Abstract
L'objectif de ce protocole est de décrire les altérations moléculaires dans les cornées diabétiques humains et démontrer comment ils peuvent être atténués par la thérapie génique adénovirale dans cornées d'organes en culture. La maladie de la cornée diabétique est une complication du diabète avec des anomalies fréquentes des nerfs de la cornée et de la cicatrisation de l'épithélium. Nous avons également documenté l'expression modifiée de façon significative de plusieurs marqueurs de cellules souches épithéliales putatifs dans les cornées diabétiques humains. Pour pallier ces changements, la thérapie génique adénovirale a été réalisé avec succès en utilisant la régulation positive de c-met l'expression du proto-oncogène et / ou la régulation négative de la matrice de protéinases métalloprotéinase-10 (MMP-10) et de la cathepsine F. Cette thérapie a accéléré la cicatrisation des plaies dans les cornées diabétiques même lorsque seul le compartiment des cellules souches limbiques a été transduite. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un traitement combiné. Pour la transplantation possible du patient des cellules souches normalisées, par exemple, est également présenté de l'optimizatisur la transduction de gènes dans des cultures enrichies de cellules souches en utilisant des amplificateurs polycationiques. Cette approche peut être utile non seulement pour les gènes sélectionnés, mais aussi pour les autres médiateurs de la cornée cicatrisation épithéliale et endiguer la fonction cellulaire.
Introduction
La maladie de la cornée diabétique résulte principalement dans l'épithélium dégénératif (kératopathie) et nerveux (neuropathie) changements. Il se manifeste souvent par les anomalies de la cicatrisation des plaies épithéliales et la cornée réduction du nerf 1-4. On estime que 60-70% des diabétiques ont divers problèmes de la cornée 1,3. Nos études ont identifié plusieurs protéines de marquage avec une expression altérée dans les cornées diabétiques humains , y compris la régulation négative de (récepteur du facteur de croissance des hépatocytes) proto-oncogène c-met et la régulation positive de la métalloprotéinase matricielle 10 (MMP-10) et de la cathepsine F 5, 6. nous avons aussi documenté diminué de manière significative l'expression de plusieurs marqueurs de cellules souches épithéliales putatifs dans les cornées diabétiques humains.
Dans les études précédentes, nous avons mis au point une thérapie génique à base adénovirale pour normaliser les niveaux des marqueurs du diabète altéré en utilisant le système humain diabétique de cornée de culture d'organe, ce qui montre une cicatrisation lente des plaies, diabétiquechangements de position, et la tige marqueur cellulaire réduction d'expression similaire aux ex vivo cornées 7,8. Cette persistance des variations semble être due à l'existence de la mémoire métabolique 9 épigénétique. Ce système de culture a été en outre utilisé pour la thérapie génique. Les objectifs de cette thérapie ont été choisis parmi les marqueurs avec soit une expression réduite dans les cornées diabétiques (c-met proto-oncogène), ou une augmentation de l' expression (MMP-10 et de la cathepsine F).
Le (AV) la thérapie adénovirale a été utilisé dans les cornées d'organes en culture entiers ou le compartiment limbique périphérique cornéo seulement. Ce compartiment abrite les cellules souches épithéliales qui renouvellent l'épithélium cornéen et participent activement à la cicatrisation des plaies 4,10-15. Ici, les protocoles sont prévus pour la culture normale de la cornée humaine diabétique organe, la cicatrisation des plaies epitheliales, l'isolement et la caractérisation des cultures cellulaires limbique enrichis en cellules souches et de cellules et la transduction adénovirale de la cornée. notreles résultats montrent la faisabilité de cette thérapie pour normaliser l'expression du marqueur et la cicatrisation des plaies dans les cornées diabétiques pour une éventuelle transplantation future. Ils suggèrent également que la thérapie de combinaison est le moyen le plus efficace pour restaurer motif marqueur normal et la guérison épithéliales de la cornée diabétique 16-18.
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Protocol
Maladie national de recherches Interchange (NDRI, Philadelphie, PA) fourni post-mortem des yeux humains sains et diabétiques un consentement et cornées. protocole de collecte de tissus humains de NDRI est approuvé par le comité de gestion et sous réserve de National Institutes of Health contrôle. Cette recherche a été menée dans le cadre du Conseil approuvé Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review (CISR) protocole exempté EX-1055. La collaboration des chirurgiens ophtalmologistes, les Drs. E. Maguen et Y. Rabinowitz, fournis jantes cornéo défausse pour l'isolement des souches épithéliales cornéennes cultures enrichis en cellules. Cette recherche a été menée dans le cadre du protocole IRB approuvé Pro00019393.
1. Human cornéenne Organ Culture
Remarque: les cornées normales et diabétiques ou les yeux entiers sont reçus dans un milieu de stockage réfrigéré cornéenne (par exemple, Optisol GS) dans les 48 heures après la mort du fournisseur national NDRI.
- Retirez les cornées de conteneur de stockage avec des pinces et les laver deux fois in le mélange antibiotique-antimycosique (ABAM). En cas d'yeux entiers, couper les cornées sur des globes avec des ciseaux courbes. Laissez au moins un rebord conjonctivale de 5 mm et laver aussi les cornées en ABAM.
- Préparer le mélange pour être placé dans la concavité de la cornée. Il se compose d'un milieu sans sérum minimum essentiel (MEM) contenant ABAM, 1 mg / ml de veau peau collagène (fabriqué à partir d'une solution mère de 10 mg / ml dans de l'acide 0,1 N de acétique), 1% d'agar, et de l'insuline-transferrine-sélénite compléter 7.
- Micro-ondes de ce mélange à l'ébullition pour la stérilisation et la dissolution de gélose. Il peut prendre jusqu'à 1 min pour tout dissoudre. Laissez le bouchon du tube partiellement ouvert parce que le mélange déborde facilement quand il bout. Pour cette raison, plusieurs cycles d'ébullition peuvent être nécessaires pour chacun de 10 à 15 secondes. Refroidir le mélange à 37-39 ° C.
- Placez les cornées côté épithélial dans stériles 60 mm plats. Remplir la concavité de la cornée avec environ 0,5 ml du mélange décrit en 1.2. lemélange se solidifie sur les cornées dans les 2 min.
- Placez les cornées côté agar dans des boites stériles de 60 mm et d' ajouter le support complet contenant du MEM avec ABAM, et de l' insuline-transferrine-sélénite Supplément 7 (37 ° C) pour garder son niveau à peu près au limbe pour la culture de l' interface air-liquide. Le volume moyen est de 7-8 ml par boîte.
- Placez les plats avec les cornées dans un incubateur à CO 2 de 5% humidifié avec une casserole d'eau ( de cette façon, le niveau d'humidité est maintenu à ou au- dessus de 95%) à 35 ° C (température de la cornée normale). Ajouter 100 ul de milieu (deux gouttes) par jour sur l'épithélium pour humidifier les cornées.
- Surveiller la morphologie de la cornée et de la viabilité des cellules épithéliales au microscope sous lumière transmise au moyen d'un microscope standard avec un objectif 4X. Faites-le une fois par jour.
- Changer le milieu tous les trois jours. Les cornées peuvent être cultivées pendant au moins trois semaines. Pour les expériences de thérapie génique, les cornées culture pendant 3-5 jours, puis TRANSDUCe avec des gènes d'intérêt (4.1-4.4), laisser pendant 3-5 jours en fonction du transgène et sous réserve du protocole de cicatrisation (2.1-2.4).
2. La guérison des plaies épithéliales
Remarque: Dans les cornées diabétiques, le débridement épithélial par raclage mécanique est pas possible parce que la membrane basale épithéliale fragile est détaché dans le processus, ce qui ne se produit pas dans les cornées normales. Ainsi, pour conserver les cornées normales et diabétiques dans les mêmes conditions de cicatrisation de la plaie, l' enlèvement chimique de l'épithélium avec du n-heptanol est utilisé 19. Cette procédure supprime l'épithélium, mais laisse derrière une membrane basale intacte dans les deux cornées normales et diabétiques.
- Pour effectuer épithéliale centrale débridement 20, placer un disque de 5 mm de papier filtre trempé dans du n-heptanol sur la surface cornéenne centrale antérieure pendant 75 secondes.
- Retirer le filtre et laver les cornées en plein milieu. Remplir la concavité avec 0,5 ml d'agar-collagènele mélange et la culture comme dans 1.4. Après débridement, les cellules épithéliales meurent habituellement et dépouiller de laisser derrière la membrane basale microscopiquement intacte 7.
- Utiliser des disques de 8,5 mm pour créer des grandes plaies epitheliales dans les expériences avec seulement la thérapie génique limbique. Cela permettra d'assurer l'implication des cellules souches limbiques dans le processus de guérison.
- Surveiller microscopiquement la cicatrisation de la cornée. Faire des photos à 4X et 10X tous les jours jusqu'à ce que le défaut épithélial est complètement guérie. Le processus de guérison peut prendre de 2 à 15 jours en fonction de l'état (normal ou diabétique) et la taille de la plaie.
Note: Pendant le processus de guérison, des cellules ressemblant à des araignées noires sont observées au niveau du plan focal haut. Ces cellules sont kératocytes stromales apoptotiques qui sont morts après le retrait de l' épithélium 4. La guérison est jugée complète lorsque ces cellules mortes sont envahies par l'épithélium de guérison et ne sont plus visibles (Figure 2, encadré). - Après la guérisonachèvement, coupé les cornées dans la moitié, les intégrer dans le composé et le processus octobre pour immunofluorescence indirecte sur des coupes cryostat ou Western blots 16,21.
3. Isolement des cellules limbiques et entretien des souches de cultures de cellules enrichi
Note: Préparer la cellule primaire limbique épithéliale souches (LESC) cultures enrichies des jantes cornéo. Les jantes provenant de donneurs sains et mis au rebut après la transplantation de la cornée sont reçues des chirurgiens collaborateurs dans le support de stockage de la cornée standard (par exemple, Optisol). Dans le cas contraire, les cultures enrichies Lesc peuvent être obtenus à partir des rebords excisés de cornées entiers normaux et diabétiques ou des globes NDRI reçues dans le support de stockage de la cornée.
- Si les cornées ou globes entiers sont utilisés, d'abord isoler les zones limbiques. Pour ce faire, placez la cornée sur un plat en plastique stérile avec le côté épithélial et enlever la zone centrale avec un trépan de 9 mm (couteau circulaire de la cornée).Jeter cette partie centrale. Puis exciser la zone limbique en utilisant un 13 mm trépan et jeter la partie conjonctivale extérieure. Pour isoler les cellules utilisent la jante limbique bagel-like. Avant l'isolement cellulaire, éliminer les cellules endothéliales et les restes adhérents de l'iris de la face interne de la cornée en face de l'épithélium de surface avec un tampon de coton stérile.
- Isoler feuilles de cellules limbiques en utilisant un traitement dispase. Incuber chaque jante cornéosclérale avec 2,4 U / ml de dispase II à 1,5 milieu sans sérum ml kératinocytaire (KSFM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) à 37 ° C pendant 2 heures 22.
- soulager doucement la feuille de cellules épithéliales limbiques de la jante sous un microscope binoculaire stéréo avec une pince et dissocier les cellules dans 1 ml de trypsine à 0,25% - solution d'EDTA 0,02% pendant 30 min à température ambiante.
- Laver les cellules dans 10 ml de milieu (par exemple, Epilife) et un culot eux à 300 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min à température ambiante.
- e Resuspendree cellules dans un milieu de culture: milieu avec du N2, B27 et les suppléments de croissance des kératinocytes humains et 10 ml de facteur de croissance épidermique / ng (EGF).
- Ensemencer les cellules à 3000-5000 cellules / ml dans des flacons ou des boîtes de 60 mm recouverts d'un mélange de protéines de la membrane basale humaine , y compris la fibronectine, collagène de type IV et la laminine (FCL), à 0,5 à 1 ug / cm2, dans la KSFM moyen.
- La culture des cellules dans un humidifiée CO 2 de l' incubateur (95% ou à une humidité élevée) à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils forment des monocouches confluentes complètement. Cela peut prendre 1-2 semaines.
Remarque: confirmer régulièrement l'identité cellulaire par coloration immunocytochimique positive pour les marqueurs Lesc putatifs dont PAX6, la kératine (K) 14, K15, K17 et ΔNp63α. Les détails de coloration , y compris les anticorps primaires ont été publiés 8,16-18,22. - Pour le passage des cellules confluentes, traitez-les avec une solution 1 ml de 0,05% de trypsine (1: 5 de dilution de la solution à 0,25%) pendant 10 min à 37 ° C. Ajouter 5 ml de soja trSolution d'inhibiteur de ypsin (10 mg / ml) dilué à 1: 4 dans un milieu et centrifuger les cellules comme au point 3.5.
- Laver le culot cellulaire dans 3 ml d'une solution d'inhibiteur de trypsine de soja dilué. Plaque les cellules sur LCM-couché (voir 3.7) des plats ou des diapositives de chambre de verre à 2 x 10 4 cellules / ml.
4. transduction adénovirale de cornées Organ-culture
Remarque: Les adénovirus recombinants (AV) comprennent AV-vecteur (pas de gène inséré), AV-ÉÉGC (avec le gène cadre de lecture ouvert c-met), AV-shM10 (avec shRNA à MMP-10), et AV-SHCF ( avec des shRNA de la cathepsine F). Ils sont E1 / E3-deleted type 5 AV exprimant des gènes sous le contrôle du promoteur majeur immédiat précoce du cytomégalovirus. Les virus AV-ÉÉGC sont générées en utilisant vecteur AV pAd / CMV / V5-DEST 16. Les virus AV-shRNA sont personnalisés générés par sous-clonage de séquences shRNA avec HH1 promoteur et la séquence d'étiquette GFP de iLenti-EGFP vecteur dans une réplication incompétent (-E1 / -E3) human type AV 5 du génome en utilisant Adeno-4 système d'expression 17.
- Transduire une cornée d'organes en culture de chaque paire avec AV-vecteur et une autre cornée, avec un AV expression des gènes modulant. Utilisez le AV-ÉÉGC à 0,8 à 1,25 x 10 8 unités (pfu) formant des plaques par la cornée dans un milieu de culture pendant 48 heures à 37 ° C en gardant les cornées sous la surface moyenne chacun dans un puits d'une plaque de 24 puits. Utilisez les virus AV-shRNA à 1-2 x 10 8 pfu par cornée.
- Utilisez les virus pour la transduction en plein milieu additionné de 75 pg / ml de citrate de sildénafil. Ce réactif active le transport caveolin facilitant l' absorption virale par les cellules épithéliales 21. En raison de la demi-vie courte de sildénafil dans des solutions aqueuses, ajoutez de nouveau le même montant au milieu 4-5 heures plus tard. Le traitement standard est pendant 48 heures.
- Transfert cornées à de nouveaux plats avec une spatule stérile bout rond et de la culture dans le milieu sans AV maintenir le niveau moyen au niveau du limbe. Après l'additional 4-8 jours à l'interface liquide-air, processus cornées AV-traitée pour diverses analyses ou tests pour la cicatrisation des plaies épithéliales (voir ci-dessus). humecter de façon routinière les cornées pendant la culture en ajoutant 100 ul de milieu (deux gouttes) au-dessus de la cornée.
- Pour la transduction des cellules limbiques seulement, incuber les virus avec les cornées à l'interface air-liquide avec un niveau moyen au niveau du limbe, afin d'éviter la transduction de l'épithélium central.
5. transduction adénovirale de cellules Cultured limbiques
- Maintenir les cultures LESC enrichies dans le milieu avec 10 ng / ml d' EGF (voir 3.5) sur la vaisselle en plastique revêtues du mélange FCL à 0,5 ug / cm2.
- Transduire des cellules en culture qui ont atteint 70-80% de confluence avec l'AV hébergeant le gène de la protéine fluorescente verte (GFP-AV) ou l'AV-brouillée shRNA-GFP dans une gamme de multiplicité d'infection (MOI: 1 à 300 pfu / cellule) dans le milieu avec 2 ng / ml d'EGF. Effectuer la transduction pendant 4 heures à 37 ° C dans un volume minimum (0,2 ml), suivie de 20 heures dans 0,5 ml de milieu. La cavéoline activateur du transport du sildénafil est pas nécessaire pour la transduction de la culture cellulaire.
- Utiliser l'un des réactifs suivants qui facilitent la liaison à la surface cellulaire AV pour améliorer l'efficacité de transduction AV: soit des polycations (1 pg / ml de poly-L-lysine ou de 5 ug / ml de polybrène) ou 6 ul / ml de réactif de transduction ( par exemple ViraDuctin) ou 20 ul / ml d' activateur de transduction (par exemple ibiBoost).
- Après avoir remplacé le milieu pour l'un sans l'AV, incuber les cellules en culture pendant 4 jours dans l'incubateur à CO2 humidifiée et à évaluer le niveau d'expression de la GFP en utilisant un microscope à fluorescence inversée.
- Utilisez le test de cicatrisation de zéro pour évaluer la migration des cellules dans les cultures AV-transduction. Cultiver les cellules dans les coulisses de la chambre multipuits. Faire les blessures dans une monocouche en grattant les cellules dans un mouvement linéaire droite avec une pi 200 pipointe pette. Après blessant, changer le milieu pour une fraîche pour éliminer les cellules individuelles.
- Photographier les blessures tous les jours avec un appareil photo numérique attaché à un microscope inversé à 4X grossissement. Enregistrer le moment où la guérison est complète (les bords de la plaie sont en contact le long de la totalité de la plaie).
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Representative Results
Nous avons montré précédemment que , dans les cultures d'organe cornéen, les différences dans l'expression des marqueurs du diabète (par exemple, des protéines de membrane basale et l' intégrine α3β1) et la cicatrisation entre les cornées normales et diabétiques sont conservés. Ce système de culture a été soumis à la thérapie génique visant à normaliser les niveaux des marqueurs de diabète modifié, c-Met, MMP-10, et de la cathepsine F.
Lorsque l'ensemble de l'épithélium cornéen a été transduite avec l'AV-ÉÉGC, ou AV-shRNA à MMP-10 ou la cathepsine F (séparément ou en combinaison), épithéliales la cicatrisation des plaies a été achevée nettement plus rapide (P <0,03 par paires test t de Student par rapport à AV-vecteur) que dans les AV-vecteur-transduction autres cornées provenant des mêmes bailleurs de fonds 16,17. L'AV-ÉÉGC réduit le temps de guérison de moitié, ce qui ne diffère pas significativement de la guérison des cornées normales (Figure 1). L'AV-shM10 et AV-SHCF ont eu un effet plus petit. Toutefois, une combinaison de l'AV-ÉÉGC avec l'AV-shM10 et AV-SHCF (Combo) a produit l'effet le plus fort normaliser complètement les temps de guérison épithéliales (Figure 1). Cette réduction du temps de guérison a été accompagnée par des motifs normalisés des diabétiques (membrane basale et une intégrine) et des marqueurs de cellules souches dans les cornées diabétiques 8,16,17.
Les cellules souches épithéliales sont les principaux participants 4 cicatrisante. Par conséquent, nous avons examiné si la thérapie génique limbique ciblant le compartiment des cellules souches serait bénéfique pour les cornées diabétiques. A cet effet, seules les parties limbiques des cornées diabétiques ont été transduites par le ÉÉGC AV ou Combo grand de 8,5 mm plaies ont été créées. L'AV-cMet cornées transduites guéries nettement plus rapide (P <0,001 par t apparié test de Student) que le AV-vecteur transduit autres cornées (Figure 2). Le traitement combiné a entraîné le même résultat 18. La thérapie génique a augmenté l'expression de marqueurs de diabète supprimés, tels que l' intégrine α3β1 et un composant de la membrane basale du nidogène-1 (figure 3, les colonnes de gauche, Combo). Il est important, comme dans l'ensemble de transduction de la cornée 8,17, la thérapie génique limbique avec soit l'AV-ÉÉGC ou combiné a conduit à une expression nettement accrue des marqueurs putatifs , dont Lesc K15 et ΔNp63α, par rapport aux cornées AV vecteur transduites (figure 3 , colonnes de droite, les deux c-met et Combo). Ces données ont soutenu le rôle de la normalisation des cellules souches dans la cicatrisation accélérée sur la thérapie génique des cornées diabétiques et montrent la faisabilité de notre approche pour le traitement de la maladie de la cornée diabétique.
Nous avons ensuite commencé à examiner les effets de thérapie génique sur les cellules épithéliales limbiques Lesc enrichi en culture. les culturesdes cellules épithéliales limbiques normales et diabétiques ont été établies et colorées pour les marqueurs Lesc putatifs. Beaucoup de cellules colorées positive (Figure 4). L'intensité de coloration dans les cultures diabétiques a été constamment plus faible que dans les cultures normales (K15 présentée comme un exemple de la figure 4), ce qui était très similaire à la situation dans les cornées du diabétique par rapport à la normale ex vivo 8. Ces expériences ont validé les cultures cellulaires obtenues comme convenant pour la thérapie génique.
Des expériences préliminaires avec une lignée de cellules épithéliales de la cornée télomérase immortalisées (voir 23) ont montré que les cellules ont été facilement transduites par les constructions AV disponibles (données non présentées ici). Cependant, les cultures primaires limbiques se sont avérés être beaucoup plus sensible à la charge virale et / ou le réactif de transduction, ce qui nécessite une optimisation du protocole de transduction. La limbique transduction de cellules cultivées parl'AV-GFP (figure 5) dépendait de la multiplicité d'infection (MOI; gamme 30-300 pfu / cellule) aboutissant à un niveau assez élevé de transduction à haute MOI (d'expression de la GFP dans les cellules> 80%). Cependant, le MOI plus élevé étaient également toxiques, provoquant la mort cellulaire ou la migration cellulaire sévèrement altérée dans les plaies de grattage après 3-4 jours de transduction (figure 6). A la MOI basse (10 à 30 pfu / cellule de) la transduction AV produit peu ou pas d'effet cytotoxique, mais a entraîné une diminution du nombre de cellules exprimant la GFP (5-15%).
Nous avons ensuite tenté d'augmenter l'efficacité de transduction sans compromettre la viabilité des cellules en utilisant des réactifs de transduction amélioration qui facilitent généralement la liaison à la surface cellulaire AV. Ils ont montré différentes améliorations de l'efficacité dans limbique transduction des cellules épithéliales par l'AV à MOI 10-30. Les deux polycations, la poly-L-lysine, et le polybrène, sont non toxiques et les plus efficacesrésultant en 3-4 fois plus dans le nombre de cellules GFP-positives (Figure 7, rangée du haut). ibiBoost était aussi efficace , mais légèrement toxique, et ViraDuctin était inefficace et plutôt toxique (figure 7, rangée du bas). Par conséquent, polycations offrent de manière sûre et efficace pour stimuler le gène d'expression d'intérêt sur la transduction AV et doivent être utilisés pour l'expression des gènes et enroulées expériences de guérison.
Figure 1: c-Met gène transduction conduit à une diminution significative de l' épithélium cornéen blessure temps (moyenne ± SEM) de guérison. En outre, la thérapie génique combinée (Combo) avec le gène de l' hébergement AV c-met et shRNA aux gènes de MMP-10 et de la cathepsine F normalise complètement épithéliale cicatrisation temps. Signification (valeurs p) a été créé par t apparié test de Student en comparaison avec respectiv vecteur traitements e. Les barres représentent l'erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Healing de 8,5 mm plaies épithéliales dans une paire de cornées diabétiques. Rangée du haut, la cornée de vecteur-transduction; la guérison est complète en 8 jours. Rangée du bas, AV-ÉÉGC transduction garçon cornée; la guérison est complète en 5 jours. Les flèches indiquent la plaie (W) bord. *, Une partie non cicatrisées (également montré à fort grossissement en médaillon), avec les kératinocytes stromales apoptosed en forme d'araignée. Ils sont visibles jusqu'à ce que la couche épithéliale se développe au-dessus d'eux. Bar = 50 pm. Le contraste de phase. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: immunocoloration des sections cornéennes diabétiques pour différents marqueurs après la thérapie génique limbique. Les deux AV-ÉÉGC et traitements Combo entraînent nettement augmenté coloration limbique pour les marqueurs diabétiques (intégrine α3β1 et de nidogène-1) et des marqueurs de cellules souches putatives (K15 et ΔNp63α). Les flèches sur nidogène-1 panneaux marquent la membrane basale de l'épithélium cornéen. Bar = 30 pm. E, epithelium; s, stroma. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: coloration immunocytochimique des cultures épithéliales limbiques primaire pour putative LESC marqueur K15. Rangée du haut, la culture normale; la plupart des cellules shoune forte coloration w pour K15. Rangée du bas, de la culture diabétique; la plupart des cellules montrent qu'une faible coloration. Les panneaux de droite sont présentés avec DAPI contre-coloration nucléaire. Les cellules normales et diabétiques ont été photographiés avec le même temps d'exposition. Bar = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Le niveau de la GFP-expression dans les cellules épithéliales limbiques transduites dépend de MOI de AV-GFP: (a) 30 pfu / cellule; (B) 120 pfu / cellule; (C) 300 pfu / cellule à 3 jours de transduction. Photographies de cellules vivantes sont présentés. Bar = 300 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: La migration cellulaire est affectée par la concentration croissante des AV tel que révélé par le test de zéro de la blessure: (a) le contrôle; (B) 20 pfu / cellule; (C) de 80 pfu / cellule; (D) 120 pfu / cellule. Photographies de cellules vivantes sont présentés. Bar = 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: cellules épithéliales limbiques transduction avec AV-GFP à 30 pfu / cellule. (A) le contrôle; (B) la poly-L-lysine; (C, d) un réactif de transduction; 5 jours de transduction. C réactif transductionaused un effet cytotoxique significative conduisant à l'arrondissement des cellules et la mort (d, contraste de phase). Photographies de cellules vivantes sont présentés. Bar = 400 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La cornée semble être un tissu idéal pour la thérapie génique en raison de son emplacement de surface où la livraison de gènes, ainsi que l'évaluation de l'efficacité et les effets secondaires, sont faciles. Toutefois, une traduction clinique de cette approche puissante est encore lente en raison de peu d' informations sur les causes génétiques des maladies de la cornée et les cibles de thérapie génique 24. Les complications diabétiques , y compris des modifications de la cornée peuvent être en grande partie épigénétique dans la nature, ce qui se traduit dans la mémoire métabolique 9. Pour cette raison, les tissus et les cellules conservent leurs diabétiques anomalies ex vivo et peuvent être étudiés dans la culture d'organes et de tissus. En outre, le diabète provoque des changements spécifiques dans les niveaux et les modèles d'expression génique qui peuvent être corrigées par la thérapie génique. Nous avons identifié plusieurs marqueurs modifiés dans l'épithélium cornéen diabétique , y compris le compartiment 5,6,8 de cellules souches, et utilisé les cultures d'organes cornéennes humaines 7,8 pour normaliser parla thérapie génique, l'expression du marqueur et la cicatrisation de l'épithélium de la cornée compromise diabétique.
Nous avons choisi l'AV en tant que véhicule de délivrance de gène en raison de sa forte expression du transgène, sa nature non-intégration et sa sélectivité pour les cellules épithéliales, qui sont des qualités supérieures à celles du virus adéno-associé (AAV) 25. La transduction AV des cultures d'organe cornéen comporte plusieurs étapes critiques. Les cornées doivent être livrés au laboratoire dans un délai de 48 heures post-mortem, afin de minimiser la perte de l'épithélium qui se produit pendant le stockage. Pour augmenter l'absorption virale, il est important d'ajouter des boosters de transport cavéoles, tels que le sildénafil, lors de la transduction 21. Lors de la validation de l'effet de transduction dans l' expression des protéines, l'utilisation de plusieurs marqueurs est recommandé (figure 3), en tant que marqueurs spécifiques de cellules souches ne sont pas définitivement identifiés. Lorsque vous faites les plaies épithéliales, il y a une nécessité d'utiliser le cheMical débridement en raison de la fragilité de la membrane basale épithéliale diabétique résultant dans son détachement lors de grattage manuel. Un suivi quotidien attentif du processus de guérison est nécessaire avec des critères objectifs de guérison, comme la disparition des morts kératocytes subépithéliaux à la vue lorsque l'épithélium repousse sur eux (Figure 2). Enfin, en raison de certains AV et / ou la toxicité de la GFP dans les cellules limbiques primaires, il est important de diminuer la dose virale, en même temps , en utilisant des boosters de transduction non toxiques, tels que des polycations, pour assurer la transduction efficace et sûre (figures 5 - 7).
Le système de thérapie génique peut être modifié pour utiliser les cornées des organes en culture animale. Ils sont beaucoup moins chers que les humains, peuvent être obtenus dans des quantités sur une base régulière, et peuvent être appropriés pour le criblage, par exemple, des médicaments thérapeutiques modulant la plaie. Cependant, les cornées humaines offrent des possibilités potentiellement plus larges pourl'étude en raison de l'abondance des réactifs, en particulier des anticorps. Dans le cas du dépistage de la drogue dans les cornées des animaux non diabétiques, le débridement peut être fait mécaniquement. Si un anticorps pour un certain marqueur ne fonctionne pas bien dans des cornées humaines, elle peut être due à la variabilité individuelle et / ou la durée de la maladie ou de la gravité. Dans ce cas, l'examen d'autres marqueurs peut être recommandée. La capacité de n-heptanol pour éliminer les cellules peut diminuer de façon significative au fil du temps, peut-être en raison de l'oxydation pendant le stockage. Si cela se produit, un nouveau préalablement ouvert, flacon peut avoir besoin d'être utilisé. Si vous travaillez avec les cornées humaines coûteuses, un second tour de débridement peut être tentée. Sildenafil a une demi-vie courte dans des solutions aqueuses; Par conséquent, il doit être fraîchement préparé chaque fois qu'une transduction de la cornée est effectué. Le succès de la mise en culture des cellules limbiques peuvent dépendre de l'âge du donneur; les cellules provenant de donneurs plus jeunes se développent habituellement mieux. Un agent de thérapie génique unique ne peut pas provoquer une sigeffet icant; dans ce cas, une combinaison de ces agents peut être optimal 17. Si les cellules de la cornée primaires présentent des signes de toxicité, il est important d'abaisser le (par exemple, le poly-L-lysine) et de polycation doses virales pour minimiser les effets toxiques tout en conservant une transduction efficace.
Bien que les cultures d'organes diabétiques reproduisent de nombreux signes de la maladie et l'expression du gène altéré, ils sont dénervé et manquent de la fourniture de cellules immunitaires, ce qui peut affecter la cicatrisation des plaies et des cellules souches. À cet égard, les modèles animaux peuvent offrir certains avantages, bien que les animaux ne reproduisent pas le spectre complet des signes de maladies humaines. Les autres objectifs de la thérapie génique existent qui normalise efficacement cornées diabétique. Un exemple de ces objectifs peut être microRNA, spécifiquement, mir-146a ou mir-424 23. Les combinaisons des modifications de gènes cibles utilisées avec l'inhibition de microARN spécifiques peuvent potentiellement produire un effet bénéfique plus puissant. another limitation comprend la nécessité d' une relativement longue incubation de la cornée avec l'AV administré par voie topique (par exemple, sous la forme de gouttes pour les yeux), afin d'assurer l' absorption maximale virale. Cela peut poser un problème dans la clinique, bien que taping les paupières pourrait aider à prolonger l'incubation. L'utilisation d'une faible concentration du sildénafil dans la solution virale pourrait accélérer l'adoption de AV. L'effet de transduction AV est transitoire, ce qui peut limiter le potentiel curatif de la thérapie génique basée sur AV. Même si elle dure assez longtemps pour corriger la cicatrisation des plaies ralentissement diabétique, soutenue normalisation des cellules souches épithéliales pourrait nécessiter un effet plus durable, tel que fourni par la thérapie génique à base d' AAV-24. Il convient de mentionner que l'immunogénicité était un sérieux inconvénient de vecteurs AV précoce. Cependant, l'AV recombinant de nouvelle génération, y compris les virus "gutless" sont en grande partie libre de cet effet secondaire, augmentant leurs chances d'être translati puissantonal véhicules de thérapie génique 26.
Des modulateurs à petites molécules de différentes voies qui peuvent être importants pour la cicatrisation 16,17,21, 27-30 sont utilisés dans les modèles expérimentaux et la clinique. Cependant, ils ne sont pas ciblés à un type de cellule spécifique, peuvent avoir des effets différents dans des cellules différentes, et ne peuvent agir que sur certains aspects de la maladie de la cornée diabétique 31,32. La thérapie génique offre la possibilité de modifier l'expression génique dans une direction souhaitée dans des cellules spécifiques, que nous avons accompli dans ce travail transduire les cellules épithéliales utilisant à la fois la surexpression de gènes (c-Met) et le silençage (MMP-10 et de la cathepsine F). Cette approche permet également de moduler l'expression de gènes spécifiques de marqueurs de la maladie, une par une ou en combinaisons 5,6. Nos expériences ont montré que même en cas de combinaison de trois AVs hébergeant différents modulateurs d'expression génique, les trois gènes ont été affectés comme prévu, etle traitement est plus efficace que lorsque chaque AV a été utilisé seul 17.
En kératopathie diabétique sévère avec les défauts épithéliaux persistants ou cicatrisation épithéliale incomplète sur vitrectomie ou photocoagulation au laser, un remplacement des cellules souches limbiques dysfonctionnelles peut être une alternative à la thérapie génique. Dans ces cas, les cellules epitheliales limbiques cultivées et est complétée par une thérapie génique in vitro peuvent être greffées sur les cornées malades. Nos données montrent que les cellules limbiques cultivées des cornées diabétiques montrent des différences similaires dans les cellules souches marqueur expression ex vivo cornées qui les rend de bonnes cibles pour la thérapie génique. Toutefois, ce traitement doit être optimisé, en raison de la grande sensibilité de ces cellules à la charge et réactif de transfection viral utilisé. Nous avons pu montrer que les réactifs de transfection cationiques assuré la livraison efficace et sûre avec une forte expression d'un gène d'intérêt dans l'épithélium cornéen diabétique culture. Tles résultats peuvent es ouvrir la voie à la thérapie génique réussie in vitro élargi LESC pour les futures fins de transplantation dans les cas de graves kératopathie diabétique. Étant donné que la déficience héréditaire et acquis LESC est également associée à la réduction des nerfs de la cornée semblables à 33,34 diabète, la transplantation de cultures saines LESC enrichies sur les cornées malades pourrait atténuer la neuropathie diabétique , de la cornée aussi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
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