。
- 查看体数据后，选择根据该可用数据卷片的数目;在这种情况下，跟踪被停止了在200切片，相当于6.2毫米的深度，其中，根的边界变得不明确（被跟踪的根的图像开始混合到该土壤）。
注意：产生的图像堆栈将被自动保存到哪里输出目录已创建。
4.音量和表面分析
注：此步骤描述了从RooTrak创建的图像堆栈等值面网格生成。
- 转换RooTrak图像堆栈成ImageJ的二进制图像格式。选择“进程”，然后是“二进制”，然后“让二进制”。
- 使用开放源代码的ImageJ插件，BoneJ，创造了三角形网格;在ImageJ的选择“插件”，然后在“BoneJ”，然后“等值面”。
- 设置“重采样”和“阈值”为6，120，分别为（默认设置）。勾选“显示面”，然后按“确定”按钮。
- 在“3D查看器”，单击文件选项卡，然后在“导出面”，然后保存为“STL（二进制）”。
- 打开imeshJ，选择STL文件，并在微米像素输入大小。点击“Calculate表面积“在2毫米收购总样本根表面积。同样，点击”计算容积“，取得3毫米的总样本根卷。
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Representative Results
由两个试样茎天然草大草原dropseed（ 鼠尾heterolepis）和原土围绕它是从一个住宅区取和放置在如图1所示的小管形夹持器的该重构的数据的体素尺寸为约31微米×31微米×31微米。重构的卷文件被用于使用开源图像处理程序的ImageJ 1.6 11从一个选定的方向（顶视图）创建图像的堆叠。该卷的数据也亮堂这个计划，以增加根系与土壤值之间的对比。从重建的数据，很明显，根，土壤，最有可能的有机物的部分组件，具有导致小到图像中没 有灰度对比度非常相似的X射线衰减系数（ 图2）。
- [RooTrak，用于分割方案，是在该中心在诺丁汉7大学开发为一体的植物生物学的一个开源项目。它是专门设计，因为他们分支通过土壤，并从周围的材料，以产生二进制图像的堆叠隔离根部跟踪根。 RooTrak已经显示，以产生分割比简单的阈值更好为根数据7,9。里面每个相关根段卷中的数据的顶部切片可见的被选择的种子点（ 图3）则该软件的跟踪功能被运行。的RooTrak参数“光滑”和“相似性”分别设为0.3和0.8。这个范围不断提供良好的灰度值分离和隔离感兴趣的区域好。 RooTrak成功分段体积数据（ 图4），这相当于6.2毫米的深度的选择200片。见segme在动画文件（Rootvideo.mov）根ntation。
ImageJ的使用从通过RooTrak（ 图5）所产生的数据的3D体积（近似孤立根面）的，以产生一个三角形网格，等值面。被选定为“重采样”，并在ImageJ的“门槛”插件BoneJ（见4.3协议）采用默认设置，因为他们在一个相对快速的方式制作了详细的等值面。调节重新采样水平将影响所需的时间，以使该等值面的量。网格被保存在STL格式，和imeshJ用于计算网格的表面面积和体积。用于本研究的重构体积，计算出的表面积为351.87毫米2，体积47.27毫米3（参照图6）。
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图1. 在研究中使用的活体标本。草样品成像在乡土的7“高，1.5”直径的塑料壶。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.分割问题左 ：表示类似的灰度级到根的有机物（OM）成分的样品的水平片段的顶视图;右：数据三维渲染图是类似于灰的所有组件水平的根源。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. RooTrak 顶部 开始点 离开 ：播种的地方开始卷数据的顶视图切片; 右上 ：切片的增强视图通过在左图中红色标广场，种子点相关的根内选择。截面; 下图 ：在红色饱和根被选择用于分割请点击此处查看该图的放大版本。
图4.从不同的“高度”表示由RooTrak分割根三RooTrak。代表双顶视图切片的比较片 。 （A - B）：顶片和分段杆的对应切片; （C - D）：中部地区片和分段根的相应切片; （E - F）：底部区域分片和分段根的相应切片请点击此处查看该图的放大版本。
图5根等值面从ImageJ的捕获。牙根表面是由三角网格近似。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
X射线计算机断层扫描和证明一些开放源代码程序的组合是一个强大的组合，以非侵入性的图像植物根系样品，段根数据，并从中提取三维数据的定量信息（表面积和体积）。我们的可视化和测量功能的能力总是由扫描分辨率，以及由RooTrak软件的限制的限制。然而，扫描分辨率足以捕捉大多数的本研究中的样品的特性，并RooTrak能够成功段根的显著一部分。在这项工作中所用的RooTrak的版本没有跟踪向上行进根段（向上分支不存在于一个显著程度在试样这里所研究）;该方案的更新版本解决了这个问题9。
正如引言中暗示，该文献的调查表明，一个无成本的软件选件来计算根volum从厘米级及以上标本的3D断层扫描数据E /表面积是非常可取的。这里所报告的方法的意义在于，根被分割后，它的工作原理与由广泛使用的程序的ImageJ创建的3D数据格式。分析的心脏是从其图像根由三角网格近似的体积和表面积的计算。在.STL格式由ImageJ的生成的三角网格，由构成该表面近似三角形的指数来表示。imeshJ提取从二进制文件格式指数与能够计算从指数的表面积（这是矢量之间的接合的叉积的简单幅度半分[1,2]和点[1,3]）的体积是通过构建四面体的三角形点和原点之间，并发现之间的标量三重积计算三角形的位置向量。虽然有几种ř对于这样的计算物资跟不上，面临的挑战是有效地计算了包含1000万个三角形向上网格表面积和体积（如可能在更大的根结构的情况下）。通过消除代码循环结构，这将处理的三角形一个接一个，并实施多种方法，使多个数据点的同时处理，我们能够运行上的600万三角计算网格中下5秒。至于样本大小，在20盎司容器盆栽植物会覆盖相同的放大下，整个检测范围，将导致2000切片图像堆栈数据集。如果我们推断从在5秒处理以2,000切片图像堆栈200切片图像栈（经处理的根的本研究中的样本大小，6.2 MM）计算的速度，imeshJ仍然应该处理，根据1分钟。
该方法的产品是表面面积和体积的根样品，其被不从土壤中除去的植物，或以任何方式干扰它确定。计算出的表面积为351.87毫米2，体积47.27毫米3。其他，中间产物是根结构的3D可视化，和根的三角形网格（ 图6）。
在本协议的关键步骤是检体的非侵入性断层成像，以提供足够的密度差（在协议步骤1）中，从样品中（步骤3）的其余部分研究的根部的分割数据，并且根卷和从三角网格，等值面（步骤4）表面面积的计算。以达到最佳的密度相对，在X射线电源设置，85千伏和190微安，根据本示例的检测器响应被选择;较低的X射线功率会产生低劣的色彩对比，而高功率将饱和探测器。数据采集软件的灰度级直方图特征指导用户在决定什么功率设置使用。在一般情况下，与显著有机含量土壤 - 植物样品往往需要较低（> 100千伏）的X射线的电压的设置。
计算出的表面积的精度取决于假设由ImageJ的产生的等值面是一个合理的近似到根的实际表面。这个假设是合理的大根段，但可能被证明较小，所以当与体素的大小尺寸可比根成像。在这项研究中的样品中，整根的大小和它的链段均幅度比的体素尺寸越大。默认的ImageJ / BoneJ设置（见在协议4.3“阈值”参数），导致3.6x10 -4毫米2的三角形相对于9.6x10 -4毫米2图像的像素尺寸必须提供的根表面的精确估计REA。对于具有更小的特征的标本需要更详细地，三角形近似表面的数目可以通过降低“阈值”的值增加（三角形大小减小）。这将导致更长的计算时间。对于根细分尺寸接近像素大小，分辨率工具成为瓶颈，因为体素的形象变得不准确。计算出的体积图的精度也依赖于上述的假设，但为更小的程度，因为较小直径根贡献比例少到根比根部的表面积的量。然而，根的更小的横截面，可以同样有效地如果来自X射线源的距离被最小化扫描。换句话说，要求更高分辨率的数据根段，需要在更高的放大倍数被重新扫描，并且可以得到更精确的度量。表面积计算的准确度也可能是受从土壤根不完善分割。虽然我们从土壤区分根能力取决于在成像步骤取得的颜色（灰度级）相反，分割步骤的改进将有助于减少在计算中的任何错误。新代码将改善RooTrak分割过程开发正在进行中。通过imeshJ所做的计算是由程序的输出比较针对已知体积和表面积在我们的实验室的简单的单组分试样验证。
在有与样品分割相似的X射线衰减的困难组件和出现之间的连接处理的三维数据的这种方法应适用于其它材料/样品的系统。imeshJ将在三维数据的工作从任何来源（PET，MRI扫描）感兴趣的任何物体，只要一个图像堆栈从数据，这被用来创建一个等值面，且STL文件创建这imeshJ使用。计算出的表面积与体积的数字应相比于通过其他方法相同的样品获得的值（将被开发的）来评估这些计算的精确度。这样的比较将是我们进一步细化imeshJ代码的能力非常重要。未来的计划包括一个新的根追踪工具的发展和植物根系样品的高通量成像imeshJ代码。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-Tek/Metris XTH 320/225 kV | Nikon Metrology | X-ray tomography scanner | |
| Inspect X | Nikon Metrology | Instrument control software | |
| CT Pro 3D | Nikon Metrology | Reconstruction software, version XT 2.2 | |
| VG Studio MAX | Visual Graphics GmbH | Visualization software for 3D volumes, version 2.1.5 | |
| ImageJ | Open-source | Image processing and analysis software, version 1.6 | |
| RooTrak | Open-source | Root segmentation software, version 0.3.1-b1 beta | |
| imeshJ | EMSL | MATLAB script developed by the authors | |
| Prairie dropseed grass sample | Sample obtained from ground in residential area |
References
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