Abstract
Influensa A-virus (IAV) hemagglutinins erkänner sialinsyror på cellytan som funktionella receptorer för att komma in i celler. Vilda sjöfåglar är den naturliga reservoar för IAV, men IAV kan korsa artbarriären till fjäderfä, svin, hästar och människor. Fågelvirus erkänner sialinsyra kopplad till en näst sista galaktos genom en α2-3 koppling (avian typ receptorer) De mänskliga virus erkänna företrädesvis sialinsyra med en α2-6 Lyft (human-typ receptorer). Att övervaka om fågelvirus anpassar sig till humana typ-receptorer, kan flera metoder användas. Glykan mikroarrayer med olika bibliotek av syntetiska sialosides alltmer används för att utvärdera receptorspecificitet. Emellertid är denna teknik inte använts för att mäta aviditeter. Mätning av aviditeten uppnås typiskt genom att utvärdera bindningen av serieutspädd hemagglutinin eller virus till glykaner adsorberade till konventionella polypropen 96-brunnars plattor. I denna analys, glykaner med α2-3 eller α2-6 sialinsyror är kopplade till biotin och adsorberas till streptavidin plattor, eller är kopplade till polyakrylamid (PAA) som direkt bindas till plasten. Vi har avsevärt miniatyriserade denna analys genom att direkt skriva ut PAA-kopplade sialosides och deras icke PAA bundna motsvarigheter på mikro och objektglas. Denna installation, med 48 uppsättningar på en enda bild, möjliggör samtidiga analyser av 6 glykan bindande proteiner på 8 utspädningar förhöra 6 olika glykaner, inklusive två icke-sialylerade kontroller. Detta är ekvivalent med 18x 96-brunnsplattor i den traditionella plattanalys. Den glykan array format minskar konsumtionen av föreningar och biologiska och därmed kraftigt förbättrar effektiviteten.
Introduction
Vilda sjöfåglar är den naturliga reservoar för IAV, men IAV kan korsa artbarriären till fjäderfä och däggdjur, inklusive människan. Avian IAVs erkänner α2-3 länkade sialinsyror (avian-typ receptorer), medan humana virus binder α2-6 länkade sialinsyror (human-typ receptorer). För att effektivt kunna replikera och överföra mellan människor en avian IAV behöver binda till human-typ receptorer 1.
IAVs är indelade baserat på serologi som präglar antigeniciteten av deras hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) höljesglykoproteiner. HA binder till sialinsyror, medan NA är receptorn förstörande enzym vid den andra änden av det virala livscykeln och klyver sialinsyra 2. Alla mänskliga infekterar virus, inklusive H1N1, H2N2 och H3N2, har en fåglar 3. Under de senaste två decennierna flera avian mänskliga delning har skett, med H5N1, H7N7 och H7N9 är den mest kända; however, har andra subtyper infekterade människor mer sporadiskt (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Lyckligtvis verkar det som om ingen av dessa virus har fullt ut kunnat anpassa sig till mänsklig typ α2-6 bunden sialinsyra receptorer 5-8. Anpassning av fågel- eller andra zoonotiska virus för att rymma replikering och överföring i mänskliga värdar kan ha en förödande effekt på människors hälsa. Därför tidigare kunskap om hur dessa virus utvecklas för att binda human-typ receptorer hjälper världsomfattande övervakning av nya influensavirus.
Fastställande av receptor preferens först klar användning av erytrocyter av olika arter och förblir en gynnad analys bland influensaforskare 9-12. Demonstrationen som fågelvirus erkänner α2-3 sialinsyra och mänskliga virus α2-6 kopplade sialinsyra byggde ursprungligen på en analys med hjälp av hemagglutination av erytrocyter enzymatiskt modifierade att innehålla vart och ett av linkages 13,14. Även om utläsningen är hemagglutination, en standardanalys för virologer, är de underliggande glykanstrukturer inte definierad, bara den terminala bindningen. Dessutom, den begränsade tillgången av sialyltransferaser, som används för att åter sialylate cellerna har begränsat användningen av denna analys 15-18. Därefter tillsattes andra metoder för att bestämma receptorbindande preferenser införas med användning av sialylerade glykanstrukturer kopplade till poly-akrylamid (PAA) eller poly-glutamat (PGA) strukturer i plattbaserade analyser 19,20. Flera variationer är möjliga i beläggning antingen glykaner eller virus till mikrotiterplattor, vilka vardera resulterar i en robust, pålitlig och mycket känslig ELISA-typ analys 21-23. Alternativt kan biotin-länkade glykaner ersätta PAA / PGA och kan konjugeras till streptavidinbelagda plattor 2,24. Även om vissa specifika serum kan behövas, ELISA är standard och flera glykaner kopplade till PAA lätt commercially och icke-kommersiellt tillgänglig (konsortiet för funktionella glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glykan microarray teknik har dykt upp som ett ovärderligt verktyg för att bestämma receptorspecificitet, som flera olika glykaner är fläckig, och bindning till ett brett spektrum av olika strukturer kan bedömas inom en enda analys 25-29. Bindningen av IAV till dessa strukturer ger en bättre förståelse av de glykanstrukturer som IAV känner igen preferentiellt 30-33. Glykan mikroarrayer kräver små mängder provvolym för att utföra en bindningsanalys och använder endast små mängder av glykan per plats (2 nl). Emellertid är dessa matriser som typiskt används endast för att utvärdera specificiteten av glykaner receptorer. Analys av flera virus, eller hemagglutinin proteiner, vid flera koncentrationsintervall kan vara oöverkomliga grund av antalet objektglas som krävs. Dessutom hittills ingen relativ aviditet analys har utvecklats med hjälp av glykan array tekniker.
Att kombinera provet kravet låg ges av glykan microarray teknik och känsligheten hos PAA-kopplade glykaner i ELISA-baserade analyser, försökte vi utveckla en fler väl glykan array som skulle göra det möjligt för hög genomströmning analys med liknande eller bättre upplösning jämfört till den traditionella ELISA-baserad analys. Samtidigt ville vi att minimera mängden av biologiska och reporter kemikalier konsumeras. Det slutliga resultatet är en miniatyriserad aviditet analys speciellt utvecklat för övervakning IAV specificitet och är lika tillämplig för att bedöma andra glykan bindande proteiner. Med hjälp av en glasskiva uppdelad i 48 mikrobrunnar med en teflon mask är 6 olika glykaner fläckig i 6 replikat per brunn. Microarray plattform ger samma trender i receptorbindning sett i makro ELISA-format med flera fördelar. Dessa inkluderar (I) tryckning av föreningen i 6 repliker, med hjälp av minimal prov, jämfört med beläggning av flera rader ina plattan med 100 ul per brunn; (II) flera olika föreningar analyseras samtidigt i en enda brunn, inklusive kontroller; (III) en massiv minskning av inkubation volym och; (IV) en större dynamiskt område genom att använda en fluorescerande avläsning. En enda bild kan beräknas motsvara 18x 96-brunnsplattor.
Med följande protokoll, något lab med förmåga att tillverka och analysera spotted microarrays bör kunna tillverka denna miniatyriserade ELISA-format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTERA: Alla steg utförs vid rumstemperatur om inget annat anges.
1. Array Konstruktion
- Glykan Förberedelse och Plate Setup
- Förbered ett lager av tryckbuffert. Först göra 500 ml av en 150 mM stamlösning av dibasisk natriumfosfat. Också göra 50 ml av en 150 mM stamlösning av monobasisk natriumfosfatlösning. I en kolv, med användning av en magnetisk omrörarstav och pH-meter, långsamt titrera dibasisk natriumfosfatlösning med monobasiska lösning tills ett pH av 8,5 uppnås. Lägg Tween-20 till 0,005%.
- Framställa de glycan prover. Späd PAA konjugerade glykaner, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) och 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figur 1A )) är att spädas till 100 pg / ml i utskrift buffert från step1.1.1. Monovalenta glykaner,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) och 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) till 100 pM i tryckbuffert från steg 1.1.1. Slutligen förbereda aminfunktionaliserade färgämnen, för att använda som plan markörer / landningsljus. Dye markör fläckar skrivs ut på en iM.
OBS: Atto488-NHS färgämne används i våra tryck. Men är lämplig för detta ändamål någon aminfunktionaliserat färgämne, läsas av diascanner. - Transfer 10 fil av varje glykan prov till 384-brunnars mikrotiterplattor, som används för utskrift roboten. Förvara oanvända glykaner i tryckbuffertlösning vid -20 ° C i förseglade rör. Tansfer 10 fil av färgämnet markör till tryckplåten.
- Utskrift
NOTERA: Alla steps som rör röra eller flytta bilderna måste göras med handskar.- Placera arrayer stift i skrivhuvudet enligt korrekt konfiguration av layouten. För den här layouten använder ett stift för att skriva ut alla prover och matriser. Skriv glykanema i block om sex, hoppa en funktion (en funktion definieras som en enda fläck av en viss förening), på vardera sidan, så att fläckar av samma prov inte skrivs ut exakt bredvid varandra.
OBS: Slutanvändaren måste bestämma konfigurationen. - Ta bort diabilder från påsar, öppna lådor, och ta bort eventuella dammpartiklar eller små bitar av plast som kan vara på ytan genom att blåsa ultrahög renhet Kvävgas på varje bild. Placera önskat antal bilder, belagda sidan uppåt, på arrayer scenen.
- Programmera arrayer, använda parametrarna för 27 fläckar per besök till källplattan, med användning av tre "pre-spots" på poly-L-lysin belagda objektglas, för att avlägsna överskott av vätska vid spetsen av tryckstiften
- Slå på MPU (huvudströmmen Unit) och Climate Control Unit. Open Plattsättning Analysis programvara på datorn.
- Välj layout till tryck. Välj Val → Pin verktyg som ska användas för utskrift matrisen 1 x 1 print verktyg - ett enda stift. Välj fliken Target → Verktygs Array Definition → tryckmönster och lägga planen (spot-till-plats avstånd), att antalet rader och kolumner för att rymma prover ska skrivas ut och tryckmönstret av proven (för denna matris en 8 x 8 tryckmönster används vid 340 um pitch för 7 totalt prov).
- Välj Target → Slide Layout och programmera block till block avstånd för att möjliggöra utskrift av varje kopia matris i 48 brunnar (4 x 12) diapositivmallen. Välj Källa och lägg till antalet käll pickuper (1 för varje prov vid användning av ett stift) (för detta tryck 7 käll pickups kommer att användas för att rymma 6 provbrunnar och en färgmarkör också).
OBS: Käll dialogen bör bli grön för att visa att antaletkäll besök matchar prover som ska skrivas ut i tryckmönstret. - Välj Target → adapterplatta och bildlayout och justera bildnummer (5 glider skrivs ut på en gång för detta tryck med en pre-spotting bild).
- Släpp facket genom att klicka på T1-knappen för att aktivera brickan och lägga till önskat antal bilder till facket, mycket uppmärksam på placeringen av pre-spotting slide (blå) och "riktiga" bilder.
- Placera vanligt glas på alla återstående vakuumöppningar att blockera vakuum och klicka på OK för att aktivera vakuum. Kontrollera att alla bilder hålls på plats och klicka på OK för att återgå magasinet till utgångsläget.
- Ladda tryckplåten i plåthållaren och säkerställa racket är korrekt inställd på plats. Klicka GO och låta tryckprocessen att fortsätta.
- Skriv de återstående 24 platserna i replikat av 6 fläckar per matris (4 arrayer / source besök).
- Ladda 384-brunnsplattori skrivaren och börja skriva ut. Bibehålla relativ fuktighet, vid utskrift, under tryck mellan 55 och 65%. Skrivaren stannar efter utskrift 5 diabilder.
OBS: Även microarray i denna analys är tryckt i ett visst 8 x 8 mönster, kommer olika microarray tryck robotar kräver utrustning specifik programmering för att uppnå den önskade layouten. Det är upp till användaren att bestämma den lämpligaste mönster gett sin utrustning specifikationer.
- Placera arrayer stift i skrivhuvudet enligt korrekt konfiguration av layouten. För den här layouten använder ett stift för att skriva ut alla prover och matriser. Skriv glykanema i block om sex, hoppa en funktion (en funktion definieras som en enda fläck av en viss förening), på vardera sidan, så att fläckar av samma prov inte skrivs ut exakt bredvid varandra.
- Befuktning / immobilisera
OBS: När bilderna har skrivits ut, genomgår de en tillfällig immobilisering steg, även kallad fukt. Befuktning post-print hjälper till att homogenisera provet fastsättning genom återfuktning fläckarna och säkerställa fullständig blockering.- Sätta objektglasen i en fuktkammare 100% omedelbart efter utskrift under en period av 30 min. Konstruera kammaren genom att placera mycket våta pappershanddukar platta i botten av en stor glasskål, placera objektglasenpå någon form av rack, såsom en provrörsställ, utskriftssidan uppåt, och tätning med plastfolie för att fälla i fukt.
- Antal glider med en alkohol / lösningsmedel resistent märkpenna och lagra i en uttorkning låda. Uttorka över natten.
- Numrering, blockering, och lagring
- Förbered blockerande buffert - 50 mM etanolamin i 50 mM boratbuffert. Först upplöses borsyra, i DDH 2 O, till en slutlig koncentration av 50 mM i en kolv innehållande en magnetisk omrörarstav. Rör om lösningen kraftigt på en omrörningsplatta tills allt fast material har lösts upp. Medan konstant omrörning, tillsätt lämplig mängd etanolamin från en 16,54 M stamlösning för att nå den önskade 50 mM koncentration. Lägga koncentrerad natriumhydroxid för att justera till ett slutligt pH av 9,2.
- Doppa de tryckta bilderna i den blockerande buffertlösning under en timme.
- Efter en timme, skölj glasen i DDH 2 O för att avlägsna eventuella överskott spår av blockeringsbuffert.Avyttra blockerande buffert i en lämplig avfallsbehållare.
- Överför bilderna till glasfärgningshållare och snurra torr. Torra matriser genom att placera dem i en centrifug utrustad med svängande platthållare, med en hastighet av 10 xg under 5 min.
- När bilderna är torra, kan de inkuberas omedelbart eller lagras. lagringsförhållanden är -20 ° C i en förseglad plastpåse.
2. Analysera glykan bindande proteiner
- Förbereda en befuktad kammare, i vilken de matriser som skall hybridiseras kommer att passa. En enkel kammare består av en Pyrex maträtt, lager på botten med dämpade pappershanddukar och ett rack, på vilken bilderna kommer att vila.
- Använda biotinylerade lektiner SNA (Sambuca nigra agglutinin) och ECA (Erythrina cristagalli agglutinin) vid 10 | ig / ml + 2 | ig / ml streptavidin-555 färgämne, i sondering buffert (PBS + 0,01% Tween-20). För HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 och A / KY / 07 H1N1, i detta exempel), användningen startkoncentration av 20 ug / ml pre-komplex, såsom tidigare beskrivits 34. Kortfattat, gör en HA: Mus-α-Strep: Goat-α-Mus-Alexa647 blandningen i blockeringsbuffert (PBS + 3% BSA + 0,01% Tween-20), vid en 4: 2: 1 molförhållande.
OBS: Uppsättningen sonderas med lektiner att säkerställa att glykaner är immobiliserade och detekterbara (Figur 1B). - Överföra glykan bindande protein-antikropp-mix lösning av 20 | il till en 384-brunnars platta och inkubera på is under 30 min. Seriellt utspädd lektin och HA-proverna 1: 1, i deras lämplig buffert, 8 gånger, genom att blanda 10 | il prov med 10 | il av buffert.
- Pipettera 8 | il av provet på mikro brunnens yta och inkubera i den förseglade befuktning (100% RH) kammare under 90 min.
- Tvätta bilderna en i taget genom att hålla i kanterna och doppa dem fyra gånger i en blandning av PBS och 0,05% Tween, sedan fyra gånger i PBS och slutligen fyra gånger i avjoniserat H2O Använder sig avsamma torknings protokoll som beskrivs i blockeringssteget, snurra arrayer torka i en centrifug under 5 min vid 10 x g.
3. skanning och dataanalyser
OBS: glykan mikroarrayer kan skannas med olika inställningar, beroende på microarray skannerns tillverkare. Genom att variera lasereffekten och upplösning, kan instrumentet producera en bild med så många signaler som möjligt inom sitt dynamiska område (Figur 1C).
- Använd en fluorescerande bild scanner och skanna arrayer omedelbart efter inkubation med glykan bindande proteiner. Var noga med att se till att bilden är korrekt insatt i skanningsinstrument.
- Öppen scanning programvara. Klicka på Start för att öppna programmet. Anslut till skannern: Scanner → Connect eller gröna knappen i skannernavigeringspanelens meny.
- Öppna Autoloader dörren skannern. Placera objektglasen i slitsar i autoladdare i särskild ordning. Stäng autoladdare dörr. click "läsa loader" i Verktyg navigationspanel till automatisk upptäcka diabilder i skannern.
- Ställ scan parameter: Scanner → Scan parametrar lämpliga för försöket (t.ex. 635 lasereffekt hög, förstärkning upptäckt 50%). Skanna diabilder: Scanner → Scan. Välj väg genom att skapa en mapp att spara skanna bilder och namn individuella scanningar. Gör detta innan själva skanningen. Upprepa för varje enskild bild. Klicka på OK för att starta skanningen.
- Använd skannerprogrammet för att ställa in instrumentet och skanna bilderna. Ställ skanner för att iterativt scanna vid låg lasereffekt (5 mW) med ökande förstärkningsinställningarna på 25%, 50% och 75%.
OBS: Inställningarna kan testas och optimeras, men kom ihåg att varje avsökning möjligen kan sänka fluorescens produktionen av färgämnena på grund av fotoblekning.- Öppen datainsamling och analys som Mapix programvara. Klicka på Start för att öppna programmet. Öppna skannade bilden: Arkiv → öppen imålder. Öppna GAL fil: Analysera → öppna nätet och välja lämplig GAL-filen.
- Ange block läge: Bild → block läge att flytta nätet. Använd rutnätsmarkörer för att ställa in gallret till rätt plats på bilden. Justera enskilda block som behövs för att matcha den tryckta arrayen.
- Ange fläckar läge: Bild → fläckar läge för att justera placering och storlek på enskilda platser inom blocket. När alla block och fläckar justeras och på plats, mäta signalnivåer genom Analyze → fotometriska beräkningar. Spara utdatafilen.
- När bilderna har avslutat skanningen är bilderna analyseras för bindning signaler med bildbehandlingsprogrammet installerat (Figur 1D - G). För bildanalys, ladda en GAL (Array List) fil över den skannade TIFF-bild.
OBS: GAL-filen innehåller både spot uppställning och identiteter för varje plats var. GAL-filer för matriser är speated av programvaran för skrivaren med en tabbavgränsad textfil som innehåller identiteterna av proverna och deras placering i 384 brunnar källplatta. - Använd rutnät markör / landningsljus tryckta på microarrays att korrekt placera GAL nätet. Enskilda platser kan behöva flyttas individuellt, men en väl tryckt array i allmänhet tillåta block i nätet ska placeras med lätthet. Efter gallerplacering, samla plats intensiteter av programvaran och sparas som en tabbavgränsad textfil (.txt).
- Med hjälp av kalkylprogram, öppna utdatafilen från skannern. Öppna lämplig makro filen från mapp. Klicka på Visa → Macro → RunMacro.
OBS! Förskrivet kopierar rå utdata, ta bort onödiga rader och kolumner, sortera data efter prov, beräkna den genomsnittliga medelsignal minus bakgrundsvärden och plotta de resulterande värden till en spridning ark kalkylblad innehåller diagram för varje av sex samples testas på matrisen.
- Med hjälp av kalkylprogram, öppna utdatafilen från skannern. Öppna lämplig makro filen från mapp. Klicka på Visa → Macro → RunMacro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utskrift, skanning & Data analyser
För att säkerställa korrekt utskrift, är det viktigt att ha rätt inriktning av den prickiga nätet inom teflon mask, som avgränsar varje uppsättning på bilden. Under utskrift beroende på vilken typ av teflonbeläggning, kan fläckar inte ses med blotta ögat på MPX bilderna. Uppmärksamhet ägnas sedan till utseendet på de pre-fläckarna på poly-L-lysin-belagda objektglas. Direkt efter tryckning, bör varje bild kontrolleras genom ögat med avseende på närvaron av varje spotted förening som är synlig på grund av buffertens salterna torkades i fläcken. Arrayer inspekteras för korrekt inriktning av fläckar inom Teflon gränser och rätt antal prickiga funktioner.
Diabilder skannas i en iterativ process av lägre till högre skannings kraften för att undvika fotoblekning och tillåtande jämförelse av highennes iver att sänka aviditet bindande proteiner, som har högre och lägre utgångssignaler, respektive. Efter scanning, är fluorescensintensiteten av varje plats i utgångs bilder mäts med hjälp av ett bildbehandlingsprogram. Varje matris overlayeds med ett rutnät fil som matchar antalet funktioner tryckta på arrayen ytan (figur 1D - G). Använda tryckta fluorescerande färgämnen, är gränserna för de tryckta glykaner definieras och en mask som är integrerad med identiteten av den tryckta provet lassoes varje plats. Avbildnings mask lasso kommer att spela in alla aspekter av den avbildade plats (storlek, signalintensitet, koordinater i nätet, etc.) och utgång denna information till en tabbavgränsad textfil. Använda tabell programvara (kalkylblad), proverna sorterade efter identitet och medelsignalintensitet minus bakgrunden genomsnitt över 4 av de 6 platserna för varje prov, utelämna den högsta och lägsta signal som extremvärden. En linje diagram över genomsnittlig medelvärdessignalenminus bakgrund är avsatt mot de åtta proteinkoncentrationer som appliceras på matrisen och innehåller en rad för varje prov. Slutresultatet Grafen glättas med hjälp av ett icke-linjärt regressionsberäknings (figur 1I).
Glykan bindande proteiner
PAA-Array används för att bedöma receptorbindande specificiteten av influensa A-virus hemagglutinins. Ett ytterligare särdrag av vår array, inte förekommer i den analoga plattanalys, är införandet av icke-sialylerade kontroller i samma mikro-brunn. För att bedöma att tryckta föreningar är närvarande efter tryckning, lektiner vanligt förekommande växt med känd specificitet användes. ECA binder till terminal galaktos kopplad β1-4 till N-acetyl-glukosamin (Galβ1-4GlcNAc eller LacNAc) och kommer inte att binda om terminalen galaktos utjämnade med sialinsyra. ECA upptäcker bara de icke-sialylerade glykaner på vår miniatyriserad glykan array (Figur 2A). Avsaknaden av bindning till någon av de sialylerade glykan prover är också betecknande att dessa är fullständigt kapslade med terminal sialinsyra. För α2-6 kopplad sialinsyra, var SNA användes som ett lektin kontroll (Figur 2B). Som väntat, SNA binder bara α2-6 länkade sialinsyror, men med betydande skillnader i affinitet för PAA bundna icke-PAA-länkade di-LacNAc upprepningar. Denna skillnad återspeglar känsligheten hos PAA-kopplade glykaner och tillåter diskriminering av proteiner som kan binda med låg aviditet. För α2-3 länkad sialinsyra, en H5 hemagglutinin från A / Vietnam / 1203-1204 virus som är känt för att känna igen α2-3 kopplade sialinsyra bara syror användes sex. Bindningsprofilen hos H5 HA visar faktiskt specificitet för α2-3 länkade sialinsyror, med en högre aviditet för PAA-länkade strukturer (Figur 2C). Slutligen tillsattes H1 hemagglutinin från ett humant säsongs H1N1-stammen som används till att, som väntat, endastbunden till α2-6 kopplade sialinsyra innehållande strukturer (figur 2D).
Figur 1: utskrift, skanning och bildanalyser (A) PAA-konjugerad 6SLNLN visas som en representativ glykan struktur som är tryckt på objektglas.. (B) att inkubera ett glykan bindande protein på flera brunnar glykan array visas med en 8 | j, l volym som skapar en liten droppe på matrisen ytan. (C) Efter inkubation av glykan bindningsproteiner på matrisen och scanning i ett konfokalt fluorescerande bild scanner är en representativ bild erhålls. (D) Bilden täcktes med ett rutnät och med hjälp av galler markörer för korrekt inriktning, kan de enskilda fläckar analyseras. (E) En närbild av en komplett uppsättning av 8 matriser, i vilka en glykan bindande proteinanalyserades med användning åtta 1: 1 utspädningar. (F) En enda uppsättning, i en enda brunn representeras; uppsättningen demarked av galler markörer i det övre högra hörnet (3 platser) och längst ner till vänster (2 platser), binder denna glykan bindande protein en enda förening på matrisen som en kopia av sex är väl synlig. (G) Gallret visas med lassos omger specifika enskilda platser. (H) Imaging beräknar signalvärden från bildfilen och matar ut en tabbavgränsad datafil. (I) Uppgifterna kan tabell i kalkylblad eller stastical programvara för att skapa ett representativt utgångs graf. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Produktionen av växt lektiner (ECA, SNA) och IAV hemagglutinins med olika specificiteter (H5 från A / Vietnam / 1203-1204, H1 från A / Kentucky / 07). (A) ECA binder terminala LacNAc eller Galb1-4GlcNAc specifikt och detekterar närvaron av de icke-sialylerade föreningar, användes som kontroller för IAV hemagglutinins. (B) SNA erkänner endast glykaner som bär en terminal α2-6 sialinsyra. (C) Den rekombinanta hemagglutinin av H5N1 (A / Vietnam / 1203-1204) stammen binder till α2-3 sialinsyror och ger ett fågel typ receptorbindningsprofilen. (D) Den rekombinanta hemagglutinin av en mänsklig säsongs H1N1 (A / Kentucky / 07) binder till endast mänsklig typ receptorer. Fluorescerande signalintensiteten mättes för varje plats, och menar intensitet minus betyder bakgrund beräknades med hjälp av kalkylprogram. För varje glykan, är den genomsnittliga signalintensiteten beräknas från 6 replikerar fläckar. De högsta och lägsta signalerna för de 6 replik avlägsnas och de återstående fyra repliktes används för att beräkna medelvärdet signalen, standardavvikelse (SD), och standard mätning av fel (SEM). Graferna representerar den genomsnittliga medelsignalen minus bakgrund för varje prov och felstaplar är SEM värde. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uppskatta IAV receptorspecificitet är ett viktigt steg i att analysera pandemisk potential fågelvirus. Sialinsyra erkännande av viruset är kopplat till flera biologiska egenskaper såsom bindning till och frisättning från cellen. Kunskap om vilka aminosyra mutationer är nödvändiga för fågelvirus att nå α2-6 bindande och korsar artbarriären möjliggör pandemiberedskap. Flera analyser används för att bestämma receptorspecificitet; Men alla har sina nackdelar, inklusive bara mäta affinitet och inte specificitet och vice versa.
Här beskriver vi en ny miniatyriserad verktyg baserat på allmänt använda och accepterade ELISA, som använder PAA-kopplade terminala fragment av mer komplexa glykaner. Med 4 väldefinierade lektiner, två av anläggningen och två av influensa A-virus ursprung, visar vi att vi behåller specificitet och relativ aviditet.
När vi beräkna minskningen av kemikalier och biologiCal som används av miniatyrisera ELISA på ett glykan array chip, vi når påfallande stora skillnader. Först de biologiska; Vi använder 10x mindre analysvolym och använda 6 testföreningar i 6 replikat; Detta kan beräknas till motsvarande 36x rader i 96-brunnsplattor. Resultatet är att vi använder 360X mindre biologicals. Kritiska steg inkluderar korrekt tryckning och risken för höga bakgrunder med hjälp av orenade glykan bindemedel eller dåliga påvisa antikroppar.
De föreningar som används i denna analys, även om det fortfarande finns tillgängliga, inte enkelt kan göras genom kemo-enzymatisk syntes. Med användning av mikroarray-tryckteknik, är varje plats endast 2 nl, jämfört med 100 | il per brunn av en mikrotiterplatta. Skriva en enda bild som innehåller 48 brunnar och 6 föreningar, i 6 replikat, vi konsumerar cirka 1152 nl. Samma beläggningsförfarande i 96-brunnars plattor resulterar i beläggning av ett totalt 1.842 brunnar med 100 ul av förening i samma koncentration. Därför, tryckning than förening jämfört med plattanalys, vi uppnå en slående minskning av 1,500x. Därför totalt är biologiska minskas 360-faldig och glykan konsumtion av 1500-faldigt. Med användning av robotiserade vätskelastare, föreställer vi oss att de flesta stegen skulle kunna automatiseras, vilket gör att hela analysen användas som en hög genomströmning skärm.
Även tryck microarrays och efterföljande bildanalyser kräver specialmaskiner och verktyg, dessa instrument är inte ovanliga och förekommer på många universitet och institut. Utskriften är direkt och inte kräver kemiska förändringar. Därför tror vi att, med denna minimal mängd av föreningarna och enkel trycktekniken, kunde denna analys vara mer allmänt tillämplig. Eftersom det minskar inkubationsvolym kostnaderna för antikropparna och dyrbara biologiska, kommer denna teknik gör det möjligt för labb med begränsade resurser för att bedöma specificiteten av IAV eller andra glykan bindande proteiner med high fidelity bibehållen lägre kostnads.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av den Scripps microarray Core Facility, och ett kontrakt från Centers for Disease Control (JCP). RPdV är mottagare av en Rubicon och VENI bidrag från Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (NWO). Konsortiet för Funktionella glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) finansieras av NIGMS bidrag GM62116 (JCP) gav flera glykaner som används i denna studie. Detta är publikation 29113 från The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P.
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
