Summary
イン土壌取得したX線コンピュータ断層撮影データから視覚的および定量的な根の構造情報を得るための方法が提供されます。
Abstract
植物の根は、根圏で発生する植物土壌微生物の相互作用において重要な役割を果たしているだけでなく、気候変動と作物管理に重要な意味を持つプロセス。彼らのネイティブ環境での根に関する定量サイズ情報は、植物を伴う根の成長と環境のプロセスを研究するための非常に貴重です。 X線コンピュータ断層撮影（XCT） その場でのルート検索と分析のための効果的なツールであることが実証されています。我々は、費用がかから三次元（3D）断層撮影データから関係なく、その形状の根の表面と体積を近似する効率的なツールを開発することを目的としました。プレーリーdropseed（Sporobolus heterolepis）試料がXCTを使用して画像化したの根本構造。ルートを再構成し、そして一次根の構造は、ライセンスとオープンソースソフトウェアの組み合わせを使用して、データから抽出されました。等値面ポリゴンメッシュは、その後の分析を容易にするために作成されました。我々はトンを開発しました彼は、メッシュからのルートボリュームと表面積を計算するために、MATLAB 1で生成されたアプリケーションimeshJを 、スタンドアロン。 imeshJの出力は、表面（ミリメートル2）の領域と（mm 3）のボリュームです。このプロセスは、定量的なルート分析イメージングのツールのユニークな組み合わせを利用して、記載されています。 XCTおよびオープンソースソフトウェアの組み合わせは、非侵襲的画像植物の根のサンプルを、セグメントルートデータ、3Dデータから定量的情報を抽出する強力な組み合わせであることが判明しました。 3Dデータを処理するこの方法は、セグメンテーションで生じる同様のX線減衰のコンポーネントと難し間の接続性がある他の材料/サンプルシステムに適用可能であるべきです。
Introduction
土壌は、非侵襲的に画像のルーツ6、7にことを困難にするので、根は、根圏2-5の一環として、植物生物学の「見えない」部分を表す。しかし、土壌環境の中に根の成長との相互作用を研究することは、理解に重要ですルート/植物の成長と栄養循環、今度は植林に影響を与え、食料安全保障、および気候。 X線コンピュータ断層撮影（XCT）は、それらのローカル環境8植物根サンプルの非侵襲的イメージングのための貴重なツールであることが証明されています。異なる条件下での根の発達と寸法変化を測定し、異なるデータセット/標本からのデータを比較することができるようにするために、一つは断層撮影データから定量的情報を抽出する必要があります。周囲の土壌とはルートデータのセグメンテーション、すなわち、その周囲他のすべて（を含む、例えば、隣接する植物）からルート・イメージの分離は、ACCUの前に重要なステップでありますレートサイズ分析を行うことができます。しかし、単純なしきい値のアプローチは、多くの場合、ルートデータのため実現不可能です。土壌中のイメージング植物の根に伴う課題は、ルート材料のX線減衰特性の変動、および水と有機物質によって引き起こされる根と土壌間の減衰値の重複を含みます。これらの問題は見事にMairhofer らによって最近対処されました。それらの視覚追跡ツールRooTrak 7,9に。成功した分割後の次のステップは、ルート・ボリュームと表面積を正確に決意です。ボリュームは、ボクセルの数をカウントし、7の前に示されるように、ボクセル」サイズの三乗を乗じることによって推定することができます。根の表面積および体積をより正確に決意するために、セグメント化された根系の等値面は、マーチングキューブ10として知られているアルゴリズムを使用して、三角形のメッシュで表すことができます。オープンソースImageJの11番目を近似するために使用することができますマーチングキューブのアルゴリズムに基づいて電子ルートボリューム。我々の知る限り、オープンソースソフトウェアの限られた数は、センチメートルの範囲内のルート標本のための断層撮影ベースのボリューム/表面データを計算に専念し、上記12現在入手可能です。私たちは13を見Oneオープンソースソフトウェアは、根の成長に焦点を当て、単一セルの解像度で定量的なボリュームの分析を可能にする細胞の特徴を目的としています。全体の根系14に専用のいくつかのオープンソースのソフトウェアは、その形状が実際に筒状であることを近似に基づく小径筒状の根系に最適です。しかし、いくつかの2D画像での作業と3D 14スタックを処理することはできません。そのような木のものと粗い表面と不均一な形状の根系は、検討されている場合さらに、筒状の近似が有効でない可能性があります。別のアプローチ15は、革新的な目を回避する二次元（2D）回転画像シーケンスを使用してeは高価なCTスキャナのために必要です。これは、レコードを測定し、根系の長さを表示します。私たちは、商業的にのみ入手可能なものの16-18からテストしたソフトウェア。一つは第三の色分析18に基づいている間に、第2は、葉面積および根の長さの測定ツール17は、3D画像を処理することができるように16のスタックが表示されません。この調査に基づいて、我々は、3次元断層データから関係なく、その形状の根の表面と体積を概算費用がかからオプションが望ましいことを示唆しています。
自由に利用できるRooTrakとのImageJを踏まえ、我々は、セグメント化されたルートデータから生成された等値面メッシュ（表面造形ファイル）を処理する（補足コードファイルを参照してください）imeshJという名前のプログラムを、開発、およびによって根の体積および表面積を計算していますメッシュの三角形のインデックスデータに単純な幾何学的計算を行います。ここでは、XCTイメージングの使用を組み合わせた方法を報告し、三角形メッシュからのデータの再構築と可視化（ソフトウェアCTプロ3DとVGスタジオ）、3Dデータ（オープンソースソフトウェアのImageJとRooTrak）の土壌からの試料の根のセグメンテーション、および表面とボリューム情報の抽出（ImageJの、コンピュータコードimeshJ）。
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Protocol
注意：X線断層撮影スキャナの動作は、一般的な放射線のトレーニング、および商品特有の放射線安全教育の両方が必要です。実験者の研究室に関連するすべての対応手順に従うべきです。
1.ルートイメージング
注：このステップは（40ミリメートル、210ミリメートルの高さは、約2ミリメートルの壁の厚さの直径を有するプラスチックチューブ）チューブ状のプラスチックポットに元の土壌で開催された草の標本の撮像を説明します。
- ターゲット倍率のために所望の距離での楽器のサンプルマニピュレータに鉢植えを置きます。直径2インチホルダー工場については、ソースの距離にサンプルは、約3インチ（7センチ）でなければなりません。
- 最適な色（グレーレベル）検出器画像のコントラストを達成するために、X線スキャン設定を調整します。注：これらの設定は、使用する機器の制御ソフトウェアで提供されています。
- X線電源設定を設定します。 85 kVの190μAは、この試験で使用しましたPLE。
- 露光時間を設定します。ここでは、1秒の比較的長い露光時間は、より良好な信号対雑音比のために使用しました。
- 投影あたりの凸部とフレーム数を設定します。 3142突起の合計投影あたり4のフレームは、良好なデータの統計のために提案されています。
- 「シェーディング補正」タブを選択し、「作成」をクリックすることにより、上記設定された測定条件を用いてシェーディング補正を実行します。
注：X線束の定数セットで照射されたとき、シェーディング補正は、撮像素子の画素の応答のばらつきを補償します。プロセスは、X線ビームを（光路から除去試料で）オン、ビームがオフになって白紙画像を取ります。この修正は、収集された全ての画像に適用されます。 - （また、「シャトルモード」と呼ばれる）「リングアーティファクトを最小化する」オプションを選択します。投影画像を取得している間、サンプルは、角度ステップで回転させることになります。これは、DATにつながります遅い速度で取得するが、リングアーティファクトを排除するのに役立ちます。
- 取得タブの下で、「取得」ボタンをクリックしてスキャンを開始します（上記で概説した設定で、画像コレクションは、約4時間かかります）。
2.データの再構築
注：このセクションでは、原画像（CTスキャンからのX線写真）から3Dボリュームデータの再構成を説明します。
- プログラムに生データをロードします。
- 試料が動かなかったか、スキャン設定は、データ収集中に変更していないことを確認する（最後の画像は、試料の360°回転した後に取られているように、彼らはほぼ同一である必要があります）最初と最後の画像を比較してください。
- 「センターの回転」タブを選択し、「スタート」をクリックすることで、回転の中心（COR）を計算します。 「高品質」な精度で発見使用のオプション「自動」COR、および「デュアル」（上下の）スライスのCORの計算のための選挙。
- 再構築されるべきサンプルのボリュームを選択：「音量」タブを選択して、サムネイルを使用して、ボリューム選択ウィンドウを編集します。
- 「スタート」をクリックすることで、3Dデータを含むボリュームのファイルを作成するために再構成を実行します。
3.データ処理/セグメンテーション
注：この節では、土壌を介して分岐として根を追跡し、ただのバイナリイメージのスタックを生成するために、任意の周囲の材料から根を分離するためにプログラムRooTrakでさらに処理するために再構成されたデータを準備するために取るべき手順を説明しますルートそのもの。
- ImageJのボリュームデータの処理をRooTrak加工画像スタックを作製しました。
- ImageJのにボリュームのファイルをロードします。
- 明るさとコントラストの設定を調整することにより、根と土壌の間の画像のコントラストを最適化します（/明るさ/コントラストを調整/画像をクリックしてください）。画像内の関心領域は、可視およびCである場合learly識別可能な、設定が最適化されたと考えられています。
- JPEG、BMP、またはPNG形式の画像スタックとして保存します。
- セグメントルートへのRooTrakの処理：
- RooTrakにロード画像スタック（「ツール」タブに移動し、キーを押し、「トラッカー」）。
- 根の内部シード点を設定します。ボリュームデータの平面スライスに表示適切なルートの各セクションの内側にいくつかのポイントをクリックします。
- 集合トラッカーパラメータ「滑らかさ」と「類似性」は、それぞれ0.3と0.8に。
- トラッキング機能を実行します。これは、トップの画像スライスからのすべての方法下のスライスにルートに従います。
- ボリュームデータを表示した後、使用可能なデータ量に応じてスライスの数を選択します。この場合には、トラッキングが根境界は（追跡ルートのイメージは、土壌のそれに溶け込むようになった）不明確になった6.2ミリメートルの深さに相当、200スライスで停止しました。
注意：生成された画像スタックは、出力ディレクトリが作成された場所に自動的に保存されます。
4.ボリュームおよび表面分析
注：このステップは、RooTrakによって作成された画像スタックから等値面メッシュ生成について説明します。
- ImageJの中のバイナリイメージフォーマットにRooTrakからの画像スタックを変換します。 「プロセス」を選択し、「バイナリ」は、その後、「バイナリを作ります」。
- 三角メッシュを作成するには、オープンソースのImageJのプラグイン、BoneJを使用します。 ImageJの中に「プラグイン」、次に「BoneJ」、次に「等値面」を選択します。
- それぞれ6、120、（デフォルト設定）に「リサンプリング」と「しきい値」を設定します。 「表示面」を確認し、「OK」ボタンを押してください。
- 「3Dビューア」の「STL（バイナリ）」として保存し、その後、「エクスポート面」に、[ファイル]タブをクリックします。
- オープンimeshJ、STLファイルを選択し、ミクロン単位でボクセルサイズを入力します。クリックして "Calculate表面積に「mm 2で全試料根表面積を取得する。同様に、クリックして「ミリメートル3で全試料ルートボリュームを得るために、計算のボリュームを」。
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Representative Results
2からなる試料は、天然の草プレーリーdropseed（Sporobolus heterolepis）の茎とその周りに元の土壌は、住宅地から採取し、 図1に見られる小さなチューブ状のホルダーに配置。再構成されたデータのボクセルサイズは約31でしたμmでのx 31ミクロンのx 31ミクロン。再構成されたボリュームのファイルがオープンソースの画像処理プログラムImageJの1.6 11を使用して選択された向き（上面図）からの画像のスタックを作成するために使用されました。ボリュームデータはまた、根と土壌の値の間のコントラストを高めるために、このプログラムで明るくしました。復元されたデータから、根や土壌、最も可能性の高い有機物の一部のコンポーネントは、画像内の無グレースケールコントラストに少し、その結果は非常に類似したX線減衰係数（ 図2）を有していることが明らかとなりました。
RooTrak、セグメンテーションのために使用されるプログラムは、ノッティンガム7大学の統合植物生物学のためのセンターで開発されたオープンソースのプログラムです。特に、彼らは、土壌を介して分岐として根を追跡し、二値画像のスタックを生成する物質を周囲の根を分離するために設計されています。 RooTrakルートデータ7,9のための単純なしきい値よりも良好なセグメンテーションを生成することが示されている。シード点は、ボリュームデータの先頭のスライスで見える適切な根部のそれぞれの内部に選択された（ 図3）ソフトウェアのその後の追跡機能を実行されました。 RooTrakパラメータ「滑らかさ」と「類似性」は、それぞれ0.3と0.8に設定しました。この範囲は、常に良好なグレー値の分離を提供し、十分に関心領域を分離します。 RooTrakが正常に6.2ミリメートルの深さに相当したボリュームデータ（ 図4）、の選択200スライスをセグメント化。 segmeを参照してください。アニメーションファイルのルートのntation（Rootvideo.mov）。
ImageJのはRooTrakによって生成されたデータから3次元ボリューム（単離された根の表面を近似する）（ 図5）の三角形メッシュ、等値面を生成するために使用されました。彼らは比較的迅速な方法で詳細な等値面を生成するので（議定書4.3を参照）、「リサンプリング」とImageJのプラグインBoneJで「しきい値」のために用いデフォルト設定を選択しました。リサンプリングのレベルを調整することは、等値面を描画するためにかかる時間に影響を与えます。メッシュは、STL形式で保存し、そしてimeshJメッシュの表面積と体積を計算するために使用しました。本研究で再構成されたボリュームの場合、計算された面積は351.87ミリメートル2であり、体積47.27ミリメートル3（ 図6を参照します）。
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研究で使用したライブ標本 1.図 。草のサンプルが7 "背の高い、1.5"直径のプラスチックポットにその本来の土壌で画像化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.セグメンテーション問題左 ：ルートと同様のグレーレベルの有機物（OM）の構成要素を示すサンプルの水平スライスのトップビュー右：類似グレーのあるすべての成分を示すデータの3Dレンダリングルートにレベル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。RooTrak トップ図3.出発点は、 左 ：播種が開始されたボリュームデータのトップビューのスライスを、 トップ右 ：スライスの増強図は左図の赤い四角でマークされ、シード点は、該当するルートの内側に選択されています。断面; 下 ：赤い色で飽和ルートがセグメンテーションのために選択されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
RooTrakからのスライスの図4の比較。RooTrakによってセグメント化されたルートを示す別の「高さ」からの平面図スライスの3つの代表的なペア。 （A - B）：トップスライスとセグメント化されたステムの対応するスライス。 （C - D）：中間領域のスライスやセグメント化されたルートの対応するスライス。 （E - F）：。底部領域のスライスやセグメント化されたルートの対応するスライスこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ルートの図5.等値面のImageJからキャプチャとして。根面は三角形メッシュで近似した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
X線コンピュータ断層撮影法、いくつかのオープンソースプログラムの組み合わせは、非侵襲的画像植物の根のサンプルを、セグメントルートデータ、3Dデータから定量的情報（面積、体積）を抽出する強力な組み合わせであることが判明しました。特徴を視覚化し、測定するための当社の能力は、常にスキャン解像度によって、ならびにRooTrakソフトウェアの制限によって制限されます。しかし、スキャン解像度は、本研究におけるサンプルの機能の大部分を捕捉するのに十分であった、とRooTrakが正常にセグメントルートの大部分をすることができました。この作業で採用RooTrakのバージョンは（上向き試料はここで研究にかなりの程度まで存在しなかった分岐）上向き走行ルートセグメントを追跡しませんでした。プログラムの新しいバージョンは、この問題9に対応しています。
はじめに示唆したように、文献の調査では、費用がかからソフトウェアオプションはルートvolumを計算することが示唆されましたセンチメートルの範囲内の上記検体の3次元断層撮影データからE /表面積が非常に望ましいでした。ここで報告されたアプローチの重要性は、ルートのセグメント化された後、それは広く使用されているプログラムのImageJによって作成された3Dデータ形式で動作することです。分析の心は三角形メッシュで近似し、その画像からルートの体積および表面積の計算です。 .STLフォーマットでのImageJによって生成された三角形メッシュは、表面近似を構成する三角形の指標で表される。imeshJがある（バイナリファイル形式からインデックスを抽出し、インデックスから表面積を計算することができますベクトル間の外積の単に半分の大きさの接合点[1,2]と点[1,3]。）ボリュームが三角点と原点との間の四面体を構築する、との間のスカラー三重積を求めることによって計算されます三角形の位置ベクトル。いくつかのrがありますがこのような計算のためesources、課題は、効率的に三角形を処理するであろう、コードのループ構造を除去することによって（より大きい根構造における場合のように。）は、10万トライアングルの上方を含有メッシュの表面積と体積を計算することでした一つずつ、および複数のデータポイントの同時処理を可能にするいくつかのメソッドを実装し、我々は5秒未満でメッシュ600万三角形に対して計算を実行することができました。サンプルサイズに関しては、20オンスの容器内の鉢植えは、同じ倍率で全検出範囲をカバーするデータセットとして2,000スライス画像スタックをもたらします。我々は2000スライス画像スタックに5秒で処理200スライス画像スタック（本研究では処理されたルートのサンプルサイズ、6.2ミリメートル）からの計算速度を推定した場合、imeshJはまだ処理する必要があり、その1分下。
この方法の生成物は、表面積と体積であります土壌から植物を削除、またはいずれかの方法でそれを乱すことなく決定されたルートのサンプル、の。計算された表面積は、体積が47.27 mm 3である、351.87 mm 2です。その他、中間製品は、ルート構造の3次元可視化、および根の三角形メッシュ（ 図6）です。
本プロトコルにおける重要なステップは、十分な濃度コントラスト（プロトコールのステップ1）、サンプル（ステップ3）の残りの部分から研究の根元部分のセグメンテーションとデータを提供するために、試料の非侵襲的な断層画像であり、三角形メッシュのルートボリュームと表面積の計算、等値面（ステップ4）。最適密度コントラストを達成するために、X線の出力設定、85キロボルト190μAは、現在のサンプルのための検出器応答に基づいて選択しました。より高い電力が検出器を飽和しているだろうが低いX線パワーは、劣った色のコントラストを作り出しているだろう。データ収集ソフトウェアのグレイレベルヒストグラム特徴は、電力設定を使用するかを決定する際にユーザをガイドします。一般的に、かなりの有機含有量を有する土壌植物試料は、より低い（> 100 kVの）X線電圧の設定を必要とする傾向があります。
計算された表面積の精度はImageJのによって生成される等値面は、ルートの実際の表面に妥当な近似であるという仮定に依存しています。この仮定は、大きなルート・セグメントのための合理的であるが、ボクセルサイズに匹敵する寸法の根が撮像される場合、発注時よりも低いので、証明することができます。本研究ではサンプルでは、完全ルートの大きさとそのセグメントがボクセルサイズよりも大きい大きさでした。デフォルトのImageJ / BoneJ設定（議定書の4.3に「しきい値」パラメータを参照してください）3.6x10その結果-4ミリメートル9.6x10 対 2の三角形-4 mm 2の画像画素サイズが根面aの正確な推定値を提供している必要がありますレア。さらに詳細を必要小さい特徴を有する試験片のため、表面を近似する三角形の数は、「しきい値」の値を下げて（三角形のサイズが減少）増加させることができます。これは、長い計算時間になります。ボクセル表現はあまり正確になるので、ボクセルサイズに近づい寸法のルートセグメントの場合、楽器の解像度は、ボトルネックになります。小径根は根の表面積よりも根の量に比例して少なく寄与するので計算量を図の精度は、上記の仮定に依存し、より小さな程度です。しかし、根の小さい断面は、X線源からの距離が最小化された場合に同様に効果的に走査することができます。換言すれば、高解像度のデータを要求するルートセグメントは、より高い倍率で再スキャンする必要がある、より正確な指標を得ることができます。表面積の計算の精度があってもよいです土壌から根の不完全なセグメンテーションによって影響を受けます。土壌から根を区別する当社の能力は、撮像ステップで達成色（グレーレベル）のコントラストに依存するが、セグメント化ステップの改善は、計算の誤差を減らすのに役立つだろう。 RooTrakセグメンテーションプロセスを改善する新しいコードの開発が進められています。 imeshJによって行わ計算は、我々の研究室で既知の体積と表面積の単純な、単一成分試験片のためのプログラムの出力を比較することにより確認しました。
上の3次元データを処理するこの方法論同様のX線減衰のコンポーネントと難し間の接続は、サンプル・セグメンテーションとが発生される他の材料/サンプルシステムに適用可能であるべきである。imeshJは、任意のソースからの3Dデータ上で動作します（PET、MRIスキャン）関心のある任意のオブジェクト限り画像スタックが等値面を作成するために使用されるデータと、STLファイルから作成されますそのimeshJを使用しています。計算された表面積と体積の数値は、これらの計算の精度を評価するための他の手段（現像される）ことにより、同じ試料について得られた値と比較されるべきです。このような比較は、さらにimeshJコードを洗練する当社の能力のために重要となります。今後は、新たなルート追跡ツールの開発と、植物の根のサンプルのハイスループットイメージング用imeshJコードを含みます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-Tek/Metris XTH 320/225 kV | Nikon Metrology | X-ray tomography scanner | |
| Inspect X | Nikon Metrology | Instrument control software | |
| CT Pro 3D | Nikon Metrology | Reconstruction software, version XT 2.2 | |
| VG Studio MAX | Visual Graphics GmbH | Visualization software for 3D volumes, version 2.1.5 | |
| ImageJ | Open-source | Image processing and analysis software, version 1.6 | |
| RooTrak | Open-source | Root segmentation software, version 0.3.1-b1 beta | |
| imeshJ | EMSL | MATLAB script developed by the authors | |
| Prairie dropseed grass sample | Sample obtained from ground in residential area |
References
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