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Biology

A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

Descreve-se um bioensaio baseado em células simples para a detecção, quantificação e a monitorização da actividade de membros da família de ligandos vasculares factor de crescimento endotelial. O ensaio utiliza receptores quiméricos expressos numa linha celular dependente de factores para proporcionar uma avaliação semi-quantitativa ou quantitativa de ligação ao receptor e a reticulação pelo ligando.

Abstract

A análise de tirosina-quinases de receptor e seus ligandos que interagem envolvidas na biologia vascular é muitas vezes difícil devido à expressão constitutiva de famílias dos receptores relacionados, uma ampla gama de ligantes relacionados, e a dificuldade de lidar com as culturas primárias de células endoteliais especializadas. Descrevemos aqui um bioensaio para a detecção de ligandos para o factor de crescimento endotelial vascular receptor-2 (VEGFR-2), um transdutor chave de sinais que promovem a angiogénese e linf angiogénese. Um ADNc que codifica uma fusão da região extracelular (de ligação ao ligando) do VEGFR-2 com as regiões transmembrana e citoplasmático do receptor de eritropoietina (EpoR) é expressa na linha celular dependente de factor de Ba / F3. Esta linha de células cresce na presença de interleucina-3 (IL-3) e retirada deste factor resulta na morte das células dentro de 24 horas. A expressão da fusão do receptor VEGFR-2 / EpoR fornece um mecanismo alternativo para promover a sobrevivência e potencially proliferação de células Ba / F3 estavelmente transfectadas na presença de um ligando capaz de se ligar e de reticulação a porção extracelular da proteína de fusão (ou seja, um que pode cruzar-ligação VEGFR-2 a região extracelular). O ensaio pode ser realizado de duas formas: uma abordagem semi-quantitativa, em que pequenos volumes de ligando e células permitir um resultado rápido, em 24 h, e uma abordagem quantitativa envolvendo marcadores substitutos de um número de células viáveis. O ensaio é relativamente fácil de realizar, é altamente sensível às conhecidas VEGFR-2 e ligandos podem acomodar inibidores extracelulares do VEGFR-2 de sinalização, tais como anticorpos monoclonais para o receptor ou ligandos, e armadilhas ligando solúvel.

Introduction

A família do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) de factores de crescimento de proteínas secretadas e dos seus receptores de superfície celular cognato é um grupo importante e diverso de ligandos e receptores solúveis incorporados à membrana, respectivamente, que em função de transdução de sinais através das membranas celulares. Eles funcionam principalmente em células endoteliais mas também em células de origem epitelial e as do sistema imunológico 1,2. Vias de sinalização envolvidas por receptores activados por ligandos VEGF (VEGFR) são críticos em grandes patologias, tais como a degeneração macular relacionada com a idade e cancro e terapêutica de segmentação eles estão em uso clínico frequente (por exemplo, o bevacizumab, anticorpo monoclonal que tem como alvo VEGF-A) 3,4.

Uma das complexidades da família VEGF é a diversidade de ligandos solúveis presentes na natureza (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, as proteínas VEGF codificadas pela ORF parapox vírus da família e de veneno de cobra de VEGF, além de outros inibitórioisoformas de VEGF-A) 2.

Estes ligandos interagem com os três membros da família do receptor de tirosina-quinase, nomeadamente VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Estes receptores são variavelmente expressa em diferentes tipos de células, mas são muitas vezes co-expressos na superfície das células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos e linfáticos de todos os tamanhos 5. VEGFR-2 podem ligar-se a mamíferos ligandos VEGF-A 6, VEGF-C e VEGF-7 D 8,9, bem como vírus da ORF de VEGF 10 e 11 de veneno de cobra de VEGF. VEGFR-2 desempenha um papel importante na condução da angiogénese (a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes) no desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, cancro e doenças dos olhos. Nestes contextos, os ligandos, tais como VEGF-A, -C e -D ligam-se e activam o receptor de sangue em células endoteliais vasculares 12-15. Em células endoteliais linfáticas, VEGFR-2 desempenha um papel na linf angiogénese, a formação de novos vasos linfáticos 16. VEGFR-2 também pode promover dilatação e expansão das grandes artérias e vasos linfáticos em tecidos saudáveis ​​e doenças 17. Uma compreensão completa do VEGFR-2: ligante é, por conseguinte, importante para o desenvolvimento de inibidores para utilização no tratamento de doenças dependentes de angiogénese 18. Enquanto a maioria das isoformas do VEGF-A se ligam ao VEGFR-2, a clivagem proteolítica de VEGF-C e VEGF-D é necessária para libertar um fragmento que consiste no domínio de homologia de VEGF-que exibe ligação para o VEGFR-2 de elevada afinidade 19,20.

Nós desenvolvemos um ensaio biológico para monitorar ligantes de VEGFR-2, que é projetado para contornar a necessidade de células primárias endoteliais, que são tecnicamente difíceis de passagem, caro para comprar e cultura (o que exige especializados de média) 21 e expressar múltiplos VEGFRs e associado co- receptores 22. Heterodimerização de VEGFR-2 com outros receptores VEGF ou co-receptores podem causar complexidade indesejada quando com o objetivo de parafuso prisioneiroy interacções receptor-ligando binários, avaliando a actividade atribuível a um receptor específico, ou avaliar o efeito dos reagentes de inibidores. 23. O bioensaio mantém a mobilidade do receptor relevante na membrana da célula e permite a avaliação da capacidade de um ligando para se ligar e reticular o VEGFR-2 região extracelular.

O bioensaio baseia-se na criação de um receptor quimérico em que a região extracelular de um receptor de VEGF (neste caso, o VEGFR-2) é fundida com as regiões transmembrana e intracelular do receptor de eritropoietina (EpoR), um membro da família do receptor de citocina 8,24. Esta proteína de fusão é então expressa na linha de células pró-B dependentes de factor de Ba / F3, em que a estimulação com um ligando capaz de se ligar e de ligação cruzada do domínio extracelular do receptor provoca a activação da região efectora citoplasmático, que é capaz de transduzir um sinal de sobrevivência através de Janus quinases (JAK) para promover a célulaa sobrevivência e / ou proliferação. Em contraste, a expressão de comprimento completo de VEGFR-2 no mesmo tipo de célula, e a estimulação com o ligando, não promover a sobrevivência e proliferação das células, indicando que os efectores de sinalização proximal da via o VEGFR-2 não estão disponíveis para este tipo de células.

Temos usado o ensaio em uma variedade de contextos para explorar ligação de novos VEGFR-2 ligantes 10,19,20,24-29. Em combinação com um ensaio / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, que compararam as actividades relativas de VEGF-C e os factores de crescimento VEGF-D para a ligação e ligação cruzada do VEGFR-2 e VEGFR-3 30. O ensaio tem sido utilizado para caracterizar a actividade inibidora dos anticorpos monoclonais neutralizantes para o VEGFR-2 ou VEGF-D, VEGFR-2 solúvel armadilha e peptidomiméticos de segmentação da família VEGF 31. O ensaio também foi utilizado para mostrar a capacidade de VEGF a partir de diferentes estirpes de vírus ORF para ligar e reticular o VEGFR-2, antes do teste em células endoteliais primárias 25 ou no momento da avaliação para os protocolos de purificação de crescimento Factores de 27.

O ensaio descrevemos é fácil de realizar, e na versão semi-quantitativa permite determinações rápidas que são por vezes necessários ao monitorar a produção ou purificação de factores de crescimento, anticorpos ou domínios de receptores solúveis para outras experiências. A facilidade de utilização do ensaio torna um complemento ideal para estudos mais e mais completas realizados com células endoteliais primárias derivadas do sangue ou vasos linfáticos a partir de tecidos específicos ou de sistemas de órgãos.

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Protocol

Meio Fonte de IL-3 e Preparação de WEHI-3D ​​condicionado

Nota: A linha celular de leucemia granulocítica ratinho WEHI-3D ​​é cultivado para gerar um meio condicionado contendo IL-3.

  1. Cultura WEHI-3D ​​em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal de bovino 10% (FBS), 1% de suplemento de glutamina-vida longa, 50 ug / ml de gentamicina. Inocular 5 x 10 6 células em fase logarítmica de crescimento em 50 ml de meio de cultura fresco num T175 cm balão de cultura de 3 tecidos e crescer durante cerca de 7 dias ou até as células passaram a sua fase logarítmica de crescimento por cerca de 24 - 48 h (evitar a morte celular excessiva na cultura). O meio condicionado é capaz de ser armazenada durante vários anos a -20 ° C, de modo que lotes de 200 - 500 ml podem ser produzidas de uma só vez.
  2. Decantar o fluido e as células dos frascos e centrifugação a 1000 x g durante 15 min para remover as células e os restos celulares. Remover a parte superior de 90% dos supernatant. Filtrar através de uma unidade de filtro de 0,22 um.
  3. aliquota meio condicionado WEHI-3D ​​(CM) em 1 ml, 50 ml e 200 ml de volume, para armazenamento a -20 ° C ou -70 ° C. alíquotas mais pequenas são úteis para a preparação do ensaio, os volumes intermédios para fazer o meio de cultura para a passagem de linhas celulares dependentes de factores, e volumes maiores para armazenamento a longo prazo. IL-3 é relativamente estável a 4 ° C de modo descongelado forma podem ser armazenadas durante algumas semanas, se utilizado em condições estéreis.
  4. Em alternativa, usar ratinho recombinante de IL-3 em níveis de 50 ng / ml diluído em meio de cultura, depois de ter sido filtrada através de uma unidade de filtro de 0,22 um.

2. Cultura e Avaliação de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 e / F3 Linhas de Células de Controle Ba

  1. Culturas de controlo de células Ba / F3 em DMEM, FBS a 10%, 50 ug / ml de gentamicina ou penicilina / estreptomicina suplemento, 1% estabilizado L-glutamina e 10% de WEHI-CM-3D. células de passagem em 1:15 diluições a cada três dias a partir de célulascrescendo em fase logarítmica.
  2. Culturas de células de VEGFR2-EpoR-Ba / F3 em DMEM, FBS a 10%, 50 ug / ml de gentamicina, 1% de L-glutamina estabilizado e 10% de WEHI-CM-3D e 1 mg / ml de G418. células de passagem em 1:15 diluições de células que crescem em fase log. Veja 24 para mais detalhes sobre a construção e expressão do receptor quimérico.
  3. controlo da exploração Ba / F3 ou células / F3 VEGFR2-EpoR-BA a partir de culturas meados de fase log. Pipeta suavemente para remover as células não aderentes a partir do fundo do balão. Lavar três vezes no rato tonicidade solução salina tamponada com fosfato, pH 7,3 (PBS), (10 mL, centrifugar a 750 x g durante 5 min para recuperar sedimento celular) para remover o meio contendo IL-3.
  4. Lavar as células uma vez com DMEM e aditivos, sem a WEHI-3D-CM ou IL-3 recombinante e, em seguida ressuspender neste meio a uma concentração de 7,4 x 10 4 culas / ml (ou seja, 1.000 células por 13,5 ul; 10000 células por 135 ul, tal como determinado por contagem utilizando um hemocitómetro) parausar nas versões semi-quantitativos ou quantitativos do ensaio, respectivamente.
  5. Avaliar células de viabilidade por exclusão Trypan Blue (CUIDADO). Misturar com azul de tripano em PBS (0,4%) 1: 1, com a população de células e contagem de um mínimo de 100 células em um hemocitómetro. As células que ocupam o corante são considerados mortos ou moribundos. Viabilidade maior do que 98% é necessário para efectuar o ensaio.

3. Ensaio semi-quantitativa

  1. Adicionar células lavadas (1.000 células) contidos em 13,5 mL de meio de IL-3 deficiente para os poços de uma placa de 72 poços de micropoços à temperatura ambiente. Tome cuidado para misturar a suspensão de células durante aliquotting para garantir assentamento celular por gravidade não concentração de células viés. Use um P20 automatizado pipeta bem calibrado e dicas autoclavados.
  2. Adicionar amostras de teste e controlos aos poços num volume de 10% (1,5 mL, perfazendo um volume final de 15 ul contendo 1.000 células por cavidade) utilizando uma pipeta calibrada P20 ou, de preferência, P2 pipeta. tome caRE para assegurar que as amostras são compatíveis com as condições de cultura para as células de Ba / F3 que em termos de pH, sal e outras substâncias potencialmente citotóxicos / citostáticos. Sempre que possível, use um meio compatível ou tampão (por exemplo, DMEM ou PBS, respectivamente) ou diluir em tal meio ou tampão. A trituração com a mesma ponta vai assegurar a mistura.
  3. Para as amostras de controlo, incluem (i) só com meio contendo sem IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM adicionado ao meio sozinho ao volume final de 10%; e / ou (iii) VEGF-A diluída a 100 ng / ml em meio sozinho, não contendo a IL-3.
  4. Preencha quaisquer poços não utilizadas da microplaca com água estéril, PBS ou meio e coloque a placa dentro de um recipiente humidificado (com água embebido papel tissue) a troca gasosa permitindo. Incubar as células no interior dos recipientes, numa atmosfera humidificada de 10% de CO 2. Este ensaio pode ser confortavelmente configurado em 3 horas por uma pessoa, se as amostras de ensaio e componentes de meios disponíveis.
  5. Avaliar placas geralmente após 16 horas dede incubação na qual a discriminação de tempo entre amostras positivas e negativas, é evidente. Veja a Figura 3 para os exemplos de como as células aparecem na cultura. Analisar placas utilizando um microscópio invertido de contraste de fase padrão a 40-100 × ampliação.
    Nota: Os poços contendo factores de crescimento de suporte, tais como IL-3 ou VEGF-A conterá células que parecem redondos e translúcidos. Os poços sem factores de crescimento ou de suporte com meio sozinho terão reduzido número de células redondas, bem como células mortas ou a morrer e dos detritos celulares (por exemplo, Figura 3C). Avaliando a ensaio em 24-48 horas após a incubação, é a óptima para a sensibilidade.

4. Quantitative Bioensaio

  1. Adicionar células lavadas (10.000 células em 135 uL) em IL-3 deficiente em meio aos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços padrão à TA. Tome cuidado para misturar a suspensão de células durante aliquotting para garantir a sedimentação de células por gravidade não afeta ceconcentração ll.
  2. Adicionar amostras de teste e controlos aos poços num volume de 10% (15 mL) utilizando uma pipeta calibrada (P20). Ter o cuidado de assegurar que as amostras são compatíveis com as condições de cultura para as células de Ba / F3 que em termos de pH, sal ou outras substâncias potencialmente citotóxicos / citostáticos. Sempre que possível, use um meio compatível ou tampão (por exemplo., DMEM ou PBS) ou diluir em tal meio ou tampão. Filtrar esterilizar pequenos volumes usando uma unidade de filtro de centrífuga de tubo de acetato de celulose de 0,22 um de poro.
  3. Incubar a mistura de células, factores de crescimento e / ou agentes de inibidor em uma atmosfera humidificada de 10% de CO 2 durante 48 horas. Realizar o ensaio dentro de um recipiente umidificado que tem o papel de tecido embebido em água e permite que o gás de troca. Na conclusão do período de incubação, avalia o ensaio utilizando um dos métodos alternativos listados abaixo, que são marcadores substitutos do número de células viáveis ​​no poço.
  4. Alternativa 1: 3 H-thymidine Incorporação
    Nota: Esta quantificação é concebido para o formato de placa de 96 poços.
    1. Após incubação das placas de ensaio durante 48 horas a 37 ° C (volume de 150 ul por poço), adicionar 3 H-timidina num volume de 50 ul de meio de ensaio (Ba / meio de cultura F3 sem IL-3 / WEHI-3D ​​CM) por poço numa concentração de 20 uCi / ml, dando uma dose final de 1 uCi por cavidade.
    2. Incubar as placas durante mais 4 h a 37 ° C antes de colher as células, utilizando um colector de células. Extrair amostras individuais, colocando os filtros em cintilante e quantificar com um Contador de Cintilações Líquidas.
  5. # Alternativa 2: Detecção de bioluminescência de ATP celular
    Nota: Esta abordagem utiliza um reagente de monitorização de ATP que quando combinado com lisado celular pode gerar um sinal que reflecte a bioluminescência as células viáveis ​​da população.
    1. Lisar as células para extrair o ATP e utilizam um reagente de Monitorização de ATP para gerar umsinal luminescente de acordo com as instruções do fabricante. Leia luminescência usando um luminómetro compatível com um formato de placa de 96 poços.
  6. # Alternativa 3: redução enzimática de um corante indicador por células viáveis
    Nota: ensaios baseados resazurina mostram boa correlação com a viabilidade celular.
    1. Combinar as células cultivadas com o corante baseado resazurina e quantificar os ensaios utilizando um leitor de placas de fluorescência de acordo com as instruções do fabricante.

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Representative Results

Nesta secção, que mostram os resultados de uma experiência que demonstra as características essenciais de um bioensaio de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (ver Figura 1 para os princípios do ensaio). Outros estudos publicados demonstram aplicações mais amplas do ensaio para VEGFR-2 ligantes alternativos, moléculas VEGF mutantes e anticorpos monoclonais inibidores 8,10,19,24-30.

Os dados aqui apresentados representam um ensaio em que o / F3 bioensaio VEGFR-2-EpoR-Ba é utilizado para quantificar a actividade dos três ligandos humana recombinante (VEGF-A 165, VEGF-C e VEGF-D) com especificidade para o VEGFR -2 na presença de um anticorpo monoclonal inibidora (bevacizumab) para VEGF-a 165. os dados foram normalizados versus a resposta a VEGF-a 165 sozinho (Figura 2). Como esperado, o bevacizumab bloqueou o efeito do VEGF-A 165 no ensaio, masnão teve efeito sobre a actividade do VEGF-C e VEGF-D.

Na versão semi-quantitativa do ensaio ou quando se observa o ensaio durante o seu desenvolvimento, a visualização do ensaio utilizando um microscópio de fase invertido padrão pode fornecer informação valiosa sobre o andamento do ensaio. Uma análise de um ensaio (Figura 3) mostra a boa viabilidade de VEGFR-2-BA-EpoR / células bioensaio F3 quando incubadas com meio contendo IL-3, ou o ligando para o VEGFR-2, por exemplo, o VEGF-A. Estas células são grandes e translúcida, e não há evidências mínimas ou de granularidade no citoplasma celular ou fragmentos de células na cultura. No poço sem factores de crescimento adicionais já há evidência de os números de células reduzidos, bem como algumas células saudáveis. As células presentes têm granularidade significativa no seu citoplasma e detritos celulares é uma característica consistente da cultura. Após 48 horas não há nenhum sinal de células viáveis.


Figura 1. Diagrama esquemático que descreva os princípios da VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioensaio. (A) As células Ba / F3 são dependente de factores e requerem um factor de crescimento exógenos, tais como IL-3 para estimular o crescimento de células / viabilidade através endógenos IL-3 receptores e a via de sinalização JAK. Se EpoR é expresso nestas células salvamento também pode ocorrer através da via de JAK. A expressão de um de comprimento completo do receptor tirosina cinase, tais como VEGFR-2 resulta em sinalização mínima como alvos a jusante da activação de VEGFR-2 não se envolva a via JAK. Um receptor quimérico com a região extracelular do VEGFR-2 fundido com as regiões transmembranares e citoplasmáticos da EpoR, quando transfectado em células Ba / F3 e estimuladas com específicos de VEGFR-2 ligandos, é capaz de activar a via de JAK e de células de conduçãoa sobrevivência e proliferação. (B) células / F3 VEGFR-2-EpoR-Ba expressaram níveis significativos do receptor VEGFR-2-EpoR quimérico que pode ser quantificada por citometria de fluxo. Uma vez lavado para fora da IL-3 contendo o meio, as células são colocadas numa variedade de condições de cultura que conduzem quer a sobrevivência / proliferação de células. As células Ba / F3 transfectadas ou VEGFR-2 EpoR-BA-/ F3 sem fatores de crescimento específicos não conseguem crescer / sobreviver. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2

Figura 2. Avaliação da VEGFR-2 ligandos na / F3 bioensaio. / F3 VEGFR-2-EpoR-BA de IL-3 Ba-dependentes que expressam um VEGFR-2 de rato-EpoR quimera foram semeadas em meio sem IL-3 (excepto parao subconjunto + IL-3, tal como indicado) mais VEGF-A humano 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (esta é uma forma de VEGF-C que consiste na região central e exclui os pró-péptidos N e C-terminais), ou VEGF-DANAC (esta é uma forma de VEGF-D, que inclui a região central e exclui os N e C-terminais pr�p�tidos (VD)) a 100 ml e humanizado bevacizumab anticorpo ng / monoclonal neutralizante (que se liga e inibe o VEGF-a, mas não de VEGF-C ou VEGF-D), ou o controlo não-neutralizantes anticorpo trastuzumab, como indicado a 0,75 uM. NF = medium não contendo fatores de crescimento adicionais. Quarenta e oito horas mais tarde, o número de células vivas foi quantificada usando relativa detecção bioluminescência de ATP celular. As barras verticais representam meios (normalizados versus a resposta a VEGF-A 165 sozinho, primeira barra) e erro padrão da média de três experiências independentes. Por favor clique aqui para vIEW uma versão maior desta figura.

Figura 3

Figura 3. Células de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 são dependentes de factores de crescimento externo para a sobrevivência. Exemplos de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioensaio em que as células de Ba / F3 de IL-3-dependentes expressando um rato VEGFR- quimera 2-EpoR foram semeadas em meio de (a) contendo o meio que fornece a IL-3, (B) 100 ng / Um VEGF-(sem IL-3), ou (C) forma humana ml 165 com 10% de WEHI-3D ​​condicionado sem factores de crescimento adicionais de IL-3 ou. A cultura é representado 24 h para o ensaio mostrando células altamente viáveis ​​na presença de IL-3 (A) ou VEGF-A 165 (B), ao passo que na cultura sem (C) morte celular factores de crescimento adicionais de IL-3 ou e vermelhouced viabilidade são claramente evidentes. Escalas bares são 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O ensaio aqui descrito baseia-se na utilização de células de alta viabilidade, que são dependentes de factores de crescimento. portanto, as células devem ser cuidadosamente cultivadas para garantir que eles são dependentes do fator, e manter a expressão do receptor quimérico. Garantir que o meio é frescos e não armazenados por um período excessivamente longo e que WEHI-3D ​​CM é altamente ativo é importante. As células têm de ser cuidadosamente lavadas de IL-3 contendo o meio para o meio de ensaio para garantir que não residual IL-3 contamina o ensaio quando a exposição das células aos ligandos resgate. Como ligantes pode vir em um número de diferentes formas, o cuidado deve ser tomado ao preparar o seu ensaio. Conservantes, agentes anti-bacterianos, sal ou tampões de pH diferente pode afetar o ensaio, e é por isso que o teste paralelo de células Ba / F3 untransfected poder informar sobre as questões relacionadas com o tampão.

Nós usamos tanto os protocolos semi-quantitativos e quantitativos. A semi-quantitative ensaio permite a avaliação rápida da actividade de amostras antes de se comprometer com um ensaio quantitativo totalmente o que exige mais tempo e amostra. O método quantitativo é usado exclusivamente ao gerar dados para publicação. Os métodos alternativos de detecção da viabilidade da cultura são relativamente simples. O ensaio quantitativo foi adaptado a um número de diferentes formatos para a quantificação da proliferação, e temos usado (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) MTT 30, a detecção de bioluminescência, corante celular de ATP (não publicado) à base de resazurina (Figura 2) e 3 H-timidina 31 com sucesso. Nos últimos anos, temos evoluído longe do uso da radiação para se adaptar abordagens bioluminescência e ter usado o corante à base de resazurina, devido à sua relação custo-eficácia. Todas as abordagens dar resultados apropriados e a escolha pode depender da disponibilidade de reagentes e a umssociated leitores de placas especializadas em um laboratório dada / instituto ou familiaridade com abordagens específicas.

Solução de problemas gira em torno da actividade de três componentes principais do ensaio, i) de IL-3 cm, ii) as células VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 e iii) ligandos estimulantes. baixos níveis de IL-3 em CM devido a células inadequadas WEHI 3D na cultura inicial, más condições de armazenamento, ciclos de congelamento e descongelamento excessivas ou usando a um muito alto diluição pode criar culturas mal crescente que dificultam o ensaio. Isso geralmente é detectado em poços de controlo de populações de células crescendo lentamente, perdendo sua aparência brilhante e redonda normal. O VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 células de ensaio pode perder expressão na superfície celular da construção quimérica ao longo do tempo se forem mantidos em cultura durante longos períodos. Manter bons números dos estoques de nitrogênio líquido permite que as culturas frescas de células altamente expressam o receptor quimérico para estar disponível em todos os momentos. Se for necessário um elevado população que expressa pode serconseguida por células crescendo em VEGFR-2 e selecção de ligandos da população que expressa níveis elevados do receptor quimérico por triagem de citometria de fluxo. Estas células são então ainda expandidas em cultura para congelação.

Embora a técnica é uma alternativa conveniente e simplificado para a análise de interacções com o domínio extracelular de VEGFR-2 que não pode ser visto para substituir experiências mais sofisticados em que o receptor nativo em células endoteliais primárias é sondado na presença de outros VEGFRs, co-receptores, tais como Neuropilinas. As células em que o presente ensaio baseia-se (células B) são distintas das células endoteliais e, portanto, não deve ser usado para estudar as vias de sinalização citoplasmáticos e factores de transcrição que respondem a activação de VEGFR-2 em células endoteliais. No entanto, o método fornece uma abordagem útil para analisar a interacção receptor-ligando que se situa entre um ensaio de ligação simples que examina a interacção de um ligando com uma Recep imobilizadaTor construção (tal como um receptor solúvel região extracelular ou uma região extracelular do receptor fundido com imunoglobulina), e a análise de ligação ao receptor e os efeitos a jusante visto em ensaios para células endoteliais primárias de ligação. Ele fornece um sistema para permitir a ligação e ligação cruzada de receptores, as duas primeiras etapas, através da qual muitas tirosina-quinases do tipo receptor comumente iniciar a sua cascata de transdução de sinal. A sua aplicação num certo número de configurações académicas e comerciais tem mostrado que é aceite como um ensaio útil para examinar características de ligação, especialmente quando se avalia ligandos variantes ou inibidores da interacção receptor-ligando.

O ensaio é também útil para análise de novos inibidores do domínio extracelular do receptor ou dos seus ligandos. O ensaio pode ser ainda utilizada para pesquisar rapidamente variantes de ligandos extracelulares dos receptores ou regiões visto no contexto de mutações genómicas (herdadas e somática) encontrados em humanos GEnes em doenças como o câncer 32,33 para determinar a sua conseqüência funcional. Por conseguinte, as aplicações deste ensaio VEGFR-2 são susceptíveis de se expandir no futuro. Além disso, a abordagem geral subjacente a este ensaio pode ser utilizado de forma mais ampla para as tirosina-cinases de receptor de superfície celular, que constituem uma família grande e importante de moléculas de sinalização na saúde e na doença.

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Disclosures

Steven A. Stacker e Marc M. Achen são acionistas Circadian Technologies Ltd., uma empresa de desenvolvimento de terapêuticas, visando a família VEGF de fatores de crescimento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
  2. Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
  3. Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
  4. Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
  5. Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
  6. Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  7. Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
  8. Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
  9. Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
  10. Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
  11. Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
  12. Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
  13. Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
  14. Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
  15. Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
  16. Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
  17. Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
  18. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
  19. Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
  20. McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
  21. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
  22. Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
  23. Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
  24. Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
  25. Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
  26. Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
  27. Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
  28. Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
  29. Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
  30. Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
  31. Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
  32. Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
  33. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).

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Cellular Biology 109 Edição Receptor de VEGF um ligando inibidor sinalização receptores solúveis o factor de crescimento de proteínas bioensaio o anticorpo monoclonal
A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular
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Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

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