Introduction
O câncer de mama é o câncer mais freqüentemente diagnosticado em mulheres ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer 1. alta taxa de mortalidade do câncer de mama é principalmente devido à falha da terapia convencional para reduzir e eliminar a doença metastática; aproximadamente 90% das mortes relacionadas ao câncer é atribuída a metástases 2. A compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes da cascata metastática é fundamental para o desenvolvimento de terapias eficazes, tanto precoce e cancro da mama de fase tardia.
A pesquisa passada ajudou a elucidar a natureza de várias etapas de metástase do câncer de mama e é a hipótese de que o resultado de ambos progressão e metástase do câncer é em grande parte dependente das interações entre células cancerosas e o ambiente host 3. As observações clinicas indicam que muitos cancros mostrar tropismo de órgãos, isto é., A tendência para metastizar preferencialmente a organs.In específica do CASe de cancro da mama, doença de um paciente geralmente se espalha ou metástases para 5 locais principais, incluindo o osso, pulmões, nódulo linfático, fígado, cérebro e 06/04. Muitas teorias têm sido desenvolvidas para explicar esse processo, mas apenas alguns têm resistido ao teste do tempo. A teoria de Ewing de metástase, proposto na década de 1920, a hipótese de thatthe de distribuição de metástase era estritamente devido a fatores mecânicos; pelo qual as células de tumor são realizadas por todo o corpo por padrões de fluxo sanguíneo fisiológico definidos normais e simplesmente prender no primeiro leito capilar encontram 7. Em contraste, a "semente e solo" hipótese de Stephen Paget 1889 sugeriu que as interações moleculares adicionais foram responsáveis pela sobrevivência e crescimento de metástases, através do qual as células cancerosas ( "sementes") só pode estabelecer-se e microambientes órgãos proliferatein que produzem factores moleculares apropriados ( "solo ") 8. Quase um século depois, Leonard Weiss sobtomou uma meta-análise dos dados da autópsia confirmou anteriormente publicados e predição de Ewing que muitos tumores metastáticos detectados na altura da necropsia foram encontrados nas proporções esperadas, que seria de esperar se o tropismo órgão metastática foi determinada por padrões de fluxo sanguíneo sozinho. No entanto, em manyinstances havia menos ou mais metástases formadas em certos locais, então seria de esperar por um projecto de factores mecânicos de Ewing 9. Estas contas e teorias sugerem que microambientes de órgãos específicos desempenham um papel fundamental nos padrões de divulgação e subsequente crescimento e sobrevivência de muitos tipos de câncer, incluindo câncer de mama.
Os esforços de investigação anteriores têm focado principalmente em fatores derivados de células do tumor e sua contribuição para o tropismo órgão observado na metástase do câncer de mama 10-12, fatores no entanto pouca pesquisa tem explorado derivados do microambiente órgão que pode fornecer um nicho favorável para o estabelecimentode metástases de cancro da mama. Esta é em grande parte atribuível aos desafios técnicos de estudar os componentes do microambiente do órgão in vitro.
O presente artigo descreve um sistema abrangente vivo ex modelo para estudar a influência dos componentes solúveis do nó de linfa, osso, pulmão, cérebro e no comportamento metastático de células de cancro da mama humano. Estudos anteriores validaram este sistema de modelo, demonstrando que as linhas celulares de cancro da mama diferentes exibir comportamento maligno específica de órgãos-específico da linha de células e em resposta a meio condicionado de órgãos que corresponde ao seu potencial metastático in vivo 13. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e avaliar os factores solúveis derivados de órgãos específicos que podem desempenhar um papel no comportamento metastático da mama e outros tipos de células cancerosas, incluindo influências sobre o crescimento, a migração, caule-como o comportamento, e a expressão do gene, , bem como a identificação depotenciais novos alvos terapêuticos para o cancro. Este é o primeiro sistema ex vivo modelo que pode ser utilizado para estudar o comportamento metastático específico do órgão em pormenor e para avaliar o papel de factores solúveis derivados de órgãos na condução do processo de metástase do cancro.
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Protocol
Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as recomendações do Canadian Council on Animal Care, no âmbito de protocolos aprovados pelo Uso de Animais Subcomissão Western University.
1. Isolamento de órgãos (pulmão, cérebro, ossos, gânglios linfáticos)
- Prepare quatro tubos de 50 ml estéreis cónicos (um para cada órgão a ser isolado) contendo aproximadamente 30 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Pré-pesam cada tubo de PBS utilizando uma balança eletrônica.
- Eutanásia 6-12 semana rato velho por inalação de CO 2. Os ratos devem ser deixada na câmara de CO 2, durante cerca de 1 - 2 minutos ou até que o rato para de se mover e de respiração. eutanásia bem sucedida pode ser ainda confirmada pela falta de batimentos cardíacos quando verificados manualmente com um dedo. Evite deslocamento cervical como este método pode romper vasos sanguíneos do pescoço levando a dificuldade em retirar os gânglios linfáticos axilares.
Nota: Os trabalhos anteriores usado especificamenteratinhos nus femininos saudáveis, Hsd: atímicos Nude- Foxn1 nu 13. - Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, coloque o mouse sobre as suas costas em uma almofada de espuma de poliestireno, espalhar os membros e usar pinos para mantê-los no lugar.
- Utilizando uma pinça e tesouras estéreis, cortar a pele abdominal na linha média na genitália e cortar para cima em direção à boca. Gentilmente puxar para trás a pele abdominal dos músculos abdominais e pinos no local no bloco de espuma de poliestireno.
- Localize a axilar, braquial, e linfonodos inguinais.
Nota: Os linfonodos são geralmente rodeado por tecido adiposo. Os nódulos linfáticos inguinais são os mais fáceis de localizar como eles são encontrados superficialmente na junção de dois vasos sanguíneos na pele abdominal puxado para trás. Axilares e linfáticos braquial nós estão localizados mais profundamente no tecido e exigem manobras suave de tecido.- Depois de ter localizado os gânglios linfáticos, use a tesoura para cortar suavemente e com cuidado a linfa nãodes longe da pele, a gordura e os vasos e removê-los do rato. Para confirmar dissecção adequada, rolar a pinça sobre o tecido removido. Se um nódulo duro existe quando rolar a pinça sobre o tecido, em seguida, um nó de linfa tem provavelmente foi removido com sucesso.
- Coloque linfonodos removidos em PBS gelado.
- Usando os fórceps e tesouras, abrir a cavidade abdominal, cortando através da parede abdominal exposta em um movimento ascendente em direcção ao peito. Cuidadosamente cortar o esterno, expondo a cavidade torácica.
- Localize o diafragma abaixo dos pulmões e corte do diafragma. Ele deve puxar para as costelas devido à tensão.
- Levante os pulmões de baixo e cortar o tecido subjacente para a traqueia. Isto permite que os pulmões para ser removida livremente a partir da cavidade torácica. Retire o coração e os pulmões em bloco e coloque em PBS gelado. O coração pode ser removido dos pulmões aqui ou apenas antes da pesagem no Passo 2.
- Remova opinos, mantendo o mouse no lugar sobre a almofada de espuma de poliestireno. Vire o mouse e cortar a pele da parte inferior das costas todo o caminho através de flanco para flanco.
- Usando um pedaço estéril de gaze para manter o torso do mouse, tirar a pele de trás do mouse sobre as pernas e os pés do mouse.
- Usando o mesmo pedaço de gaze estéril, segure a perna no lugar, cuidadosamente quebrar a articulação do tornozelo do pé mouse e descascar a pele sobre a articulação proximal para a articulação do joelho.
- Com uma tesoura, retire a tíbia livre da articulação do joelho e coloque em PBS gelado.
- Repita os passos de 1,11) a 1,12) com o membro oposto.
- Utilizando uma pinça, segure o fêmur no lugar, cortar o tecido circundante muscular usando a tesoura e remova o fêmur, colocando-o em PBS gelado.
- Repita o passo 1.14) com o membro oposto.
- Usando um novo pedaço de gaze estéril, segure a cabeça do rato no lugar. Utilizando uma pinça e tesouras, remover suavemente a pele para expor as skull. Com uma tesoura, corte cuidadosamente o crânio occipital do centro da parte superior em uma linha reta e para baixo para expor o cérebro posterior.
- Usando fórceps, escavar por debaixo do cérebro para o anterior e remover todo o cérebro. Coloque o cérebro em PBS gelado.
- Repita os passos 1.1) a 1,17) durante pelo menos quatro ratos.
2. Órgão Pesando
- A seguir ao isolamento de órgãos, pesam cada tubo PBS contendo pulmão e tecido do cérebro utilizando uma balança electrónica.
- Calcula-se a diferença de peso, subtraindo o peso pré-isolamento (apenas PBS) a partir do peso do tubo de PBS + órgãos (pulmão e cérebro).
- Determinar a quantidade de meios necessários para ressuspender os fragmentos de tecido a partir da diferença de peso calculado.
Nota: de pulmão e tecido cerebral são em peso normalizada, por re-suspensão em uma mistura 4: 1 de meios: proporção tecido (vol / peso).
3. Geração de Mídia Lung- e cérebro-condicionado
- Num t estérilemissão cultura capô, inverter tubos PBS contendo pulmão ou cérebro três vezes para remover o sangue residual de órgãos e aspirado PBS contendo sangue. Repita com PBS frio fresco até que a solução aparece clara, sem evidência de sangue.
- Coloque pulmões e cérebros em separado 60 milímetros 2 pratos de petri de vidro. Usando duas lâminas de bisturi estéril, pulmões moer ou cérebros por várias vezes cortar e para trás até fragmentos de tecido são aproximadamente ~ 1 mm3 de tamanho.
- Ressuspender fragmentos de tecido num volume apropriado (previamente determinado no passo 2.3) de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): F12 suplementado com suplemento concentrada 1x penicilina e mitogénio (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml).
- Adicionar fragmentos pulmonares ou tecido cerebral ressuspensos para um poço de uma placa de 6 poços.
- Incubar fragmentos de tecidos em meio, durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Após a incubação, recolher meios condicionados para cada tecido e fUTRAS diluir pela adição de três volumes equivalentes de meio fresco em um tubo de 50 ml.
- Centrifugar a 1.000 xg em meios condicionados diluídos para cada órgão a 4 ° C durante 15 min para remover grandes restos de tecido. Recolher o sobrenadante de mídia e filtrar através de um filtro de seringa de 0,22 mM.
- Piscina meios condicionados de cada órgão (ie., Pulmão com pulmão e cérebro com cérebro) a partir de vários ratos para explicar a variabilidade do mouse-a-mouse. Alíquotas e armazenamento de meios condicionados à temperatura de -80 ° C até à sua utilização.
4. geração de mídia de Medula Óssea condicionado
- Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, aparar o excesso de tecido do osso e remover epífises (peças finais) dos ossos com uma tesoura.
- Usando uma agulha G 27 ½, cavidade medular dos ossos descarga, empurrando 1 ml de PBS através do centro de cada osso. Isso permitirá que você para coletar células do estroma da medula óssea (BMSC) para um tubo fresco contendo PBS.
- Centrifugar a 1,000 xg durante 5 min a 4 ° C e lava-se duas vezes com PBS BMSC. Ressuspender as células do estroma da medula óssea em 20 ml de meio de crescimento de células de estroma ósseo (DMEM: F12 suplementado com 1x concentrada mitogénio suplemento, penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml) e 10% de soro Boven fetal (FBS) ).
- Placa 10 ml de células estromais de medula óssea ressuspensas em um frasco T75.
Nota: Combine e células da placa de cada 2 ratos em cada frasco T75; por quatro camundongos, dois frascos T75 são necessários (cerca de 1 x 10 7 células / frasco). - Incubar as células do estroma da medula óssea em meio de crescimento de células de estroma ósseo durante 24 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Após a incubação, remover a mídia de ambos os frascos T75 e colocar em novo frasco T75, rotular este frasco como "Floater Flask". Adicionar meio fresco de crescimento de células de estroma ósseo para frascos anteriores 2 e incuba-se todos os frascos de 3 a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Depois de células atingirem aproximadamente 70% de confluência (aproximadamente 5-7dias), as células de passagem. Para fazer isso, remover o meio e lavar as células duas vezes com PBS (3 mL cada lavagem). Remover PBS e adicionar 3 ml de solução de tripsina / EDTA, assegurando que a tripsina cobre toda a superfície do frasco. Depois de células retire o frasco (~ 2-3 min), pare tripsinização reacção por adição de 3 ml de osso meio de crescimento de células do estroma). Centrifugar 900 xg durante 5 min a 4 ° C, descartar meios de comunicação, e ressuspender as células em 10 ml de meio fresco de crescimento de células de estroma ósseo.
- Células de associação de todos os frascos e a passagem 1: 5 em três novos frascos T75 e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. Depois de as células mais uma vez chegar a 70%, repita o passo 4.6 e piscina e de passagem todas as células aderentes uma segunda vez. Re-placa de todas as células para frascos T75 e quatro incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. meios de crescimento celular de estroma ósseo deve ser utilizado para todos os passos.
- F12 + 1x mitogen concentrada su: permitir que as células para alcançar a confluência, lavar as células três vezes com PBS e adicionar estromal meios de recolha de células ósseas (DMEMpplement + penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml); 10 ml / T75), certificando-se que esta mídia é livre de FBS. Recolha de meio condicionado de medula óssea de 72 horas mais tarde, filtra-se através de um filtro de 0,22 um, piscina, alíquota, e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
- Se desejado, confirmar o fenótipo das células do estroma da medula óssea (BMSC) isolados utilizando anticorpos contra a Sca-1 de rato, CD105, CD29, e CD73, CD44, utilizando técnicas de citometria de fluxo padrão como descrito anteriormente 13.
5. geração de mídia Linfonodo condicionado
- Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, inverter tubo PBS contendo nódulos linfáticos três vezes para remover o sangue residual de nódulos linfáticos e aspirado sangrenta PBS. Repita com PBS frio fresco até que a solução aparece clara, sem evidência de sangue.
- Coloque os gânglios linfáticos em placas de Petri de 60 mm2 de vidro. Usando duas lâminas de bisturi estéril, gânglios linfáticos picada por várias vezes cortar e para trás até tissue fragmentos são aproximadamente 1 mm 3 de tamanho.
- Num tubo de cónico, fragmentos de tecido ressuspender em 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) meio suplementado com penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml), 5 x 10 -5 M estéril β-mercaptoetanol ( 1,75 ul / 500 ml de meio) e 10% de FBS.
- Centrifuga-se a 900 xg durante 5 min a 4 ° C e colocar todas as células em 30 ml de meio. Adicionar 5 ml de meio / poço numa placa de 6 poços e incubar durante 7 dias a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Após a 7 dias de incubação, descartar meios, lavar as células aderentes com 5 ml de PBS morno e adicione 5 ml de meio fresco a cada poço. Permitir que as células crescer até à confluência (aproximadamente 5 - 7 dias), trypsinize, reunir todas as células, e passagem tal como descrito no passo 4.6. células re-placa para placa de 6 poços. Repita este passo três vezes.
- Depois de três passagens, permitir que as células crescer até à confluência, lavar os poços três vezes com PBS e adicionar 2 ml / poço de DMEM: F12 + 1xsuplemento concentrado mitogénio e penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / mL), assegurando que este suporte é livre de FBS. Recolha meios condicionados-linfonodos após 72 horas, piscina, alíquota, e armazenar a -80 ° C até o uso.
- Se desejado, confirmar o fenótipo das células dos nodos linfáticos do estroma isoladas (LNSC) utilizando anticorpos contra CD45 e gp38 de rato, utilizando técnicas de citometria de fluxo padrão como descrito anteriormente 13.
6. Uso de Mídia Organ-condicionado para ensaios a jusante relacionadas com o comportamento metastático das células cancerosas
- Uma vez que os meios condicionados por órgão foi gerada tal como descrito nos passos 1 - 5, utilizá-lo para levar a cabo a jusante da célula diferente e ensaios de biologia molecular, a fim de determinar a influência de factores derivada de órgãos solúveis sobre o comportamento metastático de células cancerosas. Exemplos de ensaios normalizados descritos noutro local (na literatura) incluem matrizes de proteína 13, ensaios de crescimento celular <sup> 13, a migração celular Ensaios 13, tumorsphere formação 14, e RT-PCR 15. Os meios de base original utilizado para gerar o meio condicionado de órgão (ou seja, não condicionado DMEM:. Meio F12 suplementado com 1x concentrada suplemento mitogénio e penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml) deve ser usado como um controlo negativo .
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Representative Results
Geração de mídia com ar-Organ
Um diagrama / esquemática descrição geral do processo de isolamento de órgãos e geração de meios condicionados é apresentado na Figura 1, com imagens fotográficas representativos do processo mostrado na Figura 2. Deve notar-se que, quando este protocolo foi a primeira fase de desenvolvimento, fígado foi incluído em nossa análise, porque é um local comum de metástase do câncer de mama. No entanto, por causa da grande quantidade de proteases produzidas e segregadas pelo fígado, é muito difícil manter o fígado viável tempo suficiente para gerar o meio condicionado de boa qualidade. meio condicionado de fígado também não é estável, uma vez isolado, e tende a haver uma grande quantidade de precipitado de proteína, provavelmente, pela mesma razão. Portanto fígado não foi incluído em qualquer outra análise.
(Figura 3A) e BMSC demonstrando um aspecto menor (Figura 3C). A análise de citometria de fluxo confirma que são em grande parte LNSCs CD45 - e gp38 +, com ~ 60% de células que possuem um CD45 - + gp38 fenótipo indicativo de LNSCs 16 (Figura 3B). As BMSC deve ser positivo para CD44 e CD29, fracamente positiva para CD105 e Sca-1, e negativa para CD73 (Figura 3D - H), indicativo de BMSC 17,18.
Celular do cancro da mama Response para Padrões de Migração e Alterações Gene Expression órgão apropriado
Utilizando este sistema modelo ex vivo, foi previamente demonstrado que as células de cancro da mama humano, com diferentes antecedentes genéticos migração exposição diferencial e padrão de crescimento em função das condições específicas de órgãos. Notavelmente, estes padrões refletem os padrões conhecidos disseminação metastática de estas linhas celulares in vivo 13. No estudo atual, osso (231-BOM) - e pulmão (231-LM2) -seeking variantes das variantes de células de câncer de mama humano MDA-MB-231 (a simpática oferta do Dr. Joan Massagué 11,12) também têm sido utilizado num ensaio de migração Transwell para confirmar os padrões de migração de órgãos-apropriada. Os resultados demonstram que a variante 231-BOM-buscando óssea migram preferencialmente para o meio condicionado de medula óssea sobre cerebral e lung- meio condicionado (figura 4A, esquerda). similarmente, A variante 231-LM2 em busca de pulmão migra preferencialmente aos meios condicionados-pulmonar ao longo do osso meios condicionados de medula e meios condicionados do cérebro (Figura 4A, à direita). Além disso, a análise de RT-qPCR demonstra que a exposição de-231 MDA-MB células de cancro da mama para parentais de ossos ou meios condicionados-pulmonar causa uma regulação positiva de genes associados com a metástase específica do osso (CXCR4, IL-11, TGFß1) ou lung- metástase específica (VCAM-1) de células de cancro da mama in vivo 11,12 (Figura 4B). Estes resultados demonstram a eficácia do sistema ex vivo com relação ao tropismo órgão esperada de células de cancro da mama in vivo, e indica que os factores solúveis presentes no meio condicionado de órgãos pode influenciar o fenótipo de células metastáticas em adição a promover a migração.
Mídia condicionado órgão Contém potenciais solúveis Mediadores de comportamento metastático
Uma matriz de anticorpo de rato com base em marcador de biotina foi utilizado para avaliar a presença e identidade de factores solúveis comuns em meios condicionados de órgãos de diferentes órgãos. Esta matriz inclui anticorpos contra 308 do array de proteínas solúveis proteins.This rato mais comum anteriormente tem sido utilizado para identificar factores solúveis de interesse associada com a cascata metastática presente dentro dos meios condicionados de medula óssea e pulmonares tal como mostrado na Chu et ai (2014) e Pio et al (2015), respectivamente 13,14. No presente estudo, os resultados são mostrados array de proteínas por meio basal (Figura 5A) em comparação com linfa Nó- (Figura 5B) e meio condicionado do cérebro (Figura 5C). Destaque ao lado de cada matriz são factores solúveis presentes nos meios de comunicação que se verificou estar associada com passos na cascata metastática na literatura 19-29. Estes fac solúveltores podem valer a pena investigar como potenciais mediadores de metástases secundárias dentro desses sites de órgãos.
Figura 1. Visão geral esquemática do processo de isolamento de órgãos e Geração de meio condicionado. Tecidos (pulmões, cérebro, fêmur, tíbia e linfonodos) são colhidas a partir do mouse. Pulmões, nódulos linfáticos e cérebro são picados com um bisturi. A medula óssea é colhida a partir da cavidade medular dos ossos, empurrando PBS através da cavidade com uma agulha 27½ L. Tecido pulmonar e cerebral fragmentos são incubadas por um período de 24 horas antes de se diluir com três volumes equivalentes de meio basal fresco e recolhidas para fazer meios lung- e ar-cérebro. A medula óssea e células de nódulos linfáticos de estroma são passadas 2 - 3 vezes antes da incubação com meio basal para fazer meios condicionados de nó ósseas e linfáticos. media colhidas pode ser pooled e armazenadas a -80 ° C até que esteja pronto para uso em ensaios a jusante tais como matrizes de proteína, ensaios de crescimento celular, ensaios de migração celular, tumorsphere formação e RT-PCR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens fotográficas representativas do Procedimento de Isolamento de órgãos e Geração de meio condicionado. No dia 0, os pulmões, cérebro, fêmur, tíbia e linfonodos são recolhidos a partir do mouse. Os nós pulmões, cérebro e linfáticos são colocados numa placa de petri de vidro de 60 mm2 e triturada com duas lâminas de bisturi de aproximadamente 1 mm 3 de tamanho. A medula óssea é colhida a partir da cavidade medular dos ossos, empurrando PBS através da cavidade com uma agulha de 27 G ½ para um tubo frescode PBS. O pulmão e cérebro fragmentos de tecido são incubados durante um período de 24 h a 37 ° C e 5% de CO2 antes de se diluir com três volumes equivalentes de meio fresco e recolhidas para fazer meios lung- e ar-cérebro após 24 h. As células da medula óssea e do estroma de nódulos linfáticos, incubou-se a 37 ° C e 5% de CO 2 e passadas 2 - 3 vezes (~ 3 semanas no total) antes de substituir meios com meio basal isento de soro para fazer meios condicionados-nó do osso e da linfa. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. caracterização de células de linfonodo e medula óssea do estroma isoladas. Imagem de microscopia de campo brilhante mostrando a morfologia de células de nódulos linfáticos do estroma (LNSCs) (A). (B) de fluxo representativasA análise por citometria de LNSCs usando um ficoeritrina (PE) -conjugated anticorpo gp38 e um isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo CD45. imagem microscopia de campo brilhante mostrando a morfologia das células do estroma da medula óssea (BMSC) (C). (DH) de fluxo representativas a análise por citometria de BMSC usando o modo (perfis preto) conjugado com PE anticorpos contra o (D) CD44, (E) CD106, (F), Sca-1, anticorpos CD73 (L) CD29, (H) em relação ao controlo de isotipo (perfis brancos). Um mínimo de 10.000 eventos viáveis foram recolhidos por amostra. Este valor foi modificado a partir de 13 anos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Ougan-apropriada Padrões de Migração e Alterações Expressão Gênica em resposta a mídia Organ-condicionado. (A) Bone-buscando 231-Bom variantes (esquerda, bares distribuídos) ou variantes de procura de pulmão 231-LM2 (direita, barras listradas) da-231 MDA-MB linha de células de cancro da mama humano, bem como dos pais MDA-MB- 231 (ambos os painéis, barras a cheio) foram plaqueadas em pastilhas revestidas de gelatina (com poros de 8 um) antes da colocação no meio basal (DMEM: F12 + suplemento mitogénio concentrada) ou de órgãos-CM. As placas foram incubadas a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 18 hr. (B), as células MDA-MB-231 parentais conjunto da população, foram expostas quer osso-CM (esquerda) ou pulmão-CM (direita) durante 48 h. O ARN foi isolado e quantificado utilizando RT-qPCR. Mudanças de expressão gênica em resposta ao órgão-CM (barras pretas) foram normalizados para GAPDH e expressas em relação à expressão de base em mídia basal (barras cinza). Os dados são apresentados como média ± EPM (N = 3; dobrá-mudança do respectivo controle negativo de media basal). * = Significativamente diferente de meio basal; δ = significativamente diferente a partir da linha celular parental tratada com as mesmas condições de meios; P <0,05, ANOVA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Mídia Figura 5. Órgão condicionado Contém potenciais solúveis Mediadores de comportamento metastático. Uma matriz de anticorpo de rato com base rótulo biotina foi utilizado para identificar fatores solúveis presentes no linfonodo-CM e cérebro-CM. As membranas foram incubadas com amostras biotiniladas de (A) meio basal (DMEM: F12 + suplemento mitogen concentrado), (B) linfonodo-CM ou (C) brain-CM a 4 o CO / N e visualizados usando chemiluminescence. Ovais azuis indicam controlos positivos internos, caixas forradas indicam controles negativos internos e caixas sólidas indicam fatores solúveis de interesse que estão potencialmente envolvidos no comportamento metastático de células de câncer de mama para o linfonodo ou do cérebro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A metástase é um processo complexo pelo qual uma série de eventos celulares são responsáveis por invasão de tecido e tumor distante estabelecimento 4,30,31. O sistema modelo ex vivo aqui apresentada pode ser utilizada para estudar dois aspectos importantes da progressão metastático: homing célula de cancro ou de migração de um órgão específico ( "chegar") e o crescimento neste órgão ( "crescendo lá"). Muitos estudos têm focado anteriormente na identificação de características moleculares chave associados com as células cancerosas-se que contribuem para o processo de metástase. Por exemplo, o trabalho feito pelo grupo de Joan Massagué identificou assinaturas genéticas distintas associadas a-lung específica, específica do osso, e os padrões específicos do cérebro de propagação 10-12,32. Embora este trabalho fornece insights importantes no que diz respeito à contribuição de células cancerosas para este processo, muito menos se sabe sobre o papel dos factores específicos de órgãos contribuído por tele microambiente secundário, que manteve-se relativamente difícil de estudar 13.
Este sistema modelo ex vivo foi anteriormente validada como uma representação precisa do microambiente órgão secundário através da demonstração de que a migração específica de linha de células do cancro da mama e no crescimento de órgãos-CM espelha estas linhas celulares 'no padrão in vivo de disseminação metastática. Um estudo realizado por Chu e colegas utilizaram-se quatro linhas celulares de cancro da mama humano diferentes com vários potencial metastático in vivo, incluindo células MDA-MB-231 e SUM-159 (altamente metastático, metástase de nódulo linfático, pulmão, fígado, ossos e cérebro in vivo ) e a migração SUM-149 e MDA-MB-468 (moderadamente metastático, metastizar para o nó de linfa e pulmão in vivo) em. Ambas a soma-159 linhas celulares MDA-MB-231 e exibidos reforçada em relação marrow- osso, linfa Nó- e pulmão-CM, enquanto as linhas celulares SUM-149 e MDA-MB-468, preferencialmente, migraram para pulmão-CM 13. O presente estudo demonstra que de ossos e de procura de pulmão MDA-MB-231 duas variantes, preferem migrar para marrow- osso e pulmão-CM, respectivamente, e que a exposição ao órgão-CM pode promover a expressão de genes de ossos e metastáticos pulmonares associadas- anteriormente identificada por Massagué e colegas 11,12. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que CM-órgão fornece um representante ex vivo plataforma de factores solúveis específicas de órgãos encontrados in vivo que influenciam o fenótipo e o comportamento de células de cancro da mama.
Identificação de fatores solúveis presentes dentro de órgãos específicos e os seus níveis relativos de expressão fornece um ponto de partida para determinar sua potencial influência sobre o comportamento da célula cancerosa. Além disso, usando técnicas tais como imunodepleção pode permitir que o utilizador esgotar eficazmente uma proteína de interesse a partir de órgão-CM para determinar o seu efeito sobre o comportamento celular in vitro. Por exemplo, Diversos factores solúveis presentes no microambiente de órgãos específicos funcionar como quimioatractores e têm o potencial para induzir a migração e a proliferação celular. Trabalho anterior feito utilizando-pulmão CM levou à identificação de diversos factores solúveis presentes no pulmão-CM que podem actuar como agentes quimioatractivos para células de cancro da mama, incluindo osteopontina (OPN) e L-selectina (Sell) 13. Por immunodepleting estes factores a partir de pulmão de CM, Chu e colegas conseguiram demonstrar a migração e / ou crescimento de células MDA-MB-231 de cancro da mama altamente células metastáticas 13 celular reduzida. Estes resultados mostram que a partir de meios condicionados gerado órgãos inteiros fornece um recurso valioso para estudar os efeitos de factores solúveis específicas sobre o comportamento de células de cancro, através da utilização de técnicas tradicionais in vitro.
Embora este seja um sistema modelo bastante simples, existem alguns passos no protocolo experimental que são críticas para successful geração de meios condicionados de órgãos. Em primeiro lugar, o uso de ratos entre as idades definidas de 6-12 semanas para a colheita de órgãos é importante, a fim de controlar os efeitos relacionados com a idade, ou relacionados ao desenvolvimento (antes de 6 semanas) ou relacionadas com o envelhecimento em ratos mais velhos. Em segundo lugar, a esterilidade é de extrema importância ao longo do protocolo e pode ser melhor assegurada através da utilização de uma técnica asséptica rigorosa e trabalhar em uma capa de cultura de tecidos estéreis, utilizando consumíveis esterilizados de cultura de tecidos e reagentes, bem como antibióticos suaves em todos os meios de cultura e suplementos ( isto é., penicilina / estreptomicina). Um dos desafios com a utilização in vivo ou ex vivo sistemas modelo é a inerente variabilidade de animal para animal. Se este observado, solução de problemas etapas incluirão a centralização de meios condicionados obtidos a partir de vários lotes de ratos antes do uso em experimentos a jusante, bem como assegurar que os meios de comunicação lung- e ar-cerebrais são com precisão o peso normalizada em cada meexperimento recolha diâmetro por ressuspensão em uma mistura 4: 1 de meios: rácio de tecidos (volume / peso). Além disso, as células do estroma de nódulos linfáticos primários e de medula óssea não devem ser autorizados a ultrapassar os 70% de confluência em qualquer passagem ou ser cultivadas mais de 5 passagens no total, caso contrário, eles vão diferenciar terminal.
Modificações para o protocolo apresentado neste artigo poderia ser imaginado para permitir a aplicação a diferentes campos de pesquisa. Embora este modelo até agora tem sido utilizado exclusivamente para a investigação do cancro da mama, ele pode potencialmente ser usado para estudar o papel dos fatores solúveis derivadas de órgãos em outros tipos de cancro, bem como estados fisiológicos e doenças normais adicionais. Além disso, embora este método tem sido utilizado aqui com os modelos de ratinho nu imunocomprometidos, esta técnica é, teoricamente, não se limitando a esta espécie de ratos e até poderia potencialmente ser usada com outros tipos de modelos animais.
Embora este modelo fornece important percepção quanto à contribuição de fatores solúveis específicos derivados do órgão sobre o comportamento de células de câncer, não é sem suas limitações. Em primeiro lugar este modelo concentra-se apenas sobre o componente solúvel de microambientes de órgãos, que omite a importância da matriz extracelular (ECM). A ECM é o componente não-celular presente em todos os tipos e as funções dos tecidos para fornecer uma estrutura de suporte físico para células, bem como a capacidade de induzir sinais bioquímicos e biomecânicos crucial necessária para vários processos celulares, incluindo a morfogénese, diferenciação celular e homeostase 33 -35. É importante ressaltar que a composição física e bioquímica da ECM é amplamente heterogênea e pode variar muito entre os tipos de tecidos. Portanto, a composição específica do tecido da ECM podem também ter uma influência sobre o tropismo do órgão durante a metástase do cancro que pode ser negligenciada com este modelo. O ECM podem também actuar para concentrar factores solúveis específicas de uma forma que appropriately apresenta-os para certas células, e sem este ajuste fino do ECM, a indução de sinalização celular podem ser diminuídos ou alterados 36. Embora o modelo mencionado neste artigo não tem um componente ECM disso, muitos estudos poderia ser reforçada através de uma abordagem de cortesia utilizando tanto o modelo mencionado aqui, juntamente com um componente ECM adequado. Por exemplo, disponíveis comercialmente fibroblastos primários de órgãos que sintetizam ECM endógena ou componentes da matriz extracelular recombinante pode ser usado em adição ao órgão gerado-CM para determinar a extensão total de todo o microambiente órgão no comportamento celular.
É possível que o microambiente solúvel gerado a partir de órgão-CM não podem mimetizar adequadamente o que está presente fisiologicamente durante o processo de metástase. Cancer célula de sobrevivência, crescimento e progressão são altamente dependente das interações câncer de células-hospedeiro 4,30,31. Geração de toda órgão-MC pode resultar no pRESENÇA de factores solúveis que não são normalmente expressos por tipos de células que interagem com as células cancerosas durante a progressão metastático. Além disso, foi previamente demonstrado que a presença de um tumor primário pode modular o microambiente das metástases distantes, desse modo, "priming"-los para a metástase 37. Como o protocolo atual usa órgãos derivados de ratinhos portadores de tumor saudáveis, não, seria interessante comparar os fatores solúveis, derivadas de órgãos de ratos portadores de um tumor primário de mama.
Devido à separação mecânica de órgãos inteiros durante a geração de uma variedade de órgãos-CM, factores intracelulares podem ser libertados para o meio circundante, que normalmente não podem ser encontradas f isiologicamente por células cancerosas. Além disso, de ossos e linfonodos derivado meios condicionados exige a cultura de células do estroma isoladas a partir destes órgãos antes da sua coleção. Os tipos de células presentes durante ex vivo cultuanel pode não representar com precisão a amplitude de tipos celulares encontrados fisiologicamente por células cancerosas. Enquanto as células estromais segregam principalmente muitos factores associados com diferentes microambientes de órgãos, usando estes métodos podem não ter em conta a influência de outros tipos de células presentes nos tecidos e órgãos 38. Finalmente, incluímos um suplemento mitogen nos meios de comunicação de base utilizados para gerar meios condicionados de órgãos, porque achamos que isso foi necessário para manter a viabilidade de ambos os órgãos em cultura (pulmão e cérebro) ea BMSC isolada e LNSC. No entanto, reconhecemos a ressalva de que a presença deste suplemento mitogen poderia ter estimulado os órgãos para produzir artificialmente fatores solúveis que não pode normalmente faz,
Em resumo, muitos estudos indicam que o microambiente de órgãos específicos pode influenciar profundamente a biologia de células tumorais. Apesar das limitações discutidas, o ex vivo sistema modelo apresentado aqui represents uma técnica abrangente para estudar a influência do microambiente solúvel de muitos órgãos sólidos sobre o comportamento celular. No laboratório dos autores, este sistema de modelo tem sido e continua a ser usado como um meio de estudar muitos dos eventos celulares associados com a metástase, incluindo invasão, migração, proliferação, comportamento haste-semelhantes, e as alterações de expressão de genes. Os dados obtidos a partir destes estudos poderiam, por sua vez informa o potencial de aplicação clínica deste sistema modelo para células primárias de câncer de mama isoladas de tumores de pacientes, a fim de determinar a sua resposta a vários microambientes que representam sítios metastáticos potenciais. Tomados em conjunto, espera-se que uma maior compreensão da interacção entre as células do microambiente do tumor e durante o processo de tropismo órgão metastático conduzirá a melhoria do tratamento do cancro no futuro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
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