Introduction
乳がんは女性で最も頻繁に診断される癌および癌関連死1の第二の主要な原因です。乳がんの死亡率の高さは、主に転移性疾患を軽減し、排除する従来の治療の失敗によるものです。癌関連死の約90％は、転移2によるものです。転移カスケードの根底にある分子機構を理解することは、初期および後期段階の乳癌の両方で効果的な治療法の開発に最も重要です。
過去の研究では、乳癌転移の多段階の性質の解明に役立っており、癌の進行および転移の両方の結果は、癌細胞と宿主環境3との間の相互作用に大きく依存すると仮定されます。臨床観察は、多くの癌、 すなわち 、臓器向性を表示することを示している。、傾向が優先CAS organs.In特定に転移します乳癌のEは、患者の疾患は、典型的には、広がるか、骨、肺、リンパ節、肝臓、および脳4-6を含む5つの主要な部位に転移します。多くの理論は、このプロセスを説明するために開発されてきたが、わずか数は、時の試練に耐えてきました。転移のユーイング理論は、1920年代に提案され、転移のthatthe分布が厳密に機械的要因によるものであった仮定しました。腫瘍細胞は正常な定義された生理の血流パターンによって身体全体に運ばれ、単に最初の毛細血管床に逮捕されたことにより、彼らは7に遭遇します 。これとは対照的に、スティーブン・パジェット1889「種と土壌」仮説は、癌細胞（「シード」）は自分自身だけと適切な分子の要因（「土を生成proliferatein臓器微小環境を確立することができる、追加の分子相互作用は、転移の生存と成長のための責任があったことを示唆しました"）8。ほぼ一世紀後に、レナード・ワイスの下で以前に発表された剖検データのメタ分析を取り、剖検時に検出多くの転移性腫瘍が転移臓器向性は、単独での血流パターンによって決定した場合に予想される予想される割合で発見されたことをユーイング予測を確認しました。しかし、manyinstancesでその後ユーイング提案機械的要因9によって予想される特定の部位に形成され、より少ないまたはそれ以上の転移がありました。これらのアカウントと理論は、特定の臓器微小環境が普及パターンと乳癌を含む多くの癌のその後の成長と生存に重要な役割を果たしていることを示唆しています。
過去の研究努力は、主に腫瘍細胞由来因子に着目し、乳癌転移10-12で観察された臓器向性への貢献、しかし少し研究は、設立のための有利なニッチを提供することができる臓器微小環境由来の要因を検討していています乳癌転移の。これは、in vitroでの臓器微小環境の成分を研究する技術的課題に負うところが大きいです。
現在の記事は、ヒト乳癌細胞の転移挙動のリンパ節、骨、肺、および脳の可溶性成分の影響を研究するための包括的なのex vivoモデルシステムが記載されています。以前の研究は、異なる乳癌細胞株は、それらのin vivoでの転移能13に対応する器官馴化培地に応答して、細胞株特異的および器官特異的悪性の挙動を示すことを実証することによって、このモデル系を検証しています。このモデル系は、増殖、遊走、幹様挙動、および遺伝子発現に影響を含む乳癌癌細胞の他のタイプの転移挙動において役割を果たし得る特定の器官由来の可溶性因子を同定および評価するために使用することができ、同様の識別癌のための潜在的な新規治療標的。これは、具体的に器官特異的転移挙動を研究するために、および癌転移の過程を駆動する器官由来の可溶性因子の役割を評価するために使用することができる第一のex vivoモデル系です。
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Protocol
すべての動物実験は、ウェスタン大学の動物利用小委員会によって承認されたプロトコルの下で、動物ケアに関するカナダ評議会の勧告に従って行いました。
1.臓器の単離（肺、脳、骨、リンパ節）
- 4滅菌50ミリリットルにコニカルチューブを準備し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の約30ミリリットルを含む（各臓器のための1を分離することにします）。電子天秤を用いて、PBSの各チューブを事前に重量を量ります。
- CO 2吸入によって6-12週齢のマウスを安楽死させます。 2分またはマウスが移動し、呼吸停止するまで-マウスは、約1のためにCO 2チャンバー内に残されるべきです。指を使って手動でチェックすると成功した安楽死は、さらにハートビートの欠如によって確認することができます。この方法として、頸椎脱臼を回避する腋窩リンパ節を除去することが困難につながる首の血管を破裂することができます。
注：以前の研究は、具体的に使用しています健康な女性のヌードマウス、HSD：無胸腺Nude- Foxn1 nuの 13。 - 滅菌組織培養フードでは、ポリスチレンフォームパッドの上に仰向けにマウスを置いて手足を広げて、場所でそれらを保つためにピンを使用します。
- 滅菌ピンセットやハサミを使用して、生殖器で正中線で腹部の皮膚を切ると口に向かって上向きにカット。ゆっくりポリスチレンフォームパッドの上に所定の位置に腹筋とピンから腹部の皮膚を引き戻します。
- 腋窩、上腕および鼠径リンパ節の位置を確認します。
注：リンパ節は、通常、脂肪組織に囲まれています。鼠径リンパ節は、それらが引き戻さ腹部皮膚上の2つの血管の接合部に表面的に見られるように配置することが最も簡単です。腋窩及び上腕リンパ節を組織内に深く位置し、組織の穏やかな操縦を必要としています。- あなたはリンパ節を見つけた後、静かに、慎重に何のリンパ節をカットするはさみを使用しませんデ肌、脂肪や血管から、マウスから削除します。適切な解剖を確認するには、削除された組織の上に鉗子をロールバックします。組織の上に鉗子を転がすときに硬いしこりが存在する場合は、リンパ節は、おそらく正常に削除されました。
- 氷冷PBSで削除リンパ節を置きます。
- ピンセットやハサミを使用して、胸に向かって上昇運動にさらさ腹壁を切開により腹腔を開きます。慎重に胸腔を露出し、胸骨を切断。
- 肺下の横隔膜の位置を確認し、振動板をカット。それは緊張に起因するリブに向かって引っ張る必要があります。
- 下から肺を持ち上げて、気管に向かって下にある組織をカット。これは、肺が胸腔から自由に削除することができます。氷冷PBSでブロックし、場所エン心臓や肺を削除します。心臓は、ステップ2に計量前に必ずこちらか、単に肺から除去することができます。
- 削除しますピン、ポリスチレンフォームパッド上の所定の位置でマウスを保ちます。マウスを裏返しと隣接するすべての方法サイドから全体の腰の皮膚をカット。
- マウスの胴体を保持するために、ガーゼの滅菌片を用いて、マウスの足と足の上にマウスの背中の皮膚の皮をむきます。
- 滅菌ガーゼの同じ部分を使用して、慎重に、所定の位置に下肢を保持するマウスの足の足首関節を破壊し、膝関節に向かって近位関節上の皮膚の皮をむきます。
- はさみを使用して、氷冷PBSで膝関節と場所から自由に脛骨を削除します。
- 繰り返して、反対側の手足に）1.12）1.11を繰り返します。
- 鉗子を使用して、氷冷PBSに置く、はさみを使用して、周囲の筋肉組織を切り取ると大腿骨を除去し、所定の位置に大腿骨を保持します。
- 反対側の手足と手順を繰り返し1.14）。
- 滅菌ガーゼの新しい作品を使用して、所定の位置にマウスの頭部を保持します。ピンセットやハサミを使用して、そっと秒を公開するために皮膚を除去カル。はさみを使用して、慎重に後部脳を露出するようにまっすぐ下方ラインの上部中央から後頭部頭蓋骨をカット。
- 鉗子を使用して、前方に向かって脳の下にスクープと脳全体を削除します。氷冷PBSで脳を置きます。
- 少なくとも4匹のマウスのためのステップ1.1）1.17へ）を繰り返します。
2.オルガン計量
- 臓器単離後、電子天秤を用いて、肺および脳組織を含む各PBSチューブの重量を量ります。
- PBS管の重量+臓器（肺及び脳）からプレ分離重量（PBSのみ）を差し引くことにより、重量差を計算します。
- 計算された重量差から組織片を再懸濁するために必要なメディアの量を決定します。
注：1メディア：組織比（容量/重量）肺および脳組織を4に再懸濁することによって正規化量です。
Lung-と脳 - 馴化培地の3世代
- 無菌トンで問題培養フード、血液を含む臓器や吸引PBSから残留血液を除去するために、肺や脳の3回を含むPBSチューブを反転。解決策は、血液の証拠と透明になるまで新鮮な冷PBSで繰り返します。
- 独立した60ミリメートル2ガラスペトリ皿に肺や脳を置きます。 2滅菌メスの刃を使用して、組織フラグメントのサイズが〜1ミリメートル約3になるまで繰り返し前後にスライスして、肺や脳をミンチ。
- 再懸濁組織断片は、適切な音量にダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の（ステップ2.3で事前に決定）：1×を補充したF12培地は、マイトジェンサプリメントとペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ ml）を濃縮しました。
- 6ウェルプレートの1ウェルに再懸濁させ、肺や脳組織断片を追加します。
- 37℃で24時間、5％CO 2のメディアに組織片をインキュベートします。インキュベーション後、各組織およびfのための馴化培地を収集urther 50ミリリットルコニカルチューブに新鮮な培地の3同等のボリュームを追加することによって希釈します。
- 大規模な組織片を除去するために15分間、4℃で各器官のための希釈された馴化培地1,000×gで遠心分離します。メディア上清を収集し、0.22μmのシリンジフィルターでろ過します。
- プールは、各臓器からの馴化培地（ すなわち 、脳と肺や脳と肺）は、複数のマウスからのマウス・ツー・マウスの変動を考慮するために。アリコートとストアが使用するまで-80℃で馴化培地。
骨髄馴化培地の4世代
- 滅菌組織培養フードでは、骨から過剰な組織をトリミングして、ハサミで骨から骨端（エンドピース）を取り外します。
- 各ボーンの中心を通って1mlのPBSを押すことによって、骨の27½G針、フラッシュ髄腔を使用しました。これは、PBSを含有する新鮮なチューブに骨髄間質細胞（BMSC）を収集することができます。
- 1,00での遠心分離0は、4℃で5分間XGおよびPBSで2回BMSCを洗います。骨間質細胞増殖培地20ml中に再懸濁した骨髄間質細胞（DMEMは：1×を補充したF12培地は、マイトジェンサプリメント、ペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ ml）および10％胎児バルボーベン血清（FBS）を濃縮しました）。
- プレート1 T75フラスコ中で再懸濁した骨髄間質細胞を10ml。
注：各T75フラスコ内の各2匹のマウスから合わせて、プレートの細胞; 4匹のマウスのために、2 T75フラスコを（約1×10 7細胞/フラスコ）必要とされています。 - 37℃で24時間、5％CO 2のための骨間質細胞の増殖培地に骨髄間質細胞をインキュベートします。インキュベーション後、両方のT75フラスコからメディアを削除し、新しいT75フラスコに入れ、「フローターフラスコ」として、このフラスコにラベルを付けます。前の2フラスコに新鮮な骨間質細胞増殖培地を追加し、全37℃で3フラスコおよび5％CO 2をインキュベートします。
- 7 - 細胞は、約70％の集密度（約5に到達した後日）継代細胞。これを行うには、培地を除去し、PBS（3ミリリットル各洗浄）で2回細胞を洗浄します。 PBSを削除し、トリプシン/ EDTA溶液の3ミリリットルを追加し、そのトリプシンをフラスコの表面全体を覆っている確保します。細胞がオフフラスコ持ち上げた後（約2 - 3分間）3mlの骨間質細胞の増殖培地を添加することによりトリプシン処理反応を停止させます）。遠心分離機は、900×gで4℃で5分間、新鮮な骨間質細胞増殖培地10mlにメディア、再懸濁細胞を廃棄します。
- すべてのフラスコおよび継代1からプール細胞：5つの新しいT75フラスコに、37℃、5％CO 2でインキュベートします。細胞は再び70％に到達した後、ステップ4.6およびプールとの通路すべての付着細胞をもう一度繰り返します。再プレートすべての4つのT75フラスコに細胞とは、37℃、5％CO 2をインキュベートします。骨間質細胞の増殖培地は、全ての工程のために使用されるべきです。
- 細胞は、骨間質細胞収集メディアを、コンフルエンスに達するPBSで細胞を3回洗浄し、追加することができます（DMEM：F12培地+ 1倍に濃縮マイトジェンのsupplement +ペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ mlの）;このメディアは、FBSの自由であることを確認して10ミリリットル/ T75）、。 72時間後に骨髄馴化培地を収集し、使用するまで-80℃で0.22μmのフィルター、プール、アリコート、およびストアを介してフィルタリングします。
- 所望であれば、以前に13に記載のような標準的なフローサイトメトリー技術を用いて、マウスのSca-1、CD105、CD29、およびCD73、CD44に対する抗体を用いて単離した骨髄間質細胞（BMSC）の表現型を確認します。
リンパ節付きメディアの5世代
- 無菌組織培養フード中で、リンパ節および吸引血のPBSから残留血液を除去するためにリンパ節を3回含むPBSチューブを反転させます。解決策は、血液の証拠と透明になるまで新鮮な冷PBSで繰り返します。
- 60ミリメートル2ガラスシャーレ内のリンパ節を置きます。繰り返しTISSUまで前後にスライスして2滅菌メスの刃、ミンチリンパ節を使用して、E断片のサイズは約1mm 3です。
- 円錐管では、ロズウェルパーク記念研究所1640（RPMI1640）ペニシリン（50μg/ ml）を添加した培地/ストレプトマイシン（50μg/ mlの）、5×10 -5 Mの滅菌βメルカプトエタノールの10ml中に再懸濁組織断片（ 1.75μL/ 500mLの培地）および10％FBS。
- 4℃で5分間、900×gで遠心分離し、30mLの培地中のすべての細胞を再懸濁。 5ミリリットルメディア/ 6ウェルプレートに加え、37℃で7日間、5％CO 2インキュベートします。
- 7日間のインキュベーションの後、培地を捨て、温かいPBS 5mlで接着細胞を洗浄し、各ウェルに5ミリリットルを新鮮な培地を追加します。細胞が密集するまで増殖させ（約5から7日間）、トリプシン処理、ステップ4.6で説明したように、すべてのセル、および流路をプールします。 6ウェルプレートに再プレート細胞。この手順を3回繰り返します。
- 3継代後、PBSでウェルを3回洗浄し、追加し、細胞がコンフルエントになるまで成長することを可能にする2ミリリットル/ウェルのDMEM：F12 + 1×このメディアは、FBSの自由であることを確実に濃厚マイトジェンサプリメントとペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ mlの）、。使用するまで-80℃で72時間、プール、アリコート、およびストアの後にリンパ節馴化培地を収集します。
- 所望であれば、以前に13に記載のような標準的なフローサイトメトリー技術を用いて、マウスCD45およびGP38に対する抗体を用いて単離されたリンパ節間質細胞（LNSC）の表現型を確認します。
癌細胞の転移挙動に関連するダウンストリームのアッセイのためのオルガン付きメディアの6.
- 5、癌細胞の転移挙動の可溶性器官由来の因子の影響を決定するために、別の下流の細胞および分子生物学アッセイを実施するために使用 - 器官馴化培地たらステップ1に記載したように生成されています。 （文献の他の箇所に記載）の標準的なアッセイの例としては、タンパク質アレイ13、細胞増殖アッセイ、<SUP> 13、細胞遊走アッセイ13、tumorsphere形成14、およびRT-PCR 15。元のベース媒体は、（臓器馴化培地を生成するために使用される、すなわち 、無条件DMEM：1×を補充したF12培地）をマイトジェンサプリメント及びペニシリン（50μg/ mlの）/ストレプトマイシン（50μg/ mlの濃縮陰性対照として使用されるべきです。
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Representative Results
オルガン付きメディアの生成
臓器の単離および馴化培地の生成のプロセスの概要図/概略図を図2に示す手順の代表的な写真画像と、 図1に示されている。このプロトコルは、最初の開発中であった場合、肝臓が含まれていたことに留意すべきです我々の分析では、乳癌転移の一般的な部位であるためです。しかし、肝臓によって産生され、分泌されたプロテアーゼの大量の、良好な品質の馴化培地を生成するのに十分に長く生存肝臓を維持することは非常に困難です。肝臓馴化培地を単離した後も安定していない、と同じ理由のための可能性が高いタンパク質沈殿物の多くは、なるように傾向があります。したがって、肝臓は、任意のさらなる分析には含まれていませんでした。
図3A）を実証し、骨髄幹細胞が小さく、外観（ 図3C）を実証するとともに、培養中の接着剤であるべきです。 GP38 + LNSCs 16（ 図3B）を示す表現型- CD45を有する細胞の〜60％とし、GP38の+、 -フローサイトメトリー分析は、LNSCsが大きくCD45であることを確認します。 、骨髄幹細胞17,18の指標-骨髄幹細胞は、CD44およびCD29に対する陽性CD105およびSCA-1のために弱陽性、およびCD73（H図3D）用の負でなければなりません。
乳癌細胞Respは臓器適切な移行パターンと遺伝子発現の変化にオンセ
このエクスビボモデル系を使用して、以前に変化遺伝的背景を有するヒト乳癌細胞は、特定の器官の状態に向かって差動移動および増殖パターンを示すことが実証されています。注目すべきことに、これらのパターンは、 インビボ 13 におけるこれらの細胞株の既知の転移性播種パターンを反映します。現在の研究では、骨（231-BOM） -及びMDA-MB-231ヒト乳癌細胞の変異体の変異体を-seeking肺（231-LM2）（博士ジョアンMassagué11,12からの親切な贈り物）にもなっています臓器適切な移動パターンを確認するために、トランスウェル遊走アッセイで使用されます。結果は、骨を求める231-BOM変異体が優先的に脳-オーバー骨髄馴化培地に移行し、馴化培地（ 左図4Aを、）lung-ことを示しています。同様に、肺を求める231-LM2変異体は、優先的に骨髄馴化培地と脳馴化培地（ 右図4A）を介して肺馴化培地に移行されます。また、RT-qPCR分析は、親MDA-MB-231乳癌細胞の曝露は、骨、あるいは肺馴化培地は、骨特異的転移に関連する遺伝子のアップレギュレーションを引き起こすことを示している（CXCR4、IL-11、TGFß1）またはlung- インビボ 11,12 における乳癌細胞の特異的な転移（VCAM1）（ 図4B）。これらの結果は、インビボでの乳癌細胞の予想される臓器向性に関してエキソビボシステムの有効性を実証し、そして器官馴化培地中に存在する可溶性因子は、遊走の促進に加えて、転移性細胞表現型に影響を与えることができることを示しています。
オルガン付きメディアは転移挙動の可能性可溶性メディエーターが含まれています
ビオチン標識ベースのマウス抗体配列は、異なる器官からの器官馴化培地中で一般的な可溶性因子の存在および同一性を評価しました。この配列は、チューらに示したように、以前に肺および骨髄馴化培地内転移カスケードの存在に関連した関心の可溶性因子を同定するために使用されている（2014年）の最も一般的な可溶性マウスproteins.Thisタンパク質配列の308に対する抗体を含んでいますそしてピオら （2015）はそれぞれ13,14。現在の研究では、タンパク質アレイの結果はリンパリンパ節転移（ 図5B）と脳馴化培地（ 図5C）と比較して、基本培地（ 図5A）について示されています。文献19-29で転移カスケードのステップに関連することが見出されているメディアに存在する可溶性因子は、各配列の横に強調されています。これらの可溶性FACターは、これらの臓器サイト内の二次転移の潜在的なメディエーターとして調査する価値があるかもしれません。
オルガンの分離の過程の図1.概要図と馴化培地の生成。組織（肺、脳、大腿骨、脛骨およびリンパ節）をマウスから採取されます。肺を、脳およびリンパ節はメスでミンチされています。骨髄が27½G針で空洞を通ってPBSを押すことによって、骨の骨髄腔から採取されます。肺および脳組織断片は、新鮮な基礎培地の3等量で希釈する前に、24時間の期間インキュベートし、lung-と脳馴化培地を作るために収集されます。骨やリンパ節馴化培地を作るために、基本培地と共にインキュベートする前に、3回 - 骨髄およびリンパ節間質細胞を2継代されています。 収穫したメディアは、pすることができますooledと、このようなタンパク質アレイ、細胞増殖アッセイ、細胞遊走アッセイ、tumorsphere形成、およびRT-PCRなどの下流のアッセイにおける使用のための準備ができるまで-80℃で保存されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図馴化培地の臓器単離および生成するための手順の2.代表的写真画像。0日目では、肺、脳、大腿骨、脛骨およびリンパ節をマウスから収集されています。肺、脳およびリンパ節のサイズは約1mm 3への2つのメスの刃、60 mm 2のガラスシャーレに入れ、ミンチされています。骨髄は、新しいチューブに27½G針で空洞を通ってPBSを押すことによって、骨の骨髄腔から採取されますPBSの。肺や脳組織断片は、新鮮な培地の3等量で希釈する前に、37℃、5％CO 2で24時間の期間インキュベートし、24時間後にlung-と脳馴化培地を作るために収集されます。骨髄およびリンパ節間質細胞は、37℃でインキュベートし、5％CO 2と2継代されている-骨やリンパ節馴化培地を作るために、無血清基礎培地に培地を交換する前に3回（合計〜3週間）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
単離されたリンパ節と骨髄間質細胞の図3.キャラクタリゼーション。 （A）リンパ節間質細胞（LNSCs）の形態を示す明視野顕微鏡画像。（B）代表流れフィコエリトリン（PE）を使用してLNSCsのサイトメトリー分析GP38抗体を抱合し、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）はCD45抗体を-コンジュゲート。骨髄間質細胞（BMSC）の形態を示す（C）明視野顕微鏡画像。（DH）代表流れPEコンジュゲート（黒プロファイル）を使用して、骨髄幹細胞のサイトメトリー分析（D）CD44、（E）CD106、（F）SCA-1に対する抗体、アイソタイプコントロール（白プロファイル）に比べて（G）CD29（H）CD73抗体。万実行可能なイベントの最小値は、サンプルごとに収集しました。この図は、13から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.または、GaN系適切な移行パターンとオルガン付きメディアに応答した遺伝子発現の変化。 （A）231-BOMの骨を探索変異体（ 左、ストライプバー ）またはMDA-MB-231ヒト乳癌細胞株の肺を求める231-LM2バリアント（ 右、縞模様のバー ）だけでなく、親のMDA-MB-または器官-CM：231細胞（ 両方のパネル、ソリッドバーは ）基本培地（F12 +濃マイトジェンサプリメントDMEM）に置く前に（8μmの細孔を有する）ゼラチン被覆インサート上に播種しました。プレートを18時間CO 2を 37℃でインキュベートし、5％であった。（B）全人口親MDA-MB-231細胞は、48時間のいずれかの骨-CM（ 左 ）または肺-CM（ 右 ）に曝露しました。 RNAを単離し、RT-qPCRを使用して定量化し。臓器-CM（ 黒棒 ）に応答した遺伝子発現の変化GAPDHに対して標準化し、基本培地（ 灰色の棒 ）におけるベースライン発現と比較して表し。データは、平均±SEM（として提示されていますN = 3。基礎培地のそれぞれの陰性対照からの）変更を折ります。 * =基礎培地と著しく異なります。 δ=同じ培地条件で処理した親細胞株と著しく異なります。 P <0.05、ANOVA。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.オルガン付きメディアは転移挙動の可能性可溶性メディエーターが含まれています。ビオチン標識ベースのマウス抗体アレイはリンパ節-CMと脳-CM中に存在する可溶性因子を同定するために使用されました。膜は、（A）基本培地（DMEM：F12 +濃縮マイトジェンサプリメント）のビオチン化試料とインキュベートした4 O CO / Nで、（B）リンパ節-CMまたは（C）脳-CM及びchemilumを用いて可視化inescence。ブルー楕円は並んボックスが内部陰性対照と固体ボックスは、潜在的にリンパ節や脳への乳癌細胞の転移挙動に関与している関心の可溶性因子を示す示し、内部陽性対照を示している。 このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。
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Discussion
転移は、携帯一連のイベントは、組織浸潤および遠隔腫瘍の確立4,30,31のための最終的な責任であることにより、複雑なプロセスです。特定の臓器（「そこの取得」）およびその器官（「そこに成長している」）の成長に癌細胞のホーミングまたは移行：ここで紹介するのex vivoモデル系は、転移性進行の二つの重要な側面を研究するために利用することができます。多くの研究は、以前に転移プロセスに貢献する癌細胞自体に関連付けられたキー分子的特徴を同定することに焦点を当てています。例えば、ジョアンMassaguéのグループによって行われた仕事は、肺特異的、骨特異的、およびスプレッド10-12,32の脳特異的なパターンに関連付けられた個別の遺伝子シグネチャーを同定しました。この作品は、このプロセスへの癌細胞の寄与に関して重要な洞察を提供していますが、はるかに少ないトンで貢献臓器特異的因子の役割についてはほとんど知られていません13を研究することは比較的困難なままであった彼の二次微小環境、。
このex vivoでのモデル系は、以前に臓器-CMでその乳癌細胞株固有の移行と成長を実証することによって、二次臓器微小環境の正確な表現として確認された転移性拡散のin vivoでのパターンでこれらの細胞株」を反映しています。チューらによる研究では、in vivoでのリンパ節、肺、肝臓、骨及び脳に転移し、MDA-MB-231および高転移性SUM-159（を含む、 インビボでの転移能を変化させることで四つの異なるヒト乳癌細胞株を用い）とSUM-149およびMDA-MB-468（中程度の転移性、 インビボでのリンパ節および肺への転移）が両方MDA-MB-231およびSUM-159細胞株は、リンパ液を骨髄に向かって高めの移行を表示SUM-149およびMDA-MB-468細胞株を優先的に肺に向かって移行しつつノード - 肺-CM13 -CM。現在の研究では、骨や肺求めてMDA-MB-231の両方が、それぞれ骨髄および肺-CMに移行することを好むの変種ことを実証し、臓器-CMへの曝露は、骨や肺に関連する転移性遺伝子の発現を促進することができます以前Massaguéと同僚11,12によって識別されます。まとめると、これらの結果は、臓器-CMは、乳癌細胞の表現型および動作に影響を与え、生体内で見つかった器官特異的可溶性因子のex vivoプラットフォーム代表を提供することを示しています。
特定の臓器中に存在する可溶性因子および発現のそれらの相対的レベルの同定は、癌細胞の挙動に対するそれらの潜在的な影響を決定するための出発点を提供します。さらに、このような免疫除去のような技術を使用して、ユーザーが効率的にin vitroで細胞の挙動に対する効果を決定するために、臓器CMから目的のタンパク質を枯渇させることができます。例えば、特定の臓器微小環境内に存在する多くの可溶性因子は、化学誘引物質として機能し、細胞遊走および増殖を誘導する可能性を秘めています。肺-CMを使用して行われ、以前の研究は、オステオポンチン（OPN）およびL-セレクチン（SELL）13を含む乳癌細胞に対する化学誘引物質として作用し得る肺-CM中に存在する多数の可溶性因子の同定につながりました。肺-CM、チューらにこれらの要因をimmunodepletingによって低減細胞遊走及び/又は高度に転移性のMDA-MB-231乳癌細胞の増殖13を示すことができました。これらの結果は、馴化培地は、 インビトロでの伝統的な技術の使用を介して、癌細胞の挙動に特異的な可溶性因子の効果を研究するための貴重なリソースを提供し、全体の器官から発生していることを示しています。
これはかなり簡単なモデル系であるが、successfuにとって重要な実験プロトコルでいくつかのステップがあります臓器馴化培地のリットルの生成。まず、臓器の収穫のための6-12週間の定義された歳のマウスの使用は、（6週前）の開発に関連する、または古いマウスの老化に関連するいずれかの年齢関連の影響のために制御するために重要です。第二に、無菌性は、プロトコル全体で最も重要であると最高（すべての培養培地とサプリメントで滅菌組織培養消耗品および試薬ならびに軽度の抗生物質を使用して、無菌組織培養フード内で厳格な無菌操作と作業を使用することにより確保することができますすなわち 、ペニシリン/ストレプトマイシン）。 in vivoまたはex vivoモデル系で使用に関する課題の一つは、固有の動物対動物の変動です。これが認められた場合は、トラブルシューティングの手順は、下流の実験に使用する前に、マウスの複数のバッチから得られた馴化培地のプーリング、ならびにlung-と脳付きのマスコミは、各私の中で正確に重量正規化されることを確実にすることが含まれます1メディア：4で再懸濁することにより直径収集実験組織比（体積/重量）。そうでなければ、彼らは終末分化する、また、主要なリンパ節と骨髄間質細胞は、任意の継代で70％の密集度を超えることは許されるべきではないか、5合計の通路を越えて成長させること。
この記事で紹介したプロトコルへの変更は、研究のさまざまな分野への応用を可能にするために想定することができました。このモデルは、これまでに乳癌研究のためにのみ使用されてきたが、潜在的に他のタイプの癌、ならびに追加の正常な生理学的および疾患状態における器官由来の可溶性因子の役割を研究するために使用することができます。加えて、この方法は、免疫不全のヌードマウスモデルを用いてここで使用されているが、この技術は、理論的には、マウスのこの種に限定されるものではなく、さらには潜在的に、動物モデルの他のタイプと一緒に使用することができます。
このモデルはimportaを提供していますが癌細胞の挙動上の特定の臓器由来の可溶性因子の寄与についての洞察力、それには限界がないわけではないのnt。まず、このモデルはもっぱら細胞外マトリックス（ECM）の重要性を無視した臓器の微小環境の可溶性成分、に焦点を当てています。 ECMは、全ての組織型と関数内の非細胞成分の存在は、細胞のための物理的な足場、ならびに形態形成、細胞分化および恒常性33を含む様々な細胞プロセスに必要な重要な生化学的および生体力学的手がかりを誘導する能力の両方を提供することです-35。重要なことは、ECMの物理的および生化学的組成は、広く不均一であると組織タイプ間で大きく異なります。従って、ECMの組織特異的な組成物は、このモデルに見落とされてもよい癌転移中の臓器向性の影響を有することができます。 ECMはまたappropriatelそのように特定の可溶性因子を集中するように作用することができますyは特定の細胞に提示し、ECMのこの微調整することなく、細胞シグナル伝達の誘導が低下または36に変更することができます。本論文で述べたモデルは、適切なECM成分を欠いているが、多くの研究は、適切なECM成分と一緒に、ここで述べたモデルの両方を利用し、無料のアプローチを使用することによって強化することができました。例えば、内因性のECMまたは組換えECM成分の合成市販の主要な臓器の線維芽細胞は、細胞挙動の全器官の微小環境の完全な範囲を決定するために、生成された臓器-CMに加えて使用することができます。
臓器-CMから発生した水溶性の微小環境が適切に転移の過程の間に生理的に存在するものを模倣していない可能性があります。癌細胞の生存、増殖および進行は、癌細胞-宿主相互作用4,30,31に大きく依存しています。全臓器-CMの生成は、pになることがあり通常、転移性進行の間に癌細胞と相互作用する細胞の種類によって発現されない可溶性因子のresence。また、以前に原発腫瘍の存在は、それによって転移37のためにそれらを「プライミング」、遠隔転移部位の微小環境を調節することができることが実証されています。現在のプロトコルは、健康、非担癌マウス由来の臓器を使用するので、原発性乳房腫瘍を有するマウスからの臓器由来の可溶性因子を比較する価値があるだろう。
、様々な器官-CMの生成時に全器官の機械的分離に、細胞内の要素は、通常、癌細胞によって生理的に遭遇されないことがあり、周囲の培地に放出されてもよいです。さらに、骨およびリンパ節由来の馴化培地は、先立ってコレクションにこれらの器官から単離された間質細胞の培養を必要とします。 ex vivoで cultu中に存在する細胞の種類リングは正確に癌細胞によって生理的に遭遇した携帯型の広さを表していない場合があります。間質細胞は、主に、様々な器官の微小環境に関連する多くの因子を分泌するが、これらの方法を使用して組織および器官38内に存在する他の細胞型の影響を考慮しなくてもよいです。私たちはこれを培養臓器（肺及び脳）および単離されたBMSCとLNSC両方の生存を維持するために必要とされたことがわかったので、最後に、我々は、臓器馴化培地を生成するために使用されるベース媒体におけるマイトジェンサプリメントが含まれていました。しかし、我々は、このマイトジェンサプリメントの存在は、人工的に、彼らが正常に作らないかもしれない可溶性因子を生成するために臓器を刺激している可能性という警告を認識します
要約すると、多くの研究は、特定の器官の微小環境が深く腫瘍細胞生物学に影響を与えることができることを示しています。議論制限があるにもかかわらず、ex vivoでのモデル系は、ここでrは提示しました細胞挙動に多くの固形臓器の可溶性微小環境の影響を研究するための総合的な技術をepresents。著者らの研究室では、このモデル系ではあったと、浸潤、遊走、増殖などの転移に関連する細胞事象の多くを研究する手段として使用され続け幹様挙動、および遺伝子発現の変化。これらの研究から得られたデータは、次に、潜在的な転移部位を表す種々の微小環境への応答を決定するために、患者の腫瘍から単離された原発性乳癌細胞にこのモデル系の潜在的な臨床応用を知らせることができました。まとめると、転移性臓器向性のプロセス中の微小環境と腫瘍細胞との間の相互作用のさらなる理解は、将来的に癌治療の向上につながることが期待されています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
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