Abstract
Influenza A-Virus (IAV) Hämagglutinine erkennen Sialinsäuren auf der Zelloberfläche als funktionelle Rezeptoren Eintritt in die Zellen zu gewinnen. Wilde Wasservögel sind das natürliche Reservoir für IAV, aber IAV können die Speziesbarriere zu Geflügel, Schweinen, Pferden und Menschen überqueren. Avian Viren erkennen zu einem vorletzten Galactose durch eine α2-3 Verknüpfung (aviäre-Typ-Rezeptoren) angebracht Sialinsäure während menschlichen Viren bevorzugt Sialinsäure mit einer α2-6 Verknüpfung (Mensch-Typ-Rezeptoren) erkennen. Zur Überwachung, ob Vogelviren für die menschliche Art der Anpassung sind Rezeptoren, können verschiedene Methoden verwendet werden. Glycan-Mikroarrays mit diversen Bibliotheken synthetischer Sialosiden werden zunehmend eingesetzt Rezeptorspezifität zu bewerten. Jedoch ist diese Technik zum Messen avidities nicht verwendet. Messung der Avidität wird durch Auswertung der Bindung von seriell verdünnt Hämagglutinin oder Virus Glykane adsorbiert zu herkömmlichen Polypropylen 96-Well-Platten typischerweise erreicht. In diesem Assay Glykane mit α2-3 oder α2-6 sind Sialinsäuren an Streptavidin Platten an Biotin und adsorbierte gekoppelt sind oder gekoppelt Polyacrylamid (PAA), die direkt an die Kunststoff adsorbieren. Wir haben diesen Test deutlich miniaturisiert durch direktes Drucken von PAA-linked Sialosiden und ihre nicht PAA gebundenen Pendants auf Mikro gut Objektträger aus Glas. Dieses Set-up, mit 48-Arrays auf einer einzelnen Folie, ermöglicht die gleichzeitige Assays von 6 Glycan Proteine bei 8 Verdünnungen, abfrage 6 verschiedene Glykane, darunter zwei nicht sialylierten Kontrollen verbindlich. Dies ist äquivalent zu 18-fach 96-Well-Platten in der herkömmlichen Platten-Assay. Das Glycan Array-Format zur Verringerung der Kosten Verbindungen und biologische Präparate und steigert somit die Effizienz deutlich.
Introduction
Wilde Wasservögel sind das natürliche Reservoir für IAV, aber IAV ist in der Lage die Artengrenze zu Geflügel und Säugetieren, zu überqueren, einschließlich Menschen. Avian iAVS erkennen α2-3 verknüpften Sialinsäuren (aviäre-Typ-Rezeptoren), während menschliche Viren α2-6 verknüpften Sialinsäuren (human-Typ-Rezeptoren) binden. In der Lage sein, effizient zu replizieren , und zwischen Menschen ein avian IAV zu binden muss human-Typ - Rezeptoren 1 übertragen.
IAVS basieren auf Serologie unterteilt, die die Antigenität ihrer Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) Hüllglycoproteine charakterisiert. HA bindet an Sialinsäuren, während NA der Rezeptor zerstörende Enzym am anderen Ende des viralen Lebenszyklus und spaltet Sialinsäure 2 ist. Alle menschlichen infizierenden Viren, einschließlich H1N1, H2N2 und H3N2, haben einen aviären Ursprungs 3. In den letzten zwei Jahrzehnten mehrere avian für die menschliche Crossovers aufgetreten sind, mit H5N1, H7N7 und H7N9 die bekanntesten sind; however, haben andere Subtypen Menschen mehr sporadisch infiziert (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Glücklicherweise scheint es , dass keine dieser Viren vollständig konnten bis zu α2-6-verknüpfte Sialinsäure - Rezeptoren 5-8 human-Typ anzupassen. Die Anpassung von Vogel- oder anderen zoonotischen Viren-Replikation und Übertragung in menschlichen Wirten aufnehmen eine verheerende Wirkung auf die menschliche Gesundheit haben könnten. Daher sollten Sie vor Wissen, wie diese Viren Mensch-Typ-Rezeptoren zu binden, werden weiterentwickelt werden weltweite Überwachung von Schwellen Influenza-Viren helfen.
Bestimmung der Rezeptor bevorzugt wurde aufgeklärt erste Erythrozyten verschiedener Arten verwendet und bleibt ein beliebtes Test unter Grippe Forscher 12.09. Die Demonstration, die Vogelviren α2-3 Sialinsäure und menschlichen Viren erkennen α2-6 Sialinsäure verknüpft wurde auf einem Test basierte ursprünglich enzymatisch konstruiert unter Verwendung von Hämagglutination von Erythrozyten jeder der li enthaltennkages 13,14. Obwohl die Auslese Hämagglutination, ein Standardtest für virologists ist, werden die zugrundeliegenden Glykanstrukturen nicht definiert, sondern nur die terminaler Verknüpfung. Zusätzlich kann die beschränkte Verfügbarkeit der Sialyltransferasen, verwendet , um die Zellen erneut sialylieren, haben die Verwendung dieses Assays 15-18 begrenzt. Anschließend andere Verfahren zur Bestimmung der Rezeptorbindungspräferenzen wurden unter Verwendung von sialylierten Glycanstrukturen auf poly-acrylamid (PAA) oder Poly-Glutamat (PGA) Strukturen in plattenbasierten Assays 19,20 verknüpft eingeführt. Verschiedene Varianten sind möglich , entweder die Glykane oder Viren auf Mikrotiterplatten in der Beschichtung, von denen jede ergibt eine robuste, zuverlässige und sehr empfindlichen ELISA-Typ - Assay 21-23. Alternativ können Biotin-gebundene Glykane können PAA / PGA ersetzen und kann auf 2,24 Streptavidin-beschichteten Platten konjugiert werden. Obwohl einige spezifische Seren erforderlich sein können, ELISAs sind Standard und mehrere an PAA verknüpften Glykanen leicht sind commercially und nicht im Handel erhältlich (Konsortium für Funktionelle Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glycan Microarray - Technologien haben als ein unschätzbares Werkzeug entstanden Rezeptorspezifität zu bestimmen, wie mehrere verschiedene Glykane gesichtet werden, und auf eine breite Palette von unterschiedlichen Strukturen Bindung kann 25-29 in einem einzigen Assay beurteilt werden. Die Bindung von IAV auf diese Strukturen ein besseres Verständnis der Glycan - Strukturen , die IAV bevorzugt 30-33 erkennt. Glycan-Mikroarrays erfordern geringe Mengen an Probenvolumen einen Bindungstest durchzuführen und verwendet nur winzige Mengen von Glycan pro Spot (2 nl). Allerdings sind in der Regel diese Arrays nur zu bewerten Spezifität von Glykane Rezeptoren verwendet. Analyse mehrerer Viren oder Hämagglutinin-Proteine, an mehreren Konzentrationsbereiche können aufgrund der Anzahl der Folien erforderlich prohibitiv sein. Darüber hinaus bis heute wurde keine relative Avidität Test unter Verwendung von Glycan ar entwickeltray-Techniken.
Um den geringen Probenbedarf von Glycan-Mikroarray-Techniken und der Empfindlichkeit der PAA-Glycane in ELISA-basierten Assays lieferte kombinieren, haben wir versucht, eine Multi-Well-Glycan Array zu entwickeln, die für die Hochdurchsatzanalyse mit ähnlichen oder besseren Auflösung erlauben würde, im Vergleich zum herkömmlichen ELISA-basierenden Assay. Gleichzeitig wollten wir verbraucht, um die Menge von Biologika und Reporter Chemikalien zu minimieren. Das endgültige Ergebnis ist ein miniaturisiertes Avidität Assay, speziell entwickelt für die Überwachung der IAV Spezifität und ist gleichermaßen anwendbar andere Glykan Bindungsproteine zu beurteilen. Mit einem Glasobjektträger getrennt in 48 Mikrovertiefungen durch eine Teflon-Maske, 6 verschiedene Glykane in 6 Wiederholungen gesichtet pro Vertiefung. Die Microarray-Plattform bietet die gleichen Trends in der Rezeptor im Makro-ELISA-Format mit mehreren Vorteilen gesehen Bindung. Dazu gehören (I) Druck der Verbindung in 6 Wiederholungen, minimale Probe mit, im Vergleich zu der Beschichtung von mehreren Reihen ina Platte, unter Verwendung von 100 & mgr; l pro Vertiefung; (II) mehrere verschiedene Verbindungen analysiert gleichzeitig in einem einzigen gut, einschließlich der Kontrollen; (III) eine massive Verminderung der Inkubationsvolumen und; (IV) ein größerer Dynamikbereich ein Fluoreszenzsignal verwendet wird. Eine einzelne Folie kann berechnet werden zu 18-fach 96-Well-Platten äquivalent.
Mit dem folgenden Protokoll, jedes Labor der Lage, die Herstellung und Analyse von spotted Microarrays Lage sein sollten, diese miniaturisierten ELISA-Format herzustellen.
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Protocol
HINWEIS: Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist.
1. Array Construction
- Glycan Vorbereitung und Teller-Setup
- Bereiten Sie einen Vorrat an Druckpuffer. machen Zuerst wurden 500 ml einer 150 mM Stammlösung von Natriummonohydrogenphosphat. Stellen Sie außerdem 50 ml einer 150 mM Stammlösung von Natriumdihydrogenphosphat Lösung. In einem Kolben mit einem Magnetrührstab und einem pH-Meter, langsam die dibasische Natriumphosphatlösung mit der einbasigen Lösung titriert, bis ein pH von 8,5 erreicht ist. Hinzufügen, Tween-20 0,005%.
- Bereiten Sie die Glykan Proben. Verdünnte PAA konjugierten Glykane (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) und 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (1A )) aus step1.1.1 in Druckpuffer verdünnt auf 100 ug / ml werden. Monovalent Glykane,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) und 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) bis 100 um in Druckpuffer aus Schritt 1.1.1. Schließlich bereiten die Amin-funktionalisierte Farbstoffe, als Gittermarkierungen / Landelichter zu verwenden. Dye Marker Spots werden bei 1 uM gedruckt.
HINWEIS: Atto488-NHS Farbstoff wird in unserer Drucke verwendet. Jedoch kann jedes Amin-funktionalisierten Farbstoff, lesbar durch den Objektträger-Scanner ist für diesen Zweck geeignet ist. - Transfer 10 ul jeder Probe Glycan auf 384-well Mikrotiterplatten für die Druckroboter verwendet. Nicht verwendete Glykane in Druckpufferlösung bei -20 ° C in verschlossenen Röhren. Tansfer 10 ul der Farbstoffmarker auf der Druckplatte.
- Drucken
HINWEIS: Alle steps, die Sorge zu berühren oder die Folien bewegen müssen mit Handschuhen erfolgen.- Legen Sie Arrayers Stifte in den Druckkopf nach der korrekten Konfiguration des Layouts. Für dieses Layout einen Stift verwenden, um alle Proben und Arrays zu drucken. Drucken Sie die Glykane in Blöcken von sechs, das Überspringen einer Funktion (eine Funktion als einzelner Punkt einer bestimmten Verbindung definiert ist), auf jeder Seite, so dass Flecken von derselben Probe nicht genau nebeneinander gedruckt werden.
HINWEIS: Der Endbenutzer die Konfiguration entscheiden muss. - Die Objektträger aus Taschen, offene Felder, und entfernen Sie alle Staubpartikel oder kleine Stücke aus Kunststoff, die durch Einblasen von ultrahochreinem Stickstoffgas auf jeder Folie auf ihren Oberflächen sein könnten. Legen Sie die gewünschte Anzahl der Folien, beschichtete Seite nach oben, auf der Arrayers Bühne.
- Programm die Arrayer, verwenden, um die Parameter von 27 Flecken pro Besuch der Quellenplatte, 3 unter Verwendung von "pre-spots" auf Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit an der Spitze der Drucknadeln zu entfernen
- Schalten Sie MPU (Hauptstromeinheit) und Climate Control Unit. Offene Tiling Analyse-Software auf dem Computer.
- Wählen Sie das Layout auf den Druck. 1 Einzel Stift - für den Druck des Array 1 x 1 Druckwerkzeug Wählen Sie Optionen → Pin-Werkzeug verwendet werden soll. Wählen Sie die Registerkarte Ziel → Werkzeug Array Definition → Druck-Muster und fügen Sie die Tonhöhe (Spot-zu-Spot-Abstand), die Anzahl der Zeilen und Spalten, die Proben aufzunehmen gedruckt werden, und das Druckmuster der Proben (für dieses Array ein 8 x 8 Druckmuster wird auf 340 um Platz für insgesamt 7 Proben).
- Wählen Sie Ziel → Folienlayout und programmieren Sie den Block-zu-Block-Abstand zu ermöglichen, Drucken jedes Replikat Arrays in die 48-Well (4 x 12) Dia-Vorlage. Quelle auswählen und fügen Sie die Anzahl von Source-Pickups (1 für jede Probe bei der Verwendung von 1-polig) (für diesen Druck 7 Quelle Pickups verwendet werden, um Platz für 6 Probenvertiefungen und 1 Farbstoff Marker gut).
HINWEIS: Der Dialog Quelle sollte GRÜN zu zeigen, dass die Zahlvon Quelle Besuche entspricht die Proben in dem Druckmuster gedruckt werden. - Ziel → Adapterplatte auswählen und Layout schieben und die Foliennummer einstellen (5 Dias werden mit 1 Vorbehandlungs Folie gleichzeitig für diesen Druck gedruckt).
- Lassen Sie das Fach durch Klicken auf die T1-Taste, um das Fach zu aktivieren und fügen Sie die gewünschte Anzahl von Dias auf dem Tablett, aufmerksam auf die Standorte der Vordetachierung Schieber (BLAU) und "echten" Dias.
- Legen Sie Normalglasträger bei den restlichen Vakuumanschlüsse um das Vakuum zu blockieren und klicken Sie auf OK, um das Vakuum zu aktivieren. Überprüfen Sie, ob alle Objektträger in Position gehalten werden, und klicken Sie auf OK, um das Tablett in die Ausgangsposition zurückzukehren.
- Legen Sie die Druckplatte in den Plattenhalter und sicherzustellen, dass das Gestell richtig an Ort und Stelle festgelegt ist. Klicken Sie auf GO und lassen Sie den Druckvorgang fortzufahren.
- Drucken Sie die restlichen 24 Punkte in Replikaten von 6 Punkten pro Array (4 Arrays / Quelle besuchen).
- Legen Sie die 384-Well-Plattenin den Drucker und das Drucken. Pflegen Sie relative Luftfeuchtigkeit, während des Druckens, während des gesamten Druck zwischen 55 und 65%. Der Drucker stoppt nach 5 Folien drucken.
HINWEIS: Während der Mikroarray in diesem Test in einem bestimmten 8 x 8 Muster gedruckt wird, werden verschiedene Microarray-Druckroboter Ausrüstung spezifische Programmierung erfordern das gewünschte Layout zu erzielen. Es liegt Benutzer an das Ende des am besten geeigneten Muster ihre Ausrüstungen Spezifikationen "gegeben, um zu bestimmen.
- Legen Sie Arrayers Stifte in den Druckkopf nach der korrekten Konfiguration des Layouts. Für dieses Layout einen Stift verwenden, um alle Proben und Arrays zu drucken. Drucken Sie die Glykane in Blöcken von sechs, das Überspringen einer Funktion (eine Funktion als einzelner Punkt einer bestimmten Verbindung definiert ist), auf jeder Seite, so dass Flecken von derselben Probe nicht genau nebeneinander gedruckt werden.
- Luftbefeuchtung / Immobilisierende
HINWEIS: Sobald die Folien Druck fertig sind, durchlaufen sie eine vorübergehende Stillegung Schritt, auch genannt Befeuchten. Befeuchten nach dem Druck hilft, die Probe Befestigung durch erneutes Benetzen der Flecken und gewährleisten vollständige Blockierung zu homogenisieren.- Setzen Sie gleitet in einer 100% Feuchtigkeitskammer unmittelbar nach dem Druck für einen Zeitraum von 30 min. Konstruieren Sie die Kammer durch eine sehr nasse Handtücher flach in den Boden einer großen Glasschale platzieren, platzieren Sie die Folienauf irgendeine Art von Rack, wie ein Reagenzglasgestell, Druckseite nach oben und mit Plastikfolie zu stoppen in der Feuchtigkeit abzudichten.
- Anzahl gleitet mit einem Alkohol / lösungsmittelbeständigen Markierungsstift und an einem Austrocknungs Box. über Nacht trocknen.
- Nummerierung, Sperrung und Lagerung
- Bereiten Sie den Blockierungspuffer - 50 mM Ethanolamin in 50 mM Boratpuffer. Zunächst lösen Borsäure, in ddH 2 O zu einer Endkonzentration von 50 mM in einen Kolben mit einem magnetischen Rührstab enthält. Rühren Sie die Lösung kräftig auf einer Rührplatte, bis alle Feststoff gelöst hat. Unter ständigem Rühren die entsprechende Menge an Ethanolamin aus einer 16,54 M Stammlösung Fügen Sie die gewünschten 50 mM Konzentration zu erreichen. Hinzufügen konzentriertem Natriumhydroxid auf einen endgültigen pH von 9,2 einzustellen.
- Tauchen Sie die bedruckten Folien in der Blockierungspufferlösung für 1 Stunde.
- Nach 1 h Spülen Sie die Folien in ddH 2 O überschüssige Spuren von Blockierungspuffer zu entfernen.Entsorgen Puffer in einem geeigneten Abfallbehälter zu blockieren.
- Die Objektträger in Glasfärbung Halter und trocken schleudern. Trocken Arrays von ihnen in einer Zentrifuge mit Schwingplattenhalter, mit einer Geschwindigkeit von 10 g für 5 min setzt.
- Sobald die Objektträger trocken sind, können sie sofort oder gelagert inkubiert werden. Lagerbedingungen sind 20 ° C in einem verschlossenen Plastikbeutel.
2. Analysieren von Glycan-Bindungsproteine
- Bereiten einer befeuchteten Kammer, in der die Arrays hybridisiert werden sollen, passen. Eine einfache Kammer besteht aus einem Pyrexschale, mit angefeuchteten Papiertüchern auf dem Boden geschichtet und einem Gestell, auf dem die Schlitten ruhen wird.
- Verwenden biotinylierten Lectinen SNA (Sambuca nigra agglutinin) und ECA (Erythrina cristagalli Agglutinin) bei 10 & mgr; g / ml + 2 & mgr; g / ml Streptavidin-555 - Farbstoff, in Sondierungspuffer (PBS + 0,01% Tween-20). Für HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 und A / KY / 07 H1N1, in diesem Beispiel), die Verwendungeine Ausgangskonzentration von 20 ug / ml vor-komplexierte, wie zuvor beschrieben 34. Kurz gesagt, eine HA machen: Mouse-α-Strep: Ziege-α-Maus-Alexa647 Mischung Puffer (PBS + 3% BSA + 0,01% Tween-20) bei einer 4 in Blockierungs: 2: 1-Molverhältnis.
HINWEIS: Das Array wird mit Lektinen sondiert , um festzustellen , daß Glycane immobilisiert und nachweisbar (Abbildung 1B). - Übertragen Sie die Glykan-Bindungsprotein-Antikörper-Mischlösung von 20 & mgr; l zu einer 384-Well-Platte und Inkubation auf Eis für 30 min. verdünnte seriell Lektin und HA Proben 1: 1, in den entsprechenden Puffer, 8-mal, um 10 & mgr; l Probe mit 10 ul Puffer gemischt wird.
- Pipette 8 & mgr; l der Probe auf den Mikrovertiefungsoberfläche und inkubiere in dem abgedichteten Befeuchtung (100% RH) Kammer für 90 min.
- Waschen Sie die Folien einzeln nacheinander an den Rändern halten und sie viermal in einem Gemisch aus PBS und 0,05% Tween, dann viermal in PBS und schließlich viermal in entionisiertem H 2 O getaucht Mitdas gleiche Trocknungsprotokoll in dem Blockierungsschritt beschrieben, drehen sich die Anordnungen in einer Zentrifuge für 5 Minuten bei 10 x g trocknen.
3. Scannen und Datenanalysen
HINWEIS: Die Glycan-Mikroarrays können bei unterschiedlichen Einstellungen gescannt werden, je nach Angaben des Herstellers Microarray-Scanner. Durch Variation der Laserleistung und Auflösung, kann das Gerät ein Bild zu erzeugen , mit so vielen Signalen wie möglich innerhalb seines Dynamikbereichs (Abbildung 1C).
- Verwenden Sie einen fluoreszierenden Dia-Scanner und scannen die Arrays unmittelbar nach der Inkubation mit den Glycan Bindungsproteine. Achten Sie darauf, die Rutsche, um sicherzustellen, richtig in das Scan-Gerät eingesetzt wird.
- Öffnen Sie Scan-Software. Klicken Sie auf Start, das Programm zu öffnen. Eine Verbindung mit Scanner: Scanner → Verbinden oder grüne Taste in der Scanner-Navigationsfeld-Menü.
- Öffnen Sie Autoloader Tür des Scanners. Die Objektträger in Schlitze in Autoloader in einer bestimmten Reihenfolge. Schließen Autoloader Tür. Click "lesen loader" im Tools-Navigationsfeld automatische Erkennung Dias in den Scanner.
- Stellen Sie Scan - Parameter: Scanner → Scan - Parameter entsprechend dem Experiment (zB 635 Laserleistung hoch, Erfassungsverstärkung 50%). Scannen von Dias: Scanner → Scan. Wählen Sie den Pfad durch das Erstellen eines Ordners die Scan-Bilder und Namen einzelnen Scans zu speichern. Tun Sie dies vor dem eigentlichen Scannen. Wiederholen Sie für jede einzelne Folie. Klicken Sie auf OK, um das Scannen zu starten.
- Verwenden Sie die Scanner-Software das Gerät einzurichten und zu scannen, um die Dias. Stellen Sie Scanner scannen iterativ bei niedrigen Laserleistung (5 mW) mit zunehmender Gain-Einstellungen von 25%, 50% und 75%.
HINWEIS: Die Einstellungen können getestet und optimiert werden, aber bedenken Sie, dass jeder Scan möglicherweise die Fluoreszenz Ausgabe der Farbstoffe aufgrund Photobleaching senken kann.- Offene Datenerfassung und Analyse-Software wie MAPIX Software. Klicken Sie auf Start, das Programm zu öffnen. Öffnen Sie Scan-Bild: Datei → Öffnen imAlter. Öffnen Sie GAL-Datei: Analysieren → Öffnen Raster und wählen Sie den entsprechenden GAL-Datei.
- Geben Sie Blöcke Modus: Bild → Blöcke Modus, um das Raster zu bewegen. Verwenden Sie die Gittermarkierungen das Gitter an der entsprechenden Stelle auf der Folie einzustellen. Passen Sie einzelne Blöcke als notwendig, um die gedruckte Array entsprechen.
- Geben Sie Flecken-Modus: Bild → Spots Modus Lage und Größe der einzelnen Spots innerhalb des Blocks einzustellen. Sobald alle Blöcke und Spots eingestellt und an Ort und Stelle, messen Signalintensitäten durch Analysieren → Photometrische Berechnungen. Speichern Sie die Ausgabedatei.
- Sobald die Dias Scannen fertig sind, werden die Bilder für die Bindung von Signalen mit dem Bildbearbeitungsprogramm installiert ist (- G 1D) analysiert. Für die Bildanalyse, legen Sie eine GAL (Array-Liste) Datei über das TIFF-Bild gescannt.
HINWEIS: Die GAL-Datei enthält sowohl das Punktlayoutmuster und Identitäten jedes Spots Lage. GAL-Dateien für Arrays sind created durch die Druckersoftware ein Tab-separierte Textdatei, die die Identität der Proben enthält und ihre Position in der 384-Well-Source-Platte. - Verwenden Sie die Raster-Marker / Landelichter auf den Mikroarrays gedruckt, um richtig die GAL Gitter platzieren. Einzelnen Spots müssen einzeln bewegt werden, sondern ein gut gedruckten Arrays werden im Allgemeinen Blöcke innerhalb des Gitters ermöglichen, mit Leichtigkeit zu platzieren. Nach Gitter Platzierung, sammeln Spotintensitäten von der Software und als Tab-getrennte Textdatei (.txt) gespeichert.
- Mit Tabellenkalkulationsprogramm, öffnen Sie die Ausgabedatei vom Scanner. Öffnen Sie das entsprechende Makro-Datei aus dem Ordner. Klicken Sie auf Ansicht → Makro → RunMacro.
HINWEIS: Die Pre-geschrieben, um die rohen Ausgangsdaten kopiert, entfernen Sie unnötige Zeilen und Spalten sortieren Sie die Daten, die von Probe, berechnen die durchschnittliche mittlere Signal minus Hintergrundwerte und zeichnen Sie die resultierenden Werte in zu einem Tabellenkalkulations-Arbeitsblatt die Graphen für die jeweils der sechs samples auf dem Array getestet.
- Mit Tabellenkalkulationsprogramm, öffnen Sie die Ausgabedatei vom Scanner. Öffnen Sie das entsprechende Makro-Datei aus dem Ordner. Klicken Sie auf Ansicht → Makro → RunMacro.
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Representative Results
Drucken, Scannen und Datenanalysen
Um eine ordnungsgemäße Druck, ist es wichtig, die richtige Ausrichtung des gefleckten Gitter innerhalb der Teflonmaske zu haben, die jedes Array auf dem Schlitten abgrenzt. Während des Druckvorgangs aufgrund der Natur der Teflonbeschichtung, spots kann nicht mit dem bloßen Auge auf den MPX Folien gesehen werden. Augenmerk wird dann auf die Erscheinung der vorge Flecken auf den poly-L-Lysin beschichtete Objektträger gelegt. Direkt nach dem Drucken, sollte jede Folie mit dem Auge auf das Vorhandensein von jeder getupft Verbindung überprüft werden, dass aufgrund der Puffer-Salzen in der Stelle getrocknet sichtbar ist. Arrays sind für die korrekte Ausrichtung der Flecken innerhalb der Teflon Grenzen und korrekte Anzahl von spotted Merkmale geprüft.
Die Objektträger werden in einem iterativen Prozess von niedrigeren zu höheren Scan-Leistung gescanntes Foto Bleichen zu vermeiden und ermöglicht den Vergleich von higihre Avidität Avidität bindende Proteine zu senken, die höhere und niedrigere Ausgangssignale sind. Nach Abtastung werden die Fluoreszenzintensität jedes Punkts in der Ausgangsbilder gemessen, um ein Imaging-Programm verwendet wird. Jeder Array wird mit einer Rasterdatei überschichtet, die die Anzahl von Merkmalen auf der Array - Oberfläche (1D - G) gedruckt einstimmt. Verwendung gedruckten Fluoreszenzfarbstoffe sind die Ränder der gedruckten Glykane definiert und eine Maske, die mit der Identität der gedruckten Probe integriert ist Lassos jeder Stelle. Die Abbildungsmaske lasso wird alle Aspekte des abgebildeten Flecks aufzeichnen (Größe, Signalstärke, Koordinaten im Netz, etc.) und Ausgang , diese Informationen zu einem Tab-getrennte Textdatei. Mit Tabula Software (Tabelle) werden die Proben durch Identität sortiert und die mittlere Signalintensität minus Hintergrund wird über 4 der 6 Punkte für jede Probe gemittelt, die höchste und niedrigste Signal als Ausreißer auslassen. Ein Liniendiagramm des durchschnittlichen mittleren Signalminus Hintergrund gegen den acht Proteinkonzentrationen auf das Array aufgebracht aufgetragen und enthält eine Zeile für jede Probe. Die Endausgabe Graph wird geglättet , um eine nichtlineare Regressionsberechnung unter Verwendung von (1I).
Glycan-bindende Proteine
Die PAA-Array wird verwendet, Rezeptor-Bindungsspezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten zu bewerten. Ein weiteres Merkmal des Arrays und nicht in der analogen Plattentest, ist die Einbeziehung von nicht-sialylierten Kontrollen in der gleichen Mikro gut. Um zu beurteilen, dass gedruckte Verbindungen nach dem Druck vorhanden sind, häufig verwendete Pflanzenlektinen mit bekannten Spezifität verwendet wurden. ECA bindet an terminale Galactose β1-4 gebunden an N-Acetyl-Glucosamin (Galβ1-4GlcNAc oder LacNAc) und wird nicht binden, wenn das terminale Galactose mit Sialinsäure verkappt ist. ECA erkennt nur die nicht-sialylierte Glykane auf unserer miniaturisierten Glykan array (2A). Der Mangel an einem der sialylierte Glycane Proben der Bindung ist auch ein Hinweis, dass diese vollständig mit terminaler Sialinsäure begrenzt. Für α2-6 verknüpften Sialinsäure wurde SNA als Lektin - Steuerung (2B) verwendet. Wie erwartet, SNA bindet nur verknüpfte Sialinsäuren zu α2-6, aber mit bemerkenswerten Unterschiede in der Affinität für PAA-verbundene nicht PAA-verknüpften Di-LacNAc wiederholt. Dieser Unterschied spiegelt die Empfindlichkeit von PAA-verknüpften Glykane und ermöglicht die Unterscheidung von Proteinen, die mit niedriger Avidität binden. Für α2-3 Sialinsäure verknüpft, Hämagglutinin ein H5 vom Stamm A / Vietnam / 1203-1204 Virus , das α2-3 verknüpften Sialinsäuren bekannt ist , nur wurde 6 verwendet zu erkennen. Das Bindungsprofil der H5 HA zeigt tatsächlich Spezifität für α2-3 verknüpften Sialinsäuren, mit einer höheren Avidität für die PAA-verknüpften Strukturen (Abbildung 2C). Schließlich wurde das H1-Hämagglutinin von einem menschlichen saisonalen H1N1-Stamm verwendet, dass, wie erwartet, nurzu α2-6 verknüpften Sialinsäure enthaltenden Strukturen (2D) gebunden.
Abbildung 1: Drucken, Scannen und Bildanalysen (A) PAA-konjugierte 6SLNLN als repräsentativer Glykanstruktur gezeigt, die auf den Glasträger gedruckt wird.. (B) Inkubieren einer Glykan Bindungsprotein auf der Multi-Well - Glykan - Array wird mit einer 8 & mgr; l Volumen gezeigt , dass ein Tröpfchen auf der Array - Oberfläche erzeugt. (C) Nach der Inkubation der Glycan - Bindungsproteine auf dem Array und das Scannen in einem konfokalen Fluoreszenz Diascanners, ein repräsentatives Bild erhalten. (D) Das Bild mit einem Gitter und unter Verwendung von Raster - Marker für eine korrekte Ausrichtung überlagert wird, werden die einzelnen Spots analysiert werden. (E) Eine Nahaufnahme von einem kompletten Satz von 8 - Arrays, in denen ein einzelnes Glykan - bindendes Protein1 Verdünnungen: mit acht 1 wurde analysiert. (F) einem einzigen Array in einem einzigen Bohrloch dargestellt ist ; die Anordnung durch die Gittermarkierungen in der oberen rechten (3 spots) und unten links (2 spots) dieses Glykan Bindungsprotein bindet, eine einzige Verbindung auf dem Array als ein Replikat von sechs ist deutlich sichtbar abgegrenzt ist. (G) Das Gitter ist mit Lassos umschließenden spezifischen einzelnen Spots gezeigt. (H) Imaging - Software berechnet Signalwerte aus der Bilddatei und gibt eine durch Tabulatoren getrennte Datendatei. (I) können die Daten in eine Tabelle oder eine stastical Software tabellarisch werden , um eine repräsentative Leistungsdiagramm zu erstellen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Ausgabe von Pflanzenlektinen (ECA, SNA) und IAV hemagglutinins mit unterschiedlichen Spezifitäten (H5 vom A / Vietnam / 1203-1204, H1 von A / Kentucky / 07). (A) bindet ECA Terminal LacNAc oder Galb1-4GlcNAc spezifisch und erkennt das Vorhandensein der nicht-sialylierten Verbindungen, als Kontrollen verwendet für IAV Hämagglutininarten. (B) SNA erkennt nur Glykane ein Terminal α2-6 Sialinsäure trägt. (C) Das rekombinante Hämagglutinin des H5N1 (A / Vietnam / 1203/04) Stamm bindet Sialinsäuren und liefert einen aviären Typ - Rezeptor - Bindungsprofil a2-3. (D) Das rekombinante Hämagglutinin eines menschlichen saisonalen H1N1 (A / Kentucky / 07) bindet an nur ein Mensch-Typ-Rezeptoren. Fluoreszierende Signalintensität wurde für jede Stelle gemessen, und die mittlere Intensität minus bedeuten Hintergrund berechnet wurde Tabellenkalkulationsprogramm. Für jede Glycan wird die mittlere Signalintensität berechnet aus 6 repliziert Flecken. Die höchsten und niedrigsten Signale der 6 Replikate werden entfernt und die restlichen 4 ReplikatTES verwendet, um die mittlere Signal, Standardabweichung (SD) und Standardfehler-Messung (SEM) zu berechnen. Die Diagramme stellen die gemittelte mittlere Signal minus Hintergrund für jede Probe und Fehlerbalken sind die SEM - Wert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
IAV Rezeptorspezifität Die Beurteilung ist ein wichtiger Schritt in Pandemie-Potenzial von Vogelviren zu analysieren. Sialinsäure-Erkennung durch das Virus auf mehrere biologische Eigenschaften verbunden, wie beispielsweise die Bindung an und die Freisetzung aus der Zelle. Deren Kenntnis Aminosäure Mutationen sind notwendig für die Vogelviren zu erreichen α2-6 Bindung und überqueren die Speziesbarriere Pandemievorsorge ermöglicht. Verschiedene Assays werden verwendet Rezeptorspezifität zu bestimmen; aber alle haben ihre Nachteile, einschließlich nur Avidität zu messen und nicht die Spezifität und umgekehrt.
Hier beschreiben wir eine neuartige miniaturisierte Werkzeug basiert auf dem weit verbreiteten und anerkannten ELISA, die PAA-Linked-Terminal Fragmente komplexer Glykane verwendet. Unter Verwendung von 4 gut definierten Lektine, 2 von Pflanzen- und 2 von Influenza-A-Virus Herkunft, zeigen wir, dass wir die Spezifität und der relativen Avidität halten.
Wenn wir berechnen die Höhe der Reduzierung von Chemikalien und Biologschen, die von den ELISA auf eine Glycan-Array-Chip zu miniaturisieren, erreichen wir auffallend große Unterschiede. Zuerst werden die biologische Präparate; wir verwenden 10x weniger Testvolumen und 6 Testverbindungen in 6 Wiederholungen verwenden; dies kann das Äquivalent von 36x Reihen zu sein in 96-Well-Platten berechnet werden. Das Ergebnis ist, dass wir 360x weniger Biologicals verwenden. Kritische Schritte umfassen richtigen Druck und die Gefahr des hohen Hintergründe ungereinigtem Glykan Bindemittel oder schlechte Nachweis von Antikörpern verwendet wird.
Die Verbindungen in diesem Test verwendet, obwohl immer noch verfügbar sind, werden nicht leicht durch chemo-enzymatische Synthese hergestellt. Mit Microarray-Drucktechnologie, jeder Punkt ist nur 2 nl, im Vergleich zu 100 & mgr; l pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Drucken einer einzigen Folie mit 48 Vertiefungen und 6 Verbindungen, in 6 Wiederholungen, verbrauchen wir etwa 1152 nl. Die gleiche Beschichtungsverfahren in 96-Well-Platten führt die Beschichtung insgesamt 1.842 Vertiefungen mit 100 & mgr; l der Verbindung in der gleichen Konzentration. Daher Druck ter Verbindung im Vergleich zum Plattentest, wir eine auffällige Reduktion von 1,500x erreichen. Daher werden insgesamt Biologicals 360-fach und Glykan Verbrauch um 1.500-fache reduziert. Mit Roboter-Liquid-Handling, stellen wir uns vor, dass die meisten Schritte automatisiert werden, so dass der gesamte Test als Bildschirm mit hohem Durchsatz verwendet werden.
Obwohl Druckmicroarrays und nachfolgende Bildanalysen Sondermaschinen und Werkzeuge erfordern, sind diese Instrumente nicht selten und liegen an vielen Universitäten und Instituten. Der Druck ist direkt und erfordert keine chemischen Veränderungen. Deshalb glauben wir, dass bei dieser minimalen Menge von Verbindungen und einfache Drucktechnik, dieser Assay allgemeiner anwendbar sein könnte. Da es die Inkubation Volumen reduziert, die Kosten von Antikörpern und Edel Biologicals, wird diese Technik es für Labore mit begrenzten Ressourcen möglich machen Spezifität von IAV oder andere Glykan Bindungsproteine mit hoher Genauigkeit zu beurteilen, während niedrigere Kosten beibehaltens.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Scripps Microarray-Core Facility, und einen Vertrag von den Centers for Disease Control (JCP) unterstützt. RPdV ist ein Empfänger eines Rubicon und VENI Zuschuss von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO). Das Konsortium für Funktionelle Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) finanziert von NIGMS Zuschuss GM62116 (JCP), die mehrere Glykane in dieser Studie verwendet. Dies ist die Veröffentlichung 29113 von The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
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