Summary
Descriviamo un semplice test su cellule-base per la rilevazione, la quantificazione e il monitoraggio dell'attività dei membri della famiglia endoteliale vascolare del fattore di crescita dei leganti. Il saggio utilizza recettori chimerici espressi in una linea cellulare fattore dipendente per fornire una valutazione semiquantitativa o quantitativa di legame recettoriale e reticolazione del legante.
Abstract
L'analisi del recettore tirosina chinasi e loro ligandi interagiscono coinvolti nella biologia vascolare è spesso difficile a causa l'espressione costitutiva di famiglie di recettori correlati, una vasta gamma di ligandi correlate e la difficoltà di trattare con colture primarie di cellule endoteliali specializzate. Qui si descrive un saggio biologico per la rivelazione di ligandi per il fattore di crescita vascolare endoteliale receptor-2 (VEGFR-2), un trasduttore chiave di segnali che promuovono l'angiogenesi e lymphangiogenesis. Un cDNA codificante una fusione della regione extracellulare (ligando vincolante) di VEGFR-2 con l'transmembrana e citoplasmatici regioni del recettore dell'eritropoietina (EpoR) è espressa nella linea cellulare fattore dipendente Ba / F3. Questa linea cellulare cresce in presenza di interleuchina-3 (IL-3) e il ritiro di questo fattore risultati nella morte delle cellule entro 24 ore. L'espressione della / EpoR di fusione del recettore VEGFR-2 fornisce un meccanismo alternativo per promuovere la sopravvivenza e potentially proliferazione delle cellule Ba / F3 trasfettate stabilmente in presenza di un legante capace di legare e reticolazione della porzione extracellulare della proteina di fusione (ad esempio, uno che può attraversare-link regione extracellulare VEGFR-2). L'analisi può essere eseguita in due modi: un approccio semi-quantitativo, in cui piccoli volumi di ligando e cellule permettono un rapido risultato in 24 ore, e un approccio quantitativo coinvolge indicatori surrogati di un numero di cellule vitali. Il saggio è relativamente facile da eseguire, è altamente sensibile alle note VEGFR-2 leganti e può ospitare inibitori extracellulari di VEGFR-2 segnalazione come gli anticorpi monoclonali per il recettore o leganti e trappole ligando solubile.
Introduction
Il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) famiglia di fattori di crescita proteina secreta e le loro cognate recettori della superficie cellulare è un gruppo importante e diversificata di ligandi solubili e recettori di membrana-embedded, rispettivamente, tale funzione in trasduzione dei segnali attraverso le membrane cellulari. Essi funzionano principalmente nelle cellule endoteliali, ma anche in cellule di origine epiteliale e quelli del 1,2 sistema immunitario. Vie di segnalazione impegnati dai recettori ligando-attivato VEGF (VEGFRs) sono fondamentali in importanti patologie, come la degenerazione maculare senile e il cancro, e terapeutica loro rivolte sono in uso clinico frequente (per esempio, il bevacizumab anticorpo monoclonale che ha come bersaglio il VEGF-A) 3,4.
Una delle complessità della famiglia VEGF è la diversità di ligandi solubili presenti in natura (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, proteine VEGF codificate dal ORF famiglia di virus parapox e veleno di serpente VEGF, più altri inibitorioisoforme di VEGF-A) 2.
Questi ligandi interagiscono con tre membri della famiglia dei recettori tirosin-chinasi, cioè VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Questi recettori sono variabilmente espressi su differenti tipi cellulari, ma sono spesso co-espressi sulla superficie delle cellule endoteliali che rivestono sanguigni e linfatici navi di tutte le dimensioni 5. VEGFR-2 può legare l'mammiferi ligandi VEGF-A 6, VEGF-C 7 e VEGF-D 8,9, così come virus orf VEGF 10 e veleno di serpente VEGF 11. VEGFR-2 svolge un ruolo importante nel guidare l'angiogenesi (la crescita di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti) nello sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, il cancro e le malattie degli occhi. In questi contesti, leganti quali VEGF-A, -C e -D legano e attivano il recettore sulla sangue vascolare cellule endoteliali 12-15. Sulle cellule endoteliali linfatiche, VEGFR-2 svolge un ruolo nella linfangiogenesi, la formazione di nuovi vasi linfatici 16. VEGFR-2 può anche promuovere la dilatazione e l'espansione delle grandi arterie e vasi linfatici nei tessuti sani e malattie 17. Una comprensione completa di VEGFR-2: interazioni ligando è quindi importante per lo sviluppo di inibitori per l'uso nel trattamento di malattie angiogenesi-dipendenti 18. Mentre la maggior parte isoforme di VEGF-A si legano a VEGFR-2, taglio proteolitico di VEGF-C e VEGF-D è necessario per rilasciare un frammento consistente del dominio VEGF-omologia che presenta alta affinità di legame al VEGFR-2 19,20.
Abbiamo sviluppato un saggio biologico per monitorare ligandi di VEGFR-2 che è stato progettato per aggirare la necessità di cellule primarie endoteliali, che sono tecnicamente difficili da passare, costoso per l'acquisto e la cultura (che richiede media specializzati) 21 e di esprimere molteplici VEGFRs e co-associato recettori 22. Eterodimerizzazione di VEGFR-2 con altri recettori del VEGF o co-recettori può causare complessità indesiderate quando si punta a pernointerazioni y binari recettore-ligando, valutando l'attività attribuibili a uno specifico recettore, o valutare l'effetto dei reagenti inibitori. 23. Il saggio biologico mantiene la mobilità del recettore rilevante nella membrana cellulare e permette la valutazione della capacità di un ligando di legare e cross-link regione extracellulare VEGFR-2.
Il saggio biologico si basa sulla creazione di un recettore chimerico in cui la regione extracellulare di un recettore VEGF (in questo caso VEGFR-2) è fuso al transmembrana e regioni intracellulari del recettore dell'eritropoietina (EpoR), un membro della famiglia dei recettori delle citochine 8,24. Questa proteina di fusione viene poi espressa nella linea cellulare pro-B fattore dipendente Ba / F3, su cui stimolazione con un ligando capace di legare e reticolare il dominio extracellulare del recettore provoca l'attivazione della regione effettore citoplasmatica, capace di trasduzione un segnale di sopravvivenza via Janus chinasi (JAK) per la promozione delle cellulesopravvivenza e / o proliferazione. In contrasto, l'espressione di full-length VEGFR-2 nello stesso tipo cellulare, e stimolazione con ligando, non promuovono la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, indicando che gli effettori segnalazione prossimali del pathway VEGFR-2 non sono disponibili in questo tipo cellulare.
Abbiamo usato il test in una varietà di contesti di esplorare vincolante di nuove VEGFR-2 ligandi 10,19,20,24-29. In combinazione con un saggio / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, abbiamo confrontato le relative attività di VEGF-C e fattori di crescita VEGF-D per legare e reticolazione VEGFR-2 e VEGFR-3 30. Il test è stato utilizzato per caratterizzare l'attività inibitoria di anticorpi neutralizzanti monoclonali di VEGFR-2 o VEGF-D, solubili VEGFR-2 trappola e peptidomimetici rivolte alla famiglia del VEGF 31. Il dosaggio è stato utilizzato anche per mostrare la capacità di VEGF da diversi ceppi di virus orf di legare e cross-link VEGFR-2 prima della prova in cellule endoteliali primarie
Il test che descriviamo è facile da eseguire, e la versione semi-quantitativa permette determinazioni veloci che a volte sono necessari quando il monitoraggio della produzione o purificazione di fattori di crescita, anticorpi o domini recettore solubile per altri esperimenti. La facilità d'uso del test lo rende un complemento ideale per studi ulteriori e più complete eseguite con le cellule endoteliali primarie derivate da sangue o vasi linfatici da specifici tessuti o organi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Media Fonte di IL-3 e preparazione di WEHI-3D-condizionata
Nota: La linea cellulare di leucemia granulocitica topo WEHI-3D è coltura per generare un mezzo condizionato contenente IL-3.
- Culture WEHI-3D in Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% supplemento glutamina lunga durata, 50 ug / ml di gentamicina. Inoculare 5 × 10 6 celle in fase di log di una crescita in 50 ml di terreno di coltura fresco in un T175 cm pallone di coltura 3 tessuti e crescere per circa 7 giorni o fino a quando le cellule hanno passato la loro fase di log di una crescita di circa il 24 - 48 ore (evitare un'eccessiva morte cellulare nella cultura). mezzi condizionati è in grado di essere conservati per diversi anni a -20 ° C, in modo da lotti di 200 - 500 ml possono essere prodotti in una sola volta.
- Decantare il fluido e le cellule dai fiaschi e far girare a 1000 x g per 15 minuti per rimuovere le cellule e detriti cellulari. Rimuovere la parte superiore del 90% di supernatant. Filtrare attraverso una unità di 0,22 micron filtro.
- Aliquota WEHI-3D terreno condizionato (CM) in 1 ml, 50 ml e 200 ml di volume per la conservazione a -20 ° C o -70 ° C. aliquote più piccole sono utili per la preparazione del test, i volumi intermedi per la preparazione di terreni di coltura per il passaggio di linee cellulari fattore-dipendente, e grandi volumi per la conservazione a lungo termine. IL-3 è relativamente stabile a 4 ° C di media in modo scongelato può essere conservato per un paio di settimane se usato in condizioni sterili.
- In alternativa, utilizzare il mouse ricombinante IL-3 a livelli di 50 ng / ml diluito in terreno di coltura, dopo essere stata filtrata attraverso un'unità filtro 0,22 micron.
2. Cultura e valutazione di VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 e Controllo Ba / F3 linee cellulari
- controllo Cultura cellule Ba / F3 in DMEM, 10% FBS, 50 mg / ml gentamicina o la penicillina / integratori streptomicina, 1% stabilizzato L-glutammina e il 10% WEHI-3D-CM. cellule Passage alle 1:15 diluizioni circa ogni tre giorni a partire da cellulein crescita in fase di log.
- Culture cellule VEGFR2-EpoR-Ba / F3 in DMEM, 10% FBS, 50 ug / ml di gentamicina, 1% stabilizzata L-glutammina e 10% WEHI-3D-CM e 1 mg / ml G418. cellule Passage alle 1:15 diluizioni di cellule in crescita in fase di log. Vedere 24 per maggiori dettagli circa la costruzione e l'espressione del recettore chimerico.
- Controllo Harvest Ba / F3 o cellule / F3 VEGFR2-EpoR-Ba da culture metà log-fase. Delicatamente pipetta per rimuovere le cellule non aderenti dal fondo del pallone. Lavare tre volte in topo tonicità tampone fosfato salino, pH 7,3 (PBS), (10 ml, centrifugare a 750 g per 5 minuti per recuperare pellet cellulare) per rimuovere terreno contenente IL-3.
- Lavare le cellule una volta con DMEM e additivi, senza la WEHI-3D-CM o ricombinante IL-3, quindi risospendere in questo mezzo ad una concentrazione di 7,4 × 10 4 cellule / ml (cioè 1.000 cellule per 13,5 ml; 10.000 cellule per 135 microlitri come determinato contando utilizzando un emocitometro) perutilizzare nelle versioni semiquantitative o quantitative rispettivamente del saggio.
- Valutare cellule per la vitalità di Trypan Blue esclusione (ATTENZIONE). Mescolare Trypan blu in PBS (0,4%) 1: 1 con la popolazione cellulare e contare almeno 100 cellule su un emocitometro. Le cellule che occupano il colorante sono considerati morti o moribondi. È necessario vitalità delle superiore al 98% per eseguire il test.
3. Assay semi-quantitativa
- Aggiungere cellule lavate (1.000 celle) contenute in 13,5 ml di medio IL-3-carente ai pozzetti di una micropiastra 72-bene a temperatura ambiente. Fare attenzione a miscelare la sospensione cellulare durante aliquotting per garantire sedimentazione delle cellule per gravità non lo fa concentrazione cellulare bias. Utilizzare un P20 automatizzato pipetta ben calibrato, e suggerimenti in autoclave.
- Aggiungere campioni e controlli ai pozzetti a 10 volumi% (1,5 ml, per un volume finale di 15 ml contenenti 1.000 cellule per pozzetto) usando una pipetta P20 calibrato, preferibilmente, P2 pipetta. prendere care per garantire che i campioni siano compatibili con le condizioni di coltura per le cellule Ba / F3 in termini di pH, sale e altre sostanze potenzialmente citotossici / citostatici. Dove possibile, utilizzare un supporto compatibile o tampone (per esempio, DMEM o PBS, rispettivamente) o diluite in tale mezzo o buffer. Triturazione con la stessa punta assicurerà miscelazione.
- Per i campioni di controllo, comprendente (i) Medium sola, non contenente IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM aggiunto al mezzo da solo al volume finale del 10%; e / o (iii) VEGF-A diluito a 100 ng / ml nel solo mezzo, non contenente IL-3.
- Riempire i pozzetti non utilizzati della piastra pozzetto con acqua sterile, PBS o mezzo e mettere il piatto all'interno di un contenitore umidificato (con acqua imbevuto carta velina) che consente lo scambio di gas. Incubare le cellule all'interno dei contenitori in atmosfera umidificata del 10% CO 2. Questo test può essere comodamente installato in 3 ore da una sola persona, se sono disponibili campioni di prova e componenti multimediali.
- Valutare le piastre in genere dopo 16 ore diincubazione a cui la discriminazione tempo tra campioni positivi e negativi è evidente. Vedere la Figura 3 per gli esempi di come le cellule appaiono in cultura. Analizzare le piastre utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito serie a 40 - 100 × ingrandimento.
Nota: Wells contenenti fattori di crescita di supporto come IL-3 o VEGF-A conterrà cellule che appaiono rotondi e traslucido. Wells senza fattori di crescita di supporto o con il solo supporto saranno hanno ridotto il numero di cellule rotonde, così come le cellule morte o morenti e detriti cellulari (ad esempio, la Figura 3C). La valutazione del test a 24-48 ore dopo l'incubazione è l'optimum per la sensibilità.
4. Quantitative Bioassay
- Aggiungere cellule lavate (10.000 cellule in 135 ml) di IL-3 con deficit medio ai pozzetti della micropiastra a 96 pozzetti di serie a temperatura ambiente. Fare attenzione a miscelare la sospensione cellulare durante aliquotting per garantire sedimentazione delle cellule per gravità non influenza cela concentrazione ll.
- Aggiungere campioni e controlli ai pozzetti a 10 volumi% (15 microlitri) con una pipetta calibrata (P20). Fare attenzione al fine di garantire che i campioni siano compatibili con le condizioni di coltura per cellule Ba / F3 in termini di pH, sale o altre sostanze potenzialmente citotossici / citostatici. Se possibile, utilizzare un supporto compatibile o tampone (ad es., DMEM o PBS) o diluite in tale mezzo o buffer. Filtro sterilizzare piccoli volumi con un acetato di cellulosa unità filtrante provetta 0,22 micron pori.
- Incubare la miscela di cellule, fattori di crescita e / o agenti inibitori in atmosfera umidificata del 10% CO 2 per 48 ore. Eseguire il test all'interno di un contenitore umidificato che ha la carta velina imbevuta di acqua e consente scambi gassosi. Al termine del periodo di incubazione, valutare il dosaggio con uno dei metodi alternativi elencati di seguito, che sono indicatori surrogati del numero di cellule vitali nel pozzo.
- Alternativa # 1: 3 H-thymidine incorporazione
Nota: Questa quantificazione è stata progettata per il formato piastra a 96 pozzetti.- Dopo incubazione delle piastre test per 48 ore a 37 ° C (da 150 microlitri per pozzetto), aggiungere 3 H-timidina in un volume di 50 ml di terreno di coltura (Ba / F3 mezzo di coltura senza IL-3 / WEHI-3D CM) per pozzetto ad una concentrazione di 20 pCi / ml, dando una dose finale di 1 pCi per pozzetto.
- Incubare le piastre per altre 4 ore a 37 ° C prima della raccolta cellule utilizzando una mietitrice cellulare. Estrarre singoli campioni mettendo i filtri in scintillante e quantificare con un contatore a scintillazione liquida.
- Alternativa # 2: bioluminescenza Detection of Cellular ATP
Nota: Questo metodo utilizza un reagente monitoraggio ATP che, quando combinato con lisato cellulare può generare un segnale di bioluminescenza che riflette le cellule vitali nella popolazione.- cellule Lisare per estrarre ATP e utilizzano un reagente Monitoring ATP per generare unsegnali luminescenti secondo le istruzioni del produttore. Leggere luminescenza usando un luminometro compatibili con un formato a 96 pozzetti.
- Alternativa # 3: Riduzione enzimatica di un colorante indicatore da cellule vitali
Nota: test basati resazurina mostrano una buona correlazione con la vitalità cellulare.- Combinare cellule in coltura con il colorante a base resazurina e quantificare le analisi usando un lettore di piastre a fluorescenza in base alle istruzioni del produttore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In questa sezione, mostriamo i risultati di un esperimento che dimostrano le caratteristiche essenziali di un saggio biologico VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (vedere Figura 1 dei principi del saggio). Altri studi pubblicati dimostrano le applicazioni più ampie del saggio per alternative VEGFR-2 ligandi, molecole VEGF mutanti e gli anticorpi monoclonali inibitori 8,10,19,24-30.
I dati presentati qui rappresentano un saggio in cui il / F3 saggio biologico VEGFR-2-EpoR-Ba viene utilizzato per quantificare l'attività dei tre ligandi umane ricombinanti (VEGF-A165, VEGF-C e VEGF-D) con specificità per VEGFR -2 in presenza di un anticorpo monoclonale inibitorio (bevacizumab) di VEGF-a 165. I dati sono stati normalizzati rispetto alla risposta a VEGF-a 165 alone (Figura 2). Come previsto, bevacizumab bloccato l'effetto di VEGF-A 165 nel saggio, maavuto alcun effetto sull'attività di VEGF-C e VEGF-D.
Nella versione semi-quantitativa del dosaggio o quando osservando il dosaggio durante il suo sviluppo, la visualizzazione del test utilizzando un microscopio invertito trifase standard possono fornire informazioni preziose sullo stato di avanzamento del dosaggio. L'analisi di un test (Figura 3) mostra la buona vitalità di VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 cellule biodosaggio quando incubate con terreno contenente IL-3 o ligando per VEGFR-2, ad esempio, VEGF-A. Queste cellule sono grandi e traslucido, e non vi è nessuna o minima evidenza di granularità nel citoplasma cellulare o detriti cellulari in coltura. Nel pozzo senza fattori di crescita aggiuntivi vi è già la prova di numero di cellule ridotti e poche cellule sane. Le cellule presenti hanno una significativa granularità nel loro citoplasma e detriti cellulari è una caratteristica costante della cultura. Dopo 48 ore non vi è alcun segno di cellule vitali.
Figura 1. Schema Descrivendo i principi del VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 Bioassay. (A) cellule Ba / F3 sono fattore-dipendente e richiedono un fattore di crescita esogena, come IL-3 per stimolare la crescita delle cellule / la vitalità via endogeni iL-3 recettori e il percorso di segnalazione JAK. Se EpoR è espresso in queste cellule salvataggio può avvenire anche attraverso la via JAK. L'espressione di un full-length del recettore tirosin-chinasi, come VEGFR-2 risultati in segnalazione minima come bersagli a valle di VEGFR-2 di attivazione non impegnano la via JAK. Un recettore chimerico con la regione extracellulare di VEGFR-2 fuse alle transmembrana e citoplasmatici regioni EpoR, quando trasfettati in cellule Ba / F3 e stimolate con specifici VEGFR-2 ligandi, è in grado di attivare il pathway JAK e cellule di guidala sopravvivenza e la proliferazione. (B), le cellule / F3 VEGFR-2-EpoR-Ba esprimono livelli significativi del recettore chimerico VEGFR-2-EpoR che può essere quantificata mediante citometria a flusso. Una volta lavato su IL-3 terreno contenente le cellule sono posti in una varietà di condizioni di coltura che guidano sia la sopravvivenza / proliferazione delle cellule. Cellule Ba / F3 untransfected o VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 cellule senza specifici fattori di crescita non riescono a crescere / sopravvivere. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La valutazione di VEGFR-2 ligandi nella / F3 analisi biologico. IL-3-dipendente cellule / F3 VEGFR-2-EpoR-Ba Ba che esprimono un mouse VEGFR-2-EpoR chimera sono state seminate in mezzo senza IL-3 (ad eccezione perl'+ IL-3 sottoinsieme, come indicato) più VEGF-A umana 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (questa è una forma di VEGF-C che consiste nella regione centrale ed esclude le N e C-terminali propeptidi), o VEGF-DΔNΔC (questa è una forma di VEGF-D che comprende la regione centrale ed esclude le N e C-terminali propeptidi (VD)) a 100 neutralizzazione anticorpo monoclonale bevacizumab ng / ml e umanizzato (che lega e inibisce VEGF-a, ma non VEGF-C o VEGF-D), o controllare non-anticorpi neutralizzanti trastuzumab, come indicato in 0,75 mM. NF = medio che non contiene fattori di crescita aggiuntivi. Quarantotto ore dopo, relativo numero di cellulare dal vivo è stata quantificata mediante il rilevamento bioluminescenza di ATP cellulare. Le barre verticali rappresentano mezzi (normalizzato rispetto alla risposta al VEGF-A 165 da solo, prima barra) e l'errore standard della media di tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per view una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Cellule VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 sono dipendenti da fattori di crescita esterna per la sopravvivenza. Esempi di VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 prova biologica in cui IL-3-dipendente cellule Ba / F3 esprimono un mouse VEGFR- 2-EpoR chimera sono state seminate in terreno (a) contenente 10% WEHI-3D mezzo che fornisce IL-3, (B) 100 ng / a VEGF-(senza IL-3), o (C) medium ml umana 165 con condizionato no IL-3 o fattori di crescita aggiuntivi. La cultura è raffigurato 24 ore nel test mostra cellule altamente vitali in presenza di IL-3 (A) o VEGF-A 165 (B), mentre nella cultura senza (C) morte cellulare IL-3 o fattori di crescita addizionali e rossouced vitalità sono chiaramente evidenti. Bilance bar sono 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il test qui descritto si basa sull'utilizzo di cellule di alta redditività, che dipendono da fattori di crescita. Le cellule devono quindi essere attentamente colta per assicurare che siano fattore-dipendente, e mantenere l'espressione del recettore chimerico. Garantire che il mezzo è preparata e non conservati per un periodo di tempo eccessivamente lungo e che WEHI-3D CM è molto attivo è importante. Le cellule devono essere accuratamente lavati da IL-3 contenente media nel terreno di coltura per garantire che nessun residuo di IL-3 contamina il dosaggio quando esponendo le cellule ai ligandi salvataggio. Come leganti possono venire in un certo numero di forme diverse, la cura deve essere presa Nella preparazione di questi per il saggio. Conservanti, agenti anti-batterici, sale o tamponi di pH diversi possono influenzare il test, e questo è il motivo per cui il test parallelo di cellule Ba / F3 untransfected può informare sui problemi di buffer-related.
Usiamo entrambi i protocolli semi-quantitativi e quantitativi. Il semi-QUANTITATIVAve test permette una rapida valutazione dell'attività di campioni prima di impegnarsi in un saggio completamente quantitativa che richiede più tempo e di campionamento. Il metodo quantitativo viene utilizzato esclusivamente durante la generazione di dati per la pubblicazione. I metodi alternativi per rilevare la vitalità della cultura sono relativamente semplici. Il dosaggio quantitativo è stato adattato per un certo numero di formati diversi per la quantificazione della proliferazione, e abbiamo utilizzato (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro) MTT 30, rilevamento bioluminescenza di cellulari ATP (non pubblicato), colorante resazurin-based (Figura 2) e 3 H-timidina 31 con successo. Negli ultimi anni si è passati dal uso di radiazioni per adattarsi approcci bioluminescenza e hanno utilizzato il colorante resazurina basato grazie alla sua economicità. Tutti gli approcci danno risultati appropriati e la scelta può dipendere dalla disponibilità dei reagenti e l'associated lettori di piastre specializzati in un laboratorio data / istituto o la familiarità con particolari approcci.
Risoluzione dei problemi ruota attorno l'attività dei tre componenti principali del saggio, i) IL-3 cm, ii) cellule VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 e iii) ligandi stimolanti. bassi livelli di IL-3 in CM a causa di celle inadeguate WEHI 3D nella cultura iniziale, condizioni di conservazione poveri, eccessivi cicli di gelo-disgelo o con troppo alto una diluizione in grado di creare culture male crescenti che ostacolano il test. Questo è di solito rilevato in pozzetti di controllo come le popolazioni di cellule in crescita lentamente, perdendo la loro normale aspetto luminoso e rotondo. Il VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 cellule test può perdere espressione superficie cellulare del costrutto chimerico nel tempo se tenuti in coltura per lunghi periodi. Il mantenimento di buoni numeri di scorte di azoto liquido permette colture fresche di cellule che esprimono il recettore chimerico altamente siano disponibili in ogni momento. In caso di necessità di una popolazione che esprime ad alta può essereottenuto coltivando cellule VEGFR-2 ligandi e selezionando la popolazione che esprime elevati livelli di recettore chimerico per citometria a flusso ordinamento. Queste cellule vengono poi ulteriormente espanse in coltura per il congelamento.
Mentre la tecnica è una comoda e semplificato alternativa per analizzare interazioni con il dominio extracellulare VEGFR-2 non può essere visto per sostituire esperimenti più sofisticati in cui il recettore nativo sulle cellule endoteliali primarie è rilevato in presenza di altri VEGFRs, co-recettori come neuropilins. Le celle su cui si basa questa analisi (cellule B) sono distinti da cellule endoteliali e dovrebbero quindi non possono essere utilizzati per studiare le vie di segnalazione citoplasmatici e fattori di trascrizione che rispondono a VEGFR-2 di attivazione nelle cellule endoteliali. Tuttavia, il metodo prevede un approccio utile per analizzare l'interazione recettore-ligando che si trova tra un semplice saggio di legame che esamina l'interazione di un ligando con una recep immobilizzatotor costruzione (ad esempio una regione recettore solubile extracellulare o una regione extracellulare del recettore fuso immunoglobuline), e l'analisi di legame al recettore e effetti a valle visti in saggi a cellule endoteliali primarie vincolante. Esso fornisce un sistema per consentire il legame e cross-linking dei recettori, i primi due stadi con cui molti recettori di tipo tirosin chinasi comunemente avviare la cascata di trasduzione del segnale. La sua applicazione in diversi ambienti accademici e commerciali ha mostrato è accettato come un test utile per esaminare caratteristiche di legame, soprattutto quando si valutano leganti varianti o inibitori del recettore-ligando.
Il saggio è utile anche per l'analisi di nuovi inibitori del recettore dominio extracellulare o dei suoi ligandi. Il dosaggio può essere ulteriormente usata per selezionare rapidamente varianti dei ligandi o recettori regioni extracellulari visti nel contesto di mutazioni geniche (sia ereditato e somatica) in ge umananes in malattie come il cancro 32,33 per determinare la loro conseguenza funzionale. Quindi le applicazioni di questo test VEGFR-2 sono suscettibili di ampliare in futuro. Inoltre, l'approccio generale alla base di questo test può essere utilizzato più in generale per la superficie delle cellule del recettore tirosin-chinasi, che costituiscono un grande e importante famiglia di molecole di segnalazione in materia di salute e di malattia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Steven A. Stacker e Marc M. Achen sono azionisti di circadiano Technologies Ltd., una società di sviluppo di terapie di mira la famiglia dei fattori di crescita VEGF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester | |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K.
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K.
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
