Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Аденовируса генной терапии для больных сахарным диабетом Кератопатия: Влияние на заживление ран и стволовых клеток маркера выражение в человеческих органов культивируемых роговиц и лимбальных эпителиальных клеток

Published: April 7, 2016 doi: 10.3791/54058
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

Цель этого протокола заключается в описании молекулярных изменений в диабетических роговиц человека и показать, как они могут быть облегчены с помощью аденовирусной генной терапии в органе культивируют роговиц. Диабетическая заболевания роговицы является осложнение диабета с частыми аномалиями нервов роговицы и эпителиальной заживления раны. Мы также зарегистрировали значительно измененную экспрессию нескольких предполагаемых маркеров эпителиальных стволовых клеток при диабете роговиц человека. Чтобы облегчить эти изменения, аденовирусной генной терапии была успешно осуществлена ​​с использованием повышающую регуляцию с-встретил протоонкогена экспрессии и / или понижающей регуляции протеиназы матрицы металлопротеиназы-10 (ММР-10) и катепсина F. Эта терапия ускоренного заживления ран у больных сахарным диабетом роговиц даже тогда, когда только лимбальных стволовых клеток отсек трансдуцированная. Наилучшие результаты были получены при комбинированном лечении. Для возможной трансплантации пациентов нормированных стволовых клеток, пример также представлен в ОПТИМИЗАЦИЯна трансдукции гена в клеточных культурах, обогащенной стволовыми использованием поликатионные усилителями. Такой подход может быть полезен не только для выбранных генов, но и для других медиаторов эпителия роговицы заживления ран и стволовых клеток функцию.

Introduction

Диабетическая заболевания роговицы в основном приводит к дегенеративным эпителиальные (кератопатии) и нервов (невропатия) изменений. Она часто проявляется аномалии эпителиального заживления ран и уменьшения рогового нерва 1-4. По оценкам , 60-70% больных диабетом имеют различные проблемы роговицы 1,3. Проведенные нами исследования выявили несколько белков - маркеров с измененной экспрессии в диабетических роговиц человека , включая понижающей с-мет прото-онкогенов (рецептор фактора роста гепатоцитов) и повышающей регуляцией матриксных металлопротеиназ-10 (ММР-10) и катепсина F 5, 6. Мы также зафиксировали значительное снижение экспрессии нескольких предполагаемых маркеров эпителиальных стволовых клеток в диабетической роговиц человека.

В предыдущих исследованиях мы разработали на основе аденовирусов генной терапии для нормализации уровней маркеров диабета изменены с помощью диабетической роговице системы органной культуры человека, которая показывает медленное заживление ран, диабетическуюИзменения маркера, и стволовых снижение экспрессии клеточного маркера , похожий на роговицу бывших естественных условиях 7,8. Это сохранение изменений , как представляется, из - за существования эпигенетической памяти метаболического 9. Эта система культуры использовали далее для генной терапии. Цели для этой терапии были выбраны из маркеров либо с пониженной экспрессией в диабетических роговиц (с-мет протоонкогена), или повышенная экспрессия (MMP-10 и катепсин F).

Аденовирусная (AV) терапия была использована в целом органных культивируют роговиц или корнеосклеральный периферической лимбальных только купе. Это отделение таит эпителиальные стволовые клетки , которые возобновить эпителий роговицы и активно участвовать в ранозаживляющих 4,10-15. Здесь протоколы предназначены для нормальной и диабетического человека роговичного органной культуры, эпителиальные заживление ран, выделение и характеристики клеток, обогащенных культур стволовых клеток лимбальных и аденовирусной трансдукции клетки и роговичного. нашРезультаты показывают целесообразность этой терапии для нормализации экспрессии маркеров и заживление ран у больных сахарным диабетом роговиц для возможной трансплантации в будущем. Они также предполагают , что комбинированная терапия является наиболее эффективным способом восстановить нормальную структуру маркера и эпителиальной исцеление в диабетической роговицы 16-18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Национальный исследовательский болезнь Interchange (NDRI, Филадельфия, штат Пенсильвания), подаваемая соглашался посмертных здоровых и диабетических человеческих глаз и роговицу. Протокол Ndri в человеческой коллекции тканей утверждается управленческую комитетом и при условии соблюдения Национальных институтов здравоохранения надзора. Это исследование было проведено в соответствии с утвержденным Советом по Cedars-Sinai Medical Center Institutional (IRB) освобождены протокола EX-1055. Сотрудничая хирурги роговицы, DRS. E. Maguen и Y. Рабинович, поставляемый выбросьте корнеосклеральный ободов для выделения стволовых клеток, обогащенных роговицы эпителиальных культур. Это исследование было проведено в соответствии с утвержденным протоколом IRB Pro00019393.

1. Человеческий Роговичная Орган культуры

Примечание: Нормальные и диабетические роговица или целые глаза получены в охлажденном среде хранения роговицы (например, Optisol GS) в течение 48 часов после смерти от национального поставщика Ndri.

  1. Удалите роговиц из контейнера для хранения с пинцетом и мыть их дважды яп антибиотик-противогрибковое (ABAM) смесь. В случае целых глаз, вырезать роговицу из глобусов с изогнутыми ножницами. Оставьте по крайней мере, на 5 мм конъюнктивы обода, а также мыть роговиц в ABAM.
  2. Приготовьте смесь, которая будет помещена в роговице вогнутости. Он состоит из не содержащей сыворотки минимальной необходимой среде (MEM), содержащей ABAM, 1 мг / мл телячьей кожи коллагена (из исходного раствора 10 мг / мл в 0,1 N уксусной кислоте), 1% агар, и инсулин-трансферрин-селенит дополнение 7.
  3. Микроволновая эту смесь до кипения для стерилизации и агар растворения. Это может занять до 1 мин для все для растворения. Оставьте крышку трубки частично открытым, так как смесь переливается легко, когда она закипит. По этой причине некоторые кипящие циклы могут быть необходимы, каждый в течение 10-15 сек. Охладить смесь до 37-39 ° С.
  4. Поместите роговиц эпителиальной стороной вниз в стерильные 60 мм блюд. Заполните роговичный вогнутость с приблизительно 0,5 мл смеси, описанной в разделе 1.2.смесь затвердевает на роговицу в течение 2 мин.
  5. Поместите роговиц агар стороной вниз в стерильные 60-мм чашки и добавьте полную среду , содержащую MEM с ABAM, и инсулин-трансферрин-селенит добавка 7 (37 ° С) , чтобы держать его уровень приблизительно у лимба для воздушно-жидкостной интерфейс культуры. Объем среды составляет 7-8 мл на чашку.
  6. Поместите посуду с роговицей в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе с увлажнением с водой сковороду (таким образом, уровень влажности поддерживается на уровне или выше 95%) при 35 ° C (нормальная температура) роговичный. Добавьте 100 мкл среды (две капли) ежедневно на эпителии, чтобы увлажнить роговицу.
  7. Монитор роговицы морфологии и эпителиального жизнеспособность клеток микроскопически при проходящем свете с использованием стандартного микроскопа с объективом 4X. Сделайте это один раз в день.
  8. Изменение среды каждые три дня. Роговицы можно культивировать в течение не менее трех недель. Для проведения экспериментов по генной терапии, культуры роговицы в течение 3-5 дней, а затем transducе с генами, представляющим интерес (4,1-4,4), оставьте еще 3-5 дней в зависимости от трансгенов и при условии соблюдения ранозаживляющих протокола (2.1-2.4).

2. Эпителиальные заживление ран

Примечание: В диабетических роговиц, то эпителии механическим соскребанием не представляется возможным, потому что хрупкий эпителиальной базальной мембраны отсоединяется в процессе, который не происходит в нормальных роговиц. Таким образом, чтобы сохранить нормальные и диабетические роговиц при аналогичных условиях раневого процесса, химического удаления эпителия с н-гептаноле используется 19. Эта процедура удаляет эпителий, но оставляет позади интактной базальной мембраны в обоих нормальных и диабетических роговицей.

  1. Чтобы выполнить центральную эпителии 20, место 5 мм диска фильтровальной бумаги , смоченную в н-гептаноле на центральной передней поверхности роговицы в течение 75 сек.
  2. Снимите фильтр и промойте роговицу в полной среде. Заполните вогнутость с 0,5 мл агар-коллагенсмесь и культура, как и в 1.4. После того, как санацией, эпителиальные клетки , как правило , умирают и шелушиться оставляя позади микроскопически нетронутыми базальную мембрану 7.
  3. Используйте 8,5 мм диски для создания больших эпителиальные ран в опытах с только лимбальных генной терапии. Это позволит обеспечить участие лимбальных стволовых клеток в процессе заживления.
  4. Монитор заживления роговицы микроскопически. Сделайте фотографии на 4X и 10X каждый день, пока эпителиальный дефект не полностью зажила. Процесс заживления может занять от 2-х до 15 дней в зависимости от состояния (нормальное или диабетический) и раневой размера.
    Примечание: Во время процесса заживления, черные паукообразные клетки наблюдаются в верхней фокальной плоскости. Эти клетки являются апоптотических стромальные кератиноциты , которые умерли после того, как эпителиального удаления 4. Заживление определяется , чтобы быть полным , когда эти мертвые клетки не зарастает целительной эпителия и больше не видны (рис 2, вставка).
  5. После заживлениязавершение, разрезать роговицу пополам, встраивать их в ОКТ соединения и способа непрямой иммунофлуоресценции на участках криостата или для вестерн - блоттинга 16,21.

3. Выделение лимбальных клеток и поддержания стволовых клеток, обогащенных культур

Примечание: Подготовить первичный лимбальную эпителиальной стволовых клеток (LESC) -энантиомером культур от корнеосклеральный ободами. Ободы , поступающие от здоровых доноров и выбрасываться после трансплантаций роговицы получены от сотрудничающими хирургов в стандартном носителе данных роговичный (например, Optisol). В противном случае, LESC обогащенным культуры могут быть получены из ободов, вырезанных из нормальных и диабетических целые роговицей или глобусы, полученные от NDRI в роговичной носителе информации.

  1. Если весь роговица или глобусы используются, в первую очередь изолировать лимбальных области. Чтобы сделать это, поместите роговицу на стерильной пластиковой чашке с эпителиальной стороной вверх и снимите центральную зону с 9-мм трепана (круговой роговице нож).Сбросьте эту центральную часть. Затем иссечь лимбальную зону с использованием 13 мм трепана и отбросить внешнюю часть конъюнктивы. Для того, чтобы изолировать клетки используют рогалик типа лимбальную обод. Перед тем как выделения клеток, удалить эндотелиальные клетки и прилипшие остатки радужной оболочки с внутренней стороны роговицы, противоположной поверхности эпителия с стерильным ватным тампоном.
  2. Изолировать лимбальных клеточных листов с использованием диспазу лечения. Инкубируют каждый корнеосклеральный обод с 2,4 ед / мл диспаза II в 1,5 мл кератиноцитов бессывороточной среде (KSFM) , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , при температуре 37 ° С в течение 2 ч 22.
  3. Аккуратно ослабить лимбальную эпителиального лист клеток с обода под рассекает стереомикроскопа с пинцетом и диссоциируют клеток в 1 мл 0,25% трипсина - 0,02% раствором ЭДТА в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Вымойте клеток в 10 мл среды (например, Epilife) и осадить их при 300 мкг в настольной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Ресуспендируют-йе клетки в культуральной среде: среда с N2, B27 и добавки роста кератиноцитов человека, и 10 нг / мл фактора роста эпидермиса (EGF).
  6. Семенной клеток при 3000-5000 клеток / мл в колбы или 60 мм чашки , покрытые смесью человеческого подвальных мембранных белков , включая фибронектин, типа IV коллагена и ламинина (FCL), в 0,5-1 мкг / см 2, в KSFM средний.
  7. Культуры клеток в увлажненной (95% или более высокой влажности) CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С , пока они не образуют полностью вырожденные монослоев. Это может занять 1-2 недели.
    Примечание: Регулярно подтвердить идентичность клеток путем положительного иммуногистохимического окрашивания для предполагаемых маркеров LESC включая PAX6, кератин (К) 14, K15, K17 и ΔNp63α. Подробности окрашивания , включая первичные антитела были опубликованы 8,16-18,22.
  8. Для прохода конфлюентных клеток, относятся к ним с 1 мл 0,05% -ного раствора трипсина (1: 5 разбавление 0,25% раствора) в течение 10 мин при 37 ° С. Добавить 5 мл соевого трраствора ингибитора ypsin (10 мг / мл) разводят в соотношении 1: 4 в среде, и Центрифуга клетки, как в 3.5.
  9. Промыть осадок клеток в 3 мл раствора разводили соевого ингибитора трипсина. Пластина клеток на FCL покрытием (см 3.7) блюда или стеклянную камеру слайды на 2 - х 10 4 клеток / мл.

4. аденовируса Трансдукция органоспецифической культивируют роговиц

Примечание: рекомбинантные аденовирусы (AV) включают в себя AV-вектор (не ген не вставлен), AV-CMET (с С-мет гена открытой рамки считывания), AV-shM10 (с shRNA к ММР-10) и AV-shCF ( с shRNA к катепсин F). Они являются Е1 / Е3-удален тип 5 AV-экспрессирующих гены под контролем основного немедленного раннего промотора цитомегаловируса. АВ-CMET вирусы создаются с помощью AV вектор PAD / CMV / V5-DEST 16. Вирусы AV-shRNA на заказ порождается субклонирования shRNA последовательностей наряду с hh1 промотора и последовательности тегов GFP из iLenti-EGFP вектор в репликации некомпетентным (-E1 / -E3) Humaп AV 5 типа генома с использованием Адено-4 системы экспрессии 17.

  1. Преобразовывают один орган культивировали роговицу каждой пары с AV-вектором и другой роговицы, с экспрессии генов-модулирующей AV. С помощью AV-CMET на 0,8 до 1,25 х 10 8 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на роговице в культуральной среде в течение 48 ч при 37 ° С в поддержании роговицу под средней поверхности каждого в лунку блюдо 24-луночного. Используйте вирусы AV-shRNA на 1-2 х 10 8 КОЕ на роговице.
  2. Используйте вирусы для трансдукции в полной среде с добавлением 75 мкг / мл цитрата силденафила. Этот реагент активирует Кавеолин транспорт , облегчающую вирусный поглощение эпителиальными клетками 21. Из-за короткого периода полураспада силденафила в водных растворах, повторно добавить такое же количество в среднем 4-5 ч позже. Стандартное лечение в течение 48 часов.
  3. Передача роговиц к новым блюдам с закругленным концом стерильного шпателя и культуры в среде без AV, поддерживая средний уровень у лимба. После дополненияitional 4-8 дней на границе раздела жидкость-воздух, процесс АВ обработанных роговиц для различных анализов или испытания для эпителиального заживления ран (смотри выше). Смочить Регулярно роговицу во время культуры путем добавления 100 мкл среды (две капли) на верхней части роговицы.
  4. Для трансдукции только лимбальных клетки, инкубировать вирусы с роговиц на границе раздела воздух-жидкость со средним уровнем у лимба, чтобы избежать трансдукции центрального эпителия.

5. аденовируса трансдукция культивированных клеток лимбальных

  1. Поддерживать LESC-обогащенных культур в среде с 10 нг / мл EGF (см 3.5) на пластиковой посуде , покрытых смесью FCL при 0,5 мкг / см 2.
  2. Трансдукция культивированных клеток, которые достигли 70-80% слияния с AV укрывает зеленого флуоресцентного белка (ген AV-GFP) или AV-омлет shRNA-GFP в диапазоне множественности инфекции (MOI: 1-300 КОЕ / клетку) , в среде с 2 нг / мл EGF. Выполните transductioN в течение 4 ч при 37 ° С в минимальном объеме (0,2 мл), а затем 20 ч в 0,5 мл среды. Кавеолин транспортный активатор силденафил не требуется для культивирования клеток трансдукции.
  3. С помощью одного из следующих реагентов, которые облегчают AV связывания с клеточной поверхностью, для повышения эффективности А.В. трансдукции: либо поликатионы (1 мкг / мл поли-L-лизин или 5 мкг / мл полибрена) или 6 мкл / реагента трансдукции мл ( например, ViraDuctin), или 20 мкл / мл трансдукции энхансер (например, ibiBoost).
  4. После замены среды на один без AV, инкубировать культивируемые клетки в течение 4 -х дней, в увлажненной атмосфере СО 2 инкубаторе и оценить уровень экспрессии GFP с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа.
  5. Используйте царапанию заживлении ран анализа для оценки миграции клеток в AV-трансдуцированных культур. Растут клетки в луночные камеры горками. Сделайте раны в монослое, царапая клетки в прямой линейное движение с 200 мкл пиPette наконечник. После того, как ранении, изменить среду более свежую, чтобы удалить отдельные клетки.
  6. Сфотографировать раны каждый день с помощью цифровой камеры, прикрепленной к перевернутой микроскопа при увеличении 4X. Регистрируют время, когда исцеление завершена (края раны вступают в контакт по всей раны).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ранее мы показали , что в роговичных органных культурах, различия в экспрессии диабетических маркеров (например, базальной мембраны белков и интегрина α3β1) и заживления ран между нормальной и диабетических роговиц сохраняются. Эта система культуры подвергали генной терапии, направленной на нормализацию уровней маркеров диабета изменены, с-Met, MMP-10, и катепсина F.

Когда весь роговичный эпителий был трансдуцированных с AV-CMET или AV-shRNA к ММР-10 или катепсин F (отдельно или в комбинации), эпителиальный заживление ран значительно быстрее завершена (P <0,03 по парным Стьюдента по сравнению с AV-вектор) , чем в AV-вектор-трансдуцированных коллег роговиц из одних и тех же доноров 16,17. AV-CMET сократило время заживления вдвое, что существенно не отличаются от заживления нормальных роговиц (FIGUповторно 1). AV-shM10 и AV-shCF имели меньший эффект. Тем не менее, сочетание AV-CMET с AV-shM10 и AV-shCF (Combo) произвел сильный эффект полностью нормализуя эпителиальные раз целебными (Рисунок 1). Это уменьшение времени заживления сопровождалось нормированных форм диабетической (базальной мембраны и интегрином) и стволовых клеточных маркеров в диабетических роговиц 8,16,17.

Эпителиальные стволовые клетки являются основным заживление ран участников в группе 4. Поэтому мы исследовали, является ли лимбальных генная терапия ориентации сотовый отделение стволовых было бы полезно для диабетических роговиц. С этой целью только лимбал части диабетических роговиц были трансдуцированных с помощью AV-CMET или Combo и большие, были созданы 8,5 мм раны. AV-CMET трансдуцированных роговица значительно быстрее зажила (P <0,001 по парным Стьюдента) по сравнению с AV-вектор трансдуцированная коллег роговиц (рисЮр 2). Лечение Combo привело к тому же результату 18. Генная терапия усиливает экспрессию маркеров диабета подавлено, таких как интегрина α3β1 и компонентов базальной мембраны нидогена-1 (рисунок 3, левый колонны, Combo). Важно отметить, что как и во всей роговичной трансдукции 8,17, то лимбальных генной терапии или с AV-CMET или Combo привело к заметному повышению экспрессии маркеров предполагаемыми LESC включая К15 и ΔNp63α, по сравнению с AV-вектор преобразованных роговиц (рис 3 , правые колонки, как с-мет и Combo). Эти данные поддерживают роль стволовых клеток в нормализации ускоренного заживления ран при генной терапии диабетической роговиц и показать возможности нашего подхода к лечению диабетической болезни роговицы.

Затем мы начали исследовать эффекты генной терапии на культивируемых LESC обогащенной лимбальных эпителиальных клеток. культурынормальных и диабетических лимбальных эпителиальных клеток были созданы и окрашивали для предполагаемых маркеров LESC. Многие клетки окрашивали положительный (рисунок 4). Интенсивность окрашивания в диабетических культур был последовательно слабее , чем в нормальных культурах (K15 , показанных в качестве примера на рисунке 4), которая была очень похожа на ситуацию в диабетических против нормального ех естественных роговиц 8. Эти эксперименты проверил достоверность полученных клеточных культур в качестве пригодных для генной терапии.

Предварительные эксперименты с теломераза-иммортализованные роговичного эпителиального линии клеток (см 23) показали , что клетки были легко трансдуцированных имеющимися конструкциями AV (данные не показаны здесь). Тем не менее, первичные лимбал культуры оказались гораздо более чувствительными к вирусной нагрузки и / или реагента, трансдукции, что вызывает необходимость оптимизации протокола трансдукции. Культивируют лимбальных трансдукции клеток путемАВ-GFP (Рисунок 5) зависит от множественности инфекции (MOI, диапазон 30-300 КОЕ / клетку) , что приводит к довольно высокому уровню трансдукции при высокой MOI (выражение GFP в> 80% клеток). Однако, чем выше MOI были также токсичны, вызывая гибель клеток или серьезно нарушенную миграцию клеток в скретч раны после 3-4 дней трансдукции (рисунок 6). На нижнем MOI (10-30 КОЕ / клетку), АВ-трансдукции производства менее или отсутствие цитотоксического эффекта, но приводит к снижению числа GFP-экспрессирующих клеток (5-15%).

Далее мы попытались повысить эффективность трансдукции, не ставя под угрозу жизнеспособность клеток с помощью трансдукции увеличивающих реагентов, которые обычно облегчают AV связывания с клеточной поверхностью. Они показали различные улучшения эффективности в лимбальных эпителиальных клеток трансдукции А.В. при MOI 10-30. Оба поликатионы, поли-L-лизин, и полибрен, были нетоксичны и наиболее эффективныечто приводит к 3-4 - кратному увеличению числа GFP-положительных клеток (рис 7, верхний ряд). ibiBoost был также эффективен , но слегка токсичным, и ViraDuctin было неэффективным и весьма токсичен (рисунок 7, нижний ряд). Таким образом, поликатионы предлагают безопасный и эффективный способ повышения ген экспрессии интереса на AV-трансдукции и должны быть использованы для экспрессии генов и ранозаживляющие эксперименты.

Рисунок 1
Рисунок 1: с-Met гена трансдукция приводит к значительно снизилась роговичного эпителиального раны времени (среднее ± SEM) целебной. Кроме того, в сочетании генной терапии (Combo) с А.В. укрывание с-Met гена и shRNAs к генов ММР-10 и F катепсина полностью нормализует эпителиальной раны время заживления. Значение (значения р) была создана парного критерия Стьюдента т по сравнению с respectiv е вектор лечения. Столбики показывают стандартную ошибку среднего значения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Заживление 8,5 мм эпителиальных ран в паре диабетических роговицей. Верхний ряд, вектор-трансдуцированных роговица; исцеление завершено через 8 дней. Нижний ряд, AV-CMET трансдуцированная собрата роговицу; исцеление завершено в течение 5 дней. Стрелки показывают раны (W) край. *, Не зажила часть (также показан при большом увеличении, как врезке), с пауком-образный apoptosed стромальных кератоцитами. Они видны, пока эпителиальный слой не растет на них сверху. Бар = 50 мкм. Фазовый контраст. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ove_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Рисунок 3
Рисунок 3: иммунное диабетических роговичных участков для различных маркеров после лимбальных генной терапии. Оба AV-CMET и лечения Combo приводит к значительно более длительное лимбальную окрашивание для диабетических маркеров (интегрина α3β1 и нидоген-1) и маркеров предполагаемыми стволовых клеток (K15 и ΔNp63α). Стрелки на нидогеном-1 панелей отмечают роговичного эпителиального базальную мембрану. Бар = 30 мкм. е, эпителий; s, строма. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Иммуноцитохимическая окрашивание первичных лимбальных эпителиальных культур для мнимого LESC маркера K15. Верхний ряд, нормальная культура; Большинство клеток шош сильное окрашивание для K15. Нижний ряд, диабетическая культура; большинство клеток показывают только слабое окрашивание. Правые панели представлены DAPI ядерной counterstaining. Нормальные и диабетические клетки были сфотографированы с тем же временем экспозиции. Bar = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Уровень экспрессии GFP-трансдуцированных в лимбальных эпителиальных клеток зависит от MOI АВ-GFP: (а) 30 КОЕ / клетку; (Б) 120 КОЕ / клетку; (С) 300 КОЕ / клетку на 3 дня трансдукции. Фотографии живых клеток показаны. Bar = 300 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 6: Миграция клеток оказывает отрицательное влияние увеличения концентрации AV как показали испытания царапина раны: (а) контроль; (Б) 20 КОЕ / клетку; (С) 80 КОЕ / клетку; (D) 120 КОЕ / клетку. Фотографии живых клеток показаны. Bar = 500 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7: лимбальных эпителиальные клетки трансдуцированных с AV-GFP на 30 КОЕ / клетку. (А) контроль; (Б) поли-L-лизин; (С, d) реагента трансдукции; 5 дней трансдукции. Трансдукция реагент сaused значительный цитотоксический эффект, ведущий к клеточной закругления и смерти (д, фазовый контраст). Фотографии живых клеток показаны. Bar = 400 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Роговица, как представляется, является идеальным ткани для генной терапии из-за своей поверхности места, где для доставки генов, а также оценка эффективности и побочных эффектов, которые легко. Тем не менее, клинический перевод этого мощного подхода по - прежнему медленно из - за недостатка данных о генетических причинах заболеваний роговицы и мишеней 24 генной терапии. Диабетических осложнений , включая изменения роговицы , могут быть в значительной степени эпигенетические характер, что выражается в метаболической памяти 9. По этой причине, диабетические ткани и клетки сохраняют свои аномалии экс виво и могут быть изучены в органе и тканевой культуры. Кроме того, диабет вызывает определенные изменения в уровне экспрессии генов и моделей, которые могут быть исправлены с помощью генной терапии. Мы идентифицировали несколько маркеров измененными в диабетическую эпителия роговицы , включая 5,6,8 стволовых клеток отсека, и использовали человеческие роговице культуры органов 7,8 на нормализацию путемгенная терапия выражение маркер и эпителиальные заживление раны скомпрометирована в диабетической роговицы.

Мы выбрали в качестве AV доставки генов из - за его сильного экспрессии трансгена, его не встраивается в природе, а также его селективность в отношении эпителиальных клеток, которые являются качествами превосходят аденоассоциированного вируса (AAV) 25. А.В. трансдукция роговицы культур органов имеет несколько важных шагов. Роговицы должны быть доставлены в лабораторию в течение 48 часов посмертных, чтобы свести к минимуму потери эпителия, которая происходит во время хранения. Для увеличения вирусного поглощения, важно , чтобы добавить кавеолах транспортные ускорители, такие как силденафил, во время трансдукции 21. При проверке эффекта трансдукции на экспрессию белка, использование нескольких маркеров рекомендуется (рисунок 3), в качестве специфических маркеров стволовых клеток не окончательно определены. При изготовлении эпителиальные раны, есть необходимость использовать CheМикаль санацию из-за хрупкости диабетической эпителиальной базальной мембраны, что приводит к его отряду во время ручного выскабливания. Тщательный ежедневный мониторинг процесса заживления необходим с объективными критериями исцеления, таких как исчезновение мертвых субэпителиальных кератоцитами из поля зрения , когда эпителий regrows над ними (рисунок 2). И, наконец, из - за некоторых AV и / или токсичности GFP к первичным лимбальных клетки, важно снизить вирусную дозу, в то же время с использованием нетоксичных трансдукции ускорители, такие как поликатионы, чтобы обеспечить эффективную и безопасную трансдукции (Фигуры 5 - 7).

Система генной терапии может быть модифицирован, чтобы использовать этот орган культивировании роговиц животных. Они намного дешевле , чем человек, может быть получено в количествах на регулярной основе, и могут быть пригодны для скрининга, например, заживление ран модулирующих препаратов. Тем не менее, человеческие роговица предлагают потенциально более широкие возможности дляисследование из-за обилия реагентов, особенно антител. В случае скрининга лекарственных средств в недиабетических роговиц животного, санацию может быть сделано механически. Если антитело для определенного маркера не очень хорошо работает в некоторых человеческих роговиц, оно может быть связано с индивидуальной изменчивости и / или продолжительности заболевания или тяжести. В этом случае, может быть рекомендовано изучение других маркеров. Способность н-гептаноле для удаления клеток может значительно уменьшаться с течением времени, возможно, из-за окисления во время хранения. Если это произойдет, новый, ранее закрытой, флакон, возможно, придется использовать. При работе с дорогими человеческими роговиц, второй раунд санацией может быть предпринято. Силденафил имеет короткий период полураспада в водных растворах; Следовательно, он должен быть свежеприготовленным каждый раз, когда выполняется роговичный трансдукции. Успех культивирования лимбальных клеток может зависеть от возраста донора; клетки от молодых доноров, как правило, растут лучше. Один агент генной терапии может не вызывать signifиност ранных эффект; В этом случае сочетание таких агентов могут быть оптимальными 17. Если первичные клетки роговицы показывают признаки токсичности, важно снизить вирусную и поликатиона (например, поли-L-лизин) доз , чтобы свести к минимуму токсическое воздействие, сохраняя при этом эффективную трансдукцию.

Хотя диабетические культуры органов воспроизводят многие признаки болезни и экспрессии измененного гена, они денервированная и испытывают недостаток снабжения клеток иммунной системы, которые могут повлиять на заживление ран и стволовых клеток. В этом отношении, модели на животных могут иметь некоторые преимущества, несмотря на то, что животные не воспроизводят весь спектр признаков заболевания человека. Другие цели генной терапии существуют, которые эффективно нормализуют диабетические роговицу. Примером таких задач может быть микроРНК, в частности, Mir-146a или Mir-424 23. Комбинации, используемые модификации гена-мишени при ингибировании специфического микроРНК может потенциально произвести более сильное благотворное действие. Анофэр ограничение включает в себя необходимость относительно длительного инкубации роговицы с тематически управляемых AV (например, в виде глазных капель) , с тем чтобы обеспечить максимальное поглощение вируса. Это может создать проблему в клинике, хотя запись на пленку веки может помочь в продлении инкубации. Использование низкой концентрации силденафила в вирусного раствора может ускорить поглощение AV. Эффект AV-трансдукции непостоянно, что может ограничить лечебный потенциал AV на основе генной терапии. Хотя это длится достаточно долго , чтобы исправить диабетическую замедление заживления ран, устойчивой нормализации эпителиальных стволовых клеток может потребоваться более длительный эффект, например , как это предусмотрено в AAV на основе генной терапии 24. Следует отметить, что иммуногенность был серьезным недостатком ранних AV векторов. Тем не менее, новое поколение рекомбинантного AV включая «безвольный» вирусы в значительной степени свободны от этого побочного эффекта, увеличивая их перспективы стать мощным translatiЁнал транспортных средств генной терапии 26.

Малые молекулы модуляторы различных путей , которые могут иметь важное значение для заживления ран 16,17,21, 27-30 используются в экспериментальных моделях и в клинике. Тем не менее, они не ориентированы на конкретный тип клеток, могут иметь различные эффекты в различных клетках, и может действовать только на некоторые аспекты диабетической роговичного заболевания 31,32. Генная терапия предлагает возможность изменить экспрессию гена в желаемом направлении в конкретных клетках, что мы достигли в этой работе трансдукции эпителиальные клетки с использованием как генов гиперэкспрессия (с-Met) и глушителей (ММР-10 и катепсина F). Такой подход также позволяет модулировать экспрессию специфических генов - маркеров заболевания, по одному или в комбинации 5,6. Наши эксперименты показали, что даже в случае сочетания трех AVs, несущих различные экспрессии генов модуляторы, все три гена были затронуты, как и ожидалось, илечение было более эффективным , чем когда каждый AV использовали отдельно 17.

При тяжелой диабетической кератопатией с постоянными эпителиальных дефектов или неполного заживления эпителиальной при витрэктомии или лазерная коагуляция, замена дисфункциональных лимбальных стволовые клетки могут стать альтернативой генной терапии. В этих случаях, культивированные и расширенные лимбал эпителиальные клетки Upon генной терапии в пробирке могут быть пересажены на пораженной роговицей. Наши данные показывают , что культивируемые клетки из лимбал диабетической роговиц показывают , что аналогичные различия в экспрессии маркеров стволовых клеток , как естественных условиях роговиц бывших что делает их хорошими целями для генной терапии. Тем не менее, это лечение должно быть оптимизировано, из-за высокой чувствительности таких клеток к вирусной нагрузки и трансфекции реагента. Нам удалось показать, что катионные реагенты трансфекции обеспечили эффективную и безопасную доставку с высокой экспрессии интересующего гена в культивируемых диабетической эпителия роговицы. THESE результаты могут проложить путь для успешной генной терапии в пробирке расширенной LESC для будущих целей трансплантации в случаях тяжелой диабетической кератопатией. Поскольку наследственный и приобретенный дефицит LESC также связано со снижением нервов роговицы , подобных диабету 33,34, пересадка здоровых LESC-обогащенных культур на пораженной роговицей потенциально может облегчить диабетической нейропатии роговицы , а также.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
minimum essential medium Thermo Fisher Scientific 11095-080
Optisol-GS  Bausch & Lomb 50006-OPT
ABAM antibiotic-antimycotic mixture Thermo Fisher Scientific 15240062
calf skin collagen  Sigma-Aldrich  C9791
agar, tissue culture grade Sigma-Aldrich  A1296
n-heptanol Sigma-Aldrich  72954-5ML-F
O.C.T. compound  VWR International 25608-930
Dispase II  Roche Applied Science 4942078001
keratinocyte serum-free medium (KSFM)  Thermo Fisher Scientific 17005042
EpiLife medium with calcium Thermo Fisher Scientific MEPI500CA
N2 medium supplement, 100x Thermo Fisher Scientific 17502-048
B27 medium supplement, 50x Thermo Fisher Scientific 17504-044
human keratinocyte growth supplement, 100x Thermo Fisher Scientific S-001-5
trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
trypsin 0.25% with phenol red Thermo Fisher Scientific 15050065
soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich  T6414
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140079
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) Sigma-Aldrich  I3146-5ML
antibody to keratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253
antibody to keratin 15 Santa Cruz Biotechnology sc-47697
antibody to keratin 17 Santa Cruz Biotechnology SC-58726
antibody to ΔNp63α Santa Cruz Biotechnology sc-8609
antibody to PAX6 BioLegend PRB-278P-100
antibody to nidogen-1 R&D Systems MAB2570
antibody to integrin α3β1 EMD Millipore MAB1992
human fibronectin BD Biosciences 354008
human laminin Sigma-Aldrich  L4445
human type IV collagen Sigma-Aldrich  C6745-1ML
adenovirus expressing MMP-10 shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing cathepsin F shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing c-met OriGene (plasmid) SC323278
adenovirus expressing GFP KeraFAST FVQ002
sildenafil citrate, 25 mg Pfizer from pharmacy
epidermal growth factor  Thermo Fisher Scientific PHG0311
poly-L-lysine Sigma-Aldrich  P4707
polybrene Sigma-Aldrich  107689-10G
ViraDuctin Cell Biolabs AD-200
ibiBoost ibidi, Germany 50301
phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049
Corning round end spatula  Dow Corning 3005
60 mm Petri dishes Thermo Fisher Scientific 174888
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides  Sigma-Aldrich C6807
200 μl pipet tips Bioexpress P-1233-200 other suppliers available
inverted microscope  Nikon Diaphot other suppliers/models available
humidified CO2 incubator  Thermo Fisher Scientific 370 (Steri-Cycle) other suppliers/models available
fluorescent microscope Olympus, Japan BX-40 other suppliers/models available
dissecting stereo microscope Leica, Germany S4 E other suppliers/models available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

Tags

Биология развития выпуск 110 диабетическая роговица генная терапия аденовирус MMP-10 катепсин F C-Met лимбальных стволовые клетки органной культуры поликатионы shRNA заживление ран клеточная культура
Аденовируса генной терапии для больных сахарным диабетом Кератопатия: Влияние на заживление ран и стволовых клеток маркера выражение в человеческих органов культивируемых роговиц и лимбальных эпителиальных клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kramerov, A. A., Saghizadeh, M.,… More

Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (110), e54058, doi:10.3791/54058 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter