Abstract
Das Ziel dieses Protokolls ist molekularen Veränderungen in humanen diabetischen Cornea zu beschreiben und zu zeigen, wie sie durch adenovirale Gentherapie in organ kultivierten Hornhaut gelindert werden. Die diabetische Hornhauterkrankung ist eine Komplikation des Diabetes mit häufigen Störungen der Hornhautnerven und epitheliale Wundheilung. Wir haben auch signifikant verändert Expression mehrerer putative epitheliale Stammzellmarkern in humanen diabetischen Cornea dokumentiert. Um diese Änderungen, adenovirale Gentherapie lindern wurde erfolgreich die Hochregulation von c-met proto-Onkogen-Expression durchgeführt und / oder das Herunterregulieren von Proteinasen Matrix-Metalloproteinase-10 (MMP-10) und Cathepsin F. beschleunigte Heilung dieser Therapie bei diabetischen Cornea gewickelt selbst dann, wenn nur der Limbus-Stammzellen-Kompartiment wurde transduziert. Die besten Ergebnisse wurden mit einer kombinierten Behandlung erhalten. Für mögliche Patienten Transplantation von normalisierten Stammzellen ist ein Beispiel auch der optimizati vorgestelltauf der Gen-Transduktion in Stammzell-angereichertem Kulturen unter Verwendung von polykationischen Verstärker. Dieser Ansatz kann nützlich sein, nicht nur für die ausgewählten Gene sondern auch für die anderen Mediatoren von cornealen epithelialen Wundheilung und Zellfunktion stammen.
Introduction
Die diabetische Hornhauterkrankung führt vor allem zu degenerativen epithelialen (Keratitis) und Nerven (Neuropathie) ändert. Es wird oft von den Anomalien der epithelialen Wundheilung und Hornhautnerven Reduktion 1-4 manifestiert. Schätzungsweise 60-70% Diabetiker haben verschiedene Hornhautprobleme 1,3. Unsere Studien haben mehrere Markerproteine mit veränderten Expression in humanen diabetischen Augenhornhaut einschließlich der Herunterregulation von c-met-Protoonkogen (Hepatozyten - Wachstumsfaktor - Rezeptor) und die Aufregulation der Matrix - Metalloproteinase-10 (MMP-10) und Cathepsin F 5, identifiziert 6. wir haben auch deutlich verringerte Expression von mehreren putative epitheliale Stammzellmarkern in den humanen diabetischen Cornea dokumentiert.
In den früheren Studien haben wir ein adenovirales basierten Gentherapie zur Normalisierung der Pegel von Diabetes-altered Markern unter Verwendung von humanen diabetische korneale Organkultursystem entwickelt, das langsame Wundheilung zeigt, diabetischeMarker Änderungen und die Expression Zellmarker Reduktion Stammzellen ähnlich wie die ex vivo Cornea 7,8. Diese Persistenz der Änderungen angezeigt 9 aufgrund der Existenz von epigenetischen metabolischen Speicher sein. Dieses Kultursystem wurde weiter verwendet für die Gentherapie. Die Ziele für diese Therapie wurden entweder mit reduzierter Expression bei diabetischen Cornea (c-met proto-Onkogen) oder erhöhte Expression (MMP-10 und Cathepsin F) aus Markern ausgewählt.
Das Adenovirus (AV) Therapie wurde in den gesamten Orgel kultivierten Cornea oder der korneoskleralen peripheren Limbus Raum nur verwendet. Dieses Fach beherbergt Stammzellen epithelialen, die das Hornhautepithel erneuern und sich aktiv an der Wunde 4,10-15 Heilung teilnehmen. Hier Protokolle werden für normalen und diabetischen menschlichen Cornea-Organkultur, epitheliale Wundheilung, Isolierung und Charakterisierung von Stammzellen angereicherte Limbus Zellkulturen und adenoviralen Zelle und korneale Transduktion vorgesehen. UnserErgebnisse zeigen die Machbarkeit dieser Therapie für Markerexpression zu normalisieren und bei diabetischen Cornea für mögliche künftige Transplantation Wundheilung. Sie legen auch nahe , dass die Kombinationstherapie die wirksamste Weg ist , 16-18 normalen Markierungsmuster und Epithelheilung in der diabetischen Cornea wiederherzustellen.
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Protocol
Nationale Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) geliefert Zustimmung post-mortem gesunden und diabetischen menschlichen Augen und Augenhornhaut. NDRI des menschlichen Gewebes Sammlung Protokoll wird durch den Führungsausschuss und nach National Institutes of Health Aufsicht genehmigt. Diese Forschung wurde im Rahmen der genehmigten Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) befreit Protokoll EX-1055 durchgeführt. Collaborating Hornhautchirurgen, Drs. E. Maguen und Y. Rabinowitz, geliefert Verwerfungs korneoskleralen Felgen für die Isolierung von Stammzell-angereichertem Hornhautepithels Kulturen. Diese Forschung wurde im Rahmen der genehmigten IRB-Protokoll Pro00019393 durchgeführt.
1. Die menschliche Hornhautorgankultur
Hinweis: Normal und diabetischer Cornea oder ganze Augen werden in gekühlten Cornea - Speichermedium erhalten (zB Optisol GS) innerhalb von 48 Stunden nach dem Tod von der nationalen Anbieter NDRI.
- Entfernen Sie die Cornea aus Containerlager mit einer Pinzette und waschen Sie sie zweimal in das Antibiotikum-Antimykotikum (ABAM) Mischung. Bei ganzen Augen, schneiden Sie die Cornea aus den Kugeln mit einer gebogenen Schere. Lassen Sie mindestens 5 mm konjunktivaler Felge und auch die Cornea in ABAM waschen.
- Bereiten Sie die Mischung in der Hornhaut Konkavität angeordnet werden. Es besteht aus serumfreiem essentiellem Minimalmedium (MEM), enthaltend ABAM, 1 mg / ml Kalbshaut-Kollagen (aus einer Stammlösung von 10 mg / ml in 0,1 N Essigsäure hergestellt), 1% Agar, und Insulin-Transferrin-Selenit Ergänzung 7.
- Mikrowellen diese Mischung für die Sterilisation und Agar Auflösung zum Sieden. Es kann bis zu 1 Minute dauern, alles zu lösen. Lassen Sie die Rohrkappe teilweise offen, weil die Mischung leicht überläuft, wenn es kocht. Aus diesem Grund können mehrere siedendem Zyklen benötigt werden, die jeweils für 10-15 sec. Abkühlen der Mischung auf 37-39 ° C.
- Legen Sie die Cornea epithelialen Seite nach unten in sterile 60-mm-Schalen. Füllen Sie die Hornhaut Höhlung mit etwa 0,5 ml der Mischung in 1.2 beschrieben. DasMischung verfestigt sich auf die Hornhaut innerhalb von 2 min.
- Legen Sie die Cornea - Agar - Seite nach unten in sterile 60-mm - Schalen und fügen Sie den vollständigen Medium , das MEM mit ABAM und Insulin-Transferrin-Selenit Ergänzung 7 (37 ° C) zu halten sein Niveau in etwa auf dem Limbus für Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche Kultur. Das Medium Volumen 7-8 ml pro Schale.
- Die Schalen werden mit den Hornhäuten in einem 5% CO 2 Inkubator mit einer Wasserwanne befeuchtete (diese Weise Feuchtigkeit auf oder über 95% gehalten) bei 35 ° C (normale Hornhauttemperatur). 100 l Medium (zwei Tropfen) täglich auf dem Epithel der Hornhaut zu befeuchten.
- Überwachen Sie die Hornhautmorphologie und die epitheliale die Lebensfähigkeit der Zellen mikroskopisch unter Durchlicht ein Standardmikroskop mit einem 4X-Objektiven verwendet. Tun Sie dies einmal pro Tag.
- Ändern Sie das Medium alle drei Tage. Die Cornea kann für mindestens 3 Wochen kultiviert werden. Für die Gentherapie Experimente, Kultur die Hornhäute für 3-5 Tage, dann TRANSDUCe mit Genen von Interesse (4,1-4,4), lassen für weitere 3-5 Tage auf dem Transgen und unterliegt dem Protokoll Wundheilung abhängig (2,1-2,4).
2. Epithelial Wundheilung
Anmerkung: In den diabetischen Cornea, die epitheliale Debridement durch mechanisches Abkratzen nicht möglich ist, da die zerbrechliche Epithelbasalmembran in dem Prozess abgetrennt wird, das nicht in den normalen Cornea geschieht. Somit sind die normalen und diabetischen Cornea unter ähnlichen Bedingungen der Wundheilung zu halten, chemische Entfernung des Epithels mit n-Heptanol 19 verwendet. Dieses Verfahren entfernt das Epithel, aber hinterlässt eine intakte Basalmembran in den normalen und diabetischen Augenhornhaut.
- Zentrale epithelialen debridement 20, legen Sie einen 5 mm Filterpapierscheibe in n-Heptanol auf der zentralen Hornhautvorderfläche 75 Sekunden lang getränkt auszuführen.
- Entfernen Sie den Filter und waschen Sie die Cornea in voller Medium. Füllen Sie die Vertiefung mit 0,5 ml Agar-KollagenMischung und Kultur wie in 1.4. Nach Debridement sterben die Epithelzellen in der Regel und abzustreifen Zurücklassung mikroskopisch intakten Basalmembran 7.
- Verwenden Sie 8,5 mm Scheiben größeren epitheliale Wunden in den Experimenten zu schaffen, mit nur Limbus Gentherapie. Dadurch wird die Einbindung der Limbus-Stammzellen in den Heilungsprozess zu gewährleisten.
- Überwachen Sie die Hornhautheilung mikroskopisch. Machen Sie Fotos mit 4x und 10x täglich, bis der Epitheldefekt vollständig geheilt ist. Der Heilungsprozess kann von 2 bis 15 Tage dauern, je nach Zustand (normal oder Diabetiker) und Wundgröße.
Hinweis: Während des Heilungsprozesses, schwarze Spinne-ähnliche Zellen werden am oberen Brennebene beobachtet. Diese Zellen sind apoptotische Stromatumoren Keratozyten , die nach der epithelialen Entfernung 4 starben. Die Heilung wird bestimmt , vollständig zu sein , wenn diese toten Zellen überwuchert von der Heilung Epithel sind und nicht mehr sichtbar sind (Abbildung 2, Einschub). - Nach der HeilungAbschluss, schneiden Sie die Cornea in der Hälfte, betten sie in OCT - Verbindung und Verfahren zur indirekten Immun auf Cryostatschnitten oder für Western - Blots 16,21.
3. Isolierung von Limbale Zellen und Pflege von Stammzell-angereichertem Kulturen
Hinweis: Bereiten Sie den primären Limbus epithelialen Stammzellen (LESC) angereicherter Kulturen von den korneoskleralen Felgen. Die Felgen kommen von gesunden Spendern und verworfen nach Hornhauttransplantationen aus der Zusammenarbeit Chirurgen in der Standard - Cornea - Speichermedium (zB Optisol) empfangen werden. Ansonsten können die LESC angereicherten Kulturen von den Felgen von normalen und diabetischen ganze Hornhaut exzidiert erhalten werden oder Globen von NDRI in der Hornhautspeichermedium empfangen wird.
- Wenn die ganze Hornhaut oder Kugeln verwendet werden, zuerst die Limbus-Bereiche zu isolieren. Um dies zu tun, legen Sie die Hornhaut auf einer sterilen Plastikschale mit epithelialen Seite nach oben und entfernen Sie den zentralen Bereich mit einem 9-mm Trephine (Kreishornhautmesser).Entsorgen Sie diesen zentralen Teil. Dann auszuschneiden die Limbuszone einen 13 mm trephine verwenden und den äußeren konjunktivaler Teil verwerfen. Zur Isolierung Zellen verwenden, um die Bagel-like Limbus Felge. Vor der Zellisolierung, entfernen Sie die Endothelzellen und anhaftende Reste der Iris von der Innenseite der Hornhaut gegenüber der Oberfläche Epithel mit einem sterilen Wattestäbchen.
- Isolieren Limbus Zellschichten mit Dispase Behandlung. Inkubieren jeder korneoskleralen Felge mit 2,4 U / ml Dispase II in 1,5 ml Keratinozyten serumfreiem Medium (KSFM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C für 2 Stunden 22 ergänzt.
- Sanft Leichtigkeit der Felge unter einem Sezieren Stereomikroskop mit einer Pinzette die Limbus-epithelialen Zellschicht ab und die Zellen in 1 ml 0,25% Trypsin distanziere - 0,02% EDTA-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen in 10 ml Medium (zB Epilife) und pelletieren sie bei 300 xg in einer Tischzentrifuge für 5 min bei Raumtemperatur.
- resuspendieren the Zellen in Kulturmedium: Medium mit N2, B27 und menschliches Wachstums Keratinozyten Ergänzungen und 10 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF).
- Samen der Zellen bei 3.000-5.000 Zellen / ml in Fläschchen oder 60 mm - Schalen überzogen mit einem Gemisch aus humanen Basalmembranproteine einschließlich Fibronectin, Typ IV Collagen und Laminin (FCL) bei 0,5-1 & mgr; g / cm 2, in der KSFM Mittel.
- Kultur der Zellen in einem befeuchteten (95% oder höherer Luftfeuchtigkeit) CO 2 Inkubator bei 37 ° C , bis sie bilden vollständig konfluenten Monolayern. Dies kann 1-2 Wochen dauern.
Hinweis: Sie regelmäßig die Zellidentität durch positive immunzytochemische Färbung bestätigen für mutmaßliche LESC Marker einschließlich PAX6, Keratin (K) 14, K15, K17 und ΔNp63α. Die Färbung Details einschließlich der primären Antikörper wurden 8,16-18,22 veröffentlicht. - In den Durchgang der konfluenten Zellen, behandeln sie mit 1 ml 0,05% Trypsin-Lösung (1: 5 Verdünnung der 0,25% ige Lösung) für 10 min bei 37 ° C. 5 ml Soja trypsin Inhibitorlösung (10 mg / ml), verdünnt 1: 4 in einem Medium und Zentrifugation der Zellen, wie in 3.5.
- Wasche das Zellpellet in 3 ml verdünnter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor-Lösung. Platte der Zellen auf FCL-beschichteten (siehe 3.7) Gerichte oder Glaskammer gleitet auf 2 x 10 4 Zellen / ml.
4. adenovirale Transduktion von Orgel-kultivierten Hornhäute
Hinweis: Die rekombinanten Adenoviren (AV) umfassen AV-Vektor (kein Gen eingefügt), AV-CMET (mit c-Met - Gen offene Leserahmen), AV-shM10 (mit shRNA zu MMP-10) und AV-SHCF ( mit shRNA zu Cathepsin F). Sie sind E1 / E3-deletierten Typ 5 AV-Gene unter der Kontrolle des Major Immediate Early-Cytomegalovirus-Promotor exprimiert. Die AV-CMET Viren werden mit AV - Vektor - Auflage- / CMV / V5-DEST 16 erzeugt. Die AV-shRNA-Viren sind speziell durch Subklonierung von shRNA-Sequenzen zusammen mit hH1 Promotor und GFP-Tag-Sequenz von iLenti-EGFP Vektor in eine vermehrungsunfähige (-E1 / -E3) huma erzeugtn AV - Typ - 5 - Genom mit Adeno-4 - Expressionssystem 17.
- Transduzieren ein organ kultiviert Hornhaut eines jeden Paares mit AV Vektor und ein anderes Hornhaut, mit einem Gen-Expression-modulierenden AV. Verwenden , um die AV-CMET bei 0,8 bis 1,25 x 10 8 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro Cornea in Kulturmedium für 48 Stunden bei 37 ° C die Kornea unter der Oberfläche des Mediums zu halten jeweils in eine Vertiefung einer Schale mit 24 Vertiefungen. Verwenden Sie die AV-shRNA - Viren bei 1-2 x 10 8 pfu pro Hornhaut.
- Verwenden Sie die Viren für die Transduktion in voller Medium, das mit 75 ug / ml Sildenafil Citrat. Dieses Reagenz aktiviert die Caveolin Transport 21 viral Aufnahme durch die Epithelzellen zu ermöglichen. Aufgrund später kurze Halbwertszeit von Sildenafil in wässrigen Lösungen, erneut hinzufügen die gleiche Menge auf das Medium 4-5 Std. Die Standardbehandlung ist für 48 Stunden.
- Übertragen Cornea zu neuen Gerichten mit einem runden Ende sterilen Spatel und Kultur im Medium ohne AV den mittleren Pegel am Limbus zu halten. Nach dem Additional 4-8 Tage an der Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche, verarbeiten die AV-behandelten Hornhäute für verschiedene Analysen oder Tests für epitheliale Wundheilung (siehe oben). Befeuchten Sie regelmäßig die Hornhaut während der Kultur von 100 ul Medium Zugabe (zwei Tropfen) auf der Hornhaut.
- Für die Transduktion der Limbus-Zellen nur inkubieren die Viren mit den Cornea an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche mit mittlerem Pegel am Limbus, Transduktion des zentralen Epithel zu vermeiden.
5. adenovirale Transduktion von Cultured Limbale Zellen
- Pflegen Sie die LESC angereicherten Kulturen im Medium mit 10 ng / ml EGF (siehe 3.5) auf Plastikschalen mit dem FCL Mischung beschichtet mit 0,5 g / cm 2.
- Transduzieren kultivierten Zellen, die 70-80% Konfluenz mit dem AV erreicht haben, das grün fluoreszierende Protein-Gen (AV-GFP) oder den AV-verschlüsselten shRNA-GFP in einem Bereich von Multiplizität der Infektion (MOI: 1-300 pfu / Zelle) beherbergen im Medium mit 2 ng / ml EGF. Führen Sie die transduction für 4 h bei 37 ° C in einem minimalen Volumen (0,2 ml), gefolgt von 20 Stunden in 0,5 ml Medium. Der Caveolin Transport Aktivator Sildenafil ist nicht für die Zellkultur Transduktion benötigt.
- Verwenden eines der folgenden Reagentien, die die AV-Bindung an der Zelloberfläche ermöglichen die AV Transduktionseffizienz zu erhöhen: entweder Polykationen (1 ug / ml poly-L-Lysin oder 5 & mgr; g / ml Polybren) oder 6 & mgr; l / ml Transduktion Reagenz ( Beispiel ViraDuctin) oder 20 & mgr; l / ml Transduktion Enhancer (zB ibiBoost).
- Nach dem Austausch des Mediums für das eine ohne das AV inkubieren gezüchteten Zellen für 4 Tage in der befeuchteten CO 2 -Inkubator und GFP - Expressionsniveau mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
- Verwenden Sie die Kratzer Wundheilung Assay Zellmigration in den AV-transduzierten Kulturen zu bewerten. Wachsen die Zellen in den Multi-Well-Kammer gleitet. Nehmen Sie die Wunden in einer Monoschicht von Zellen in einer geraden linearen Bewegung mit einer 200 & mgr; l pi KratzenPette Spitze. Nach der Verwundung, ändern Sie das Medium für ein frisches der abgelösten Zellen zu entfernen.
- Fotografieren Sie jeden Tag die Wunden mit einer Digitalkamera auf einem inversen Mikroskop befestigt mit 4-facher Vergrößerung. die Zeit aufzeichnen, wenn die Heilung abgeschlossen ist (die Wundränder in Berührung kommen, entlang der gesamten Wunde).
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Representative Results
Wir haben , daß die Unterschiede in der Expression von diabetischer Marker (zB Basalmembranproteine und Integrin α3β1) und Wundheilung zwischen den normalen und diabetischen Hornhäute werden erhalten in den Hornhautorgankulturen zuvor gezeigt. Dieses Kultursystem wurde gerichtet auf die Gentherapie unterzogen, um die Niveaus von diabetes-altered Marker Normalisierung, c-Met, MMP-10 und Cathepsin F.
Wenn das gesamte Hornhautepithel mit dem AV-CMET transduziert wurde, oder AV-shRNA zu MMP-10 oder Cathepsin F (getrennt oder in Kombination) wurde die epitheliale Wundheilung erheblich schneller abgeschlossen (P <0,03 durch gepaarte Student t-Test im Vergleich zu AV-Vektor) als in den AV-Vektor-transduzierten Kerl Cornea von den gleichen Spendern 16,17. Der AV-CMET reduziert die Heilungszeit um die Hälfte, die nicht wesentlich von der Heilung der normalen Cornea unterschied sich (Figure 1). Der AV-shM10 und AV-SHCF hatte geringere Wirkung. Allerdings ist eine Kombination aus dem AV-CMET mit dem AV-shM10 und AV-SHCF (Combo) produziert die stärkste Wirkung vollständig die Epithelheilung Zeiten (Abbildung 1) zu normalisieren. Diese Verringerung der Heilungszeit wurde von den normalisierten Muster von diabetischen (Basalmembran und Integrin) begleitet und Zellmarker in den diabetischen Cornea 8,16,17 einzudämmen.
Die epithelialen Stammzellen sind die großen Wunde Teilnehmer Heilung 4. Daher untersuchten wir, ob Limbus Gentherapie die Stammzellkompartiments Targeting für den diabetischen Cornea von Vorteil wäre. Zu diesem Zweck wurden nur die Limbus-Teile der diabetischen Cornea transduziert durch die AV-CMET oder Combo und große, 8,5 mm Wunden wurden erstellt. Der AV-CMET transduzierten Cornea deutlich schneller (P <0,001 durch gepaarte Student t - Test) als die AV-Vektor transduziert Kerl Cornea (Abb geheilture 2). Die Combo - Behandlung führte zu dem gleichen Ergebnis 18. Die Gentherapie erhöht die Expression von Diabetes unterdrückter Marker, wie Integrin α3β1 und Basalmembran Komponente Nidogen-1 (Abbildung 3, links Spalten, Combo). Wichtig ist , wie in der gesamten Hornhaut Transduktion 8,17, die Limbus - Gentherapie entweder mit dem AV-CMET oder Combo führte zu einer deutlich erhöhten Expression der putativen LESC Markern einschließlich K15 und ΔNp63α, im Vergleich zu den AV-Vektor transduziert Cornea (Abbildung 3 , rechte Spalte, beide c-met und Combo). Diese Daten unterstützten die Rolle der Stammzell Normalisierung in der beschleunigten Wundheilung bei der Gentherapie von diabetischer Cornea und zeigen die Durchführbarkeit der Ansatz für die Behandlung von diabetischen Hornhauterkrankung.
Wir begannen als nächstes die Gentherapie Effekte auf kultivierte LESC angereicherte Limbus Epithelzellen zu untersuchen. die Kulturenvon normalen und diabetischen wurden Limbus Epithelzellen für mutmaßliche LESC Marker etabliert und gefärbt. Viele Zellen positiv gefärbt (Abbildung 4). Die Färbungsintensität in den diabetischen Kulturen war durchweg schwächer als in normalen Kulturen (K15 als ein Beispiel in 4 gezeigt ist ), die 8 in der diabetischen vs. normalen ex vivo Kornea auf die Situation sehr ähnlich war. Diese Experimente die erhaltenen Zellkulturen als geeignet für die Gentherapie validiert.
Vorversuche mit einer Telomerase-immortalisierten cornealen epithelialen Zelllinie (siehe 23) zeigte , dass die Zellen durch die verfügbaren AV - Konstrukte leicht transduziert wurden (Daten hier nicht gezeigt). Jedoch erwies sich die primären Limbus Kulturen viel empfindlicher auf die Virusbelastung und / oder die Transduktion Reagenzes erfordert eine Optimierung der Transduktion Protokolls. Die kultivierten Limbus Zelltransduktion durchdie AV-GFP (Abbildung 5) hing von der Vielzahl der Infektion (MOI, Bereich 30-300 pfu / Zelle) in einem recht hohen Niveau der Transduktion bei hoher MOI (GFP - Expression in> 80% der Zellen) führt. Allerdings waren die höheren MOI auch giftig, verursacht Zelltod oder stark beeinträchtigt die Zellmigration in die Kratzwunden nach 3-4 Tagen der Transduktion (Abbildung 6). Am unteren MOI (10-30 PFU / Zelle), der AV-Transduktion erzeugt weniger oder keine zytotoxische Wirkung, sondern führte zu einer verringerten Anzahl der GFP-exprimierenden Zellen (5-15%).
Wir haben versucht, die nächste Transduktionseffizienz zu steigern ohne Reagenzien durch Verwendung von Transduktion verbessernden die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen, die im allgemeinen die AV-Bindung an der Zelloberfläche ermöglichen. Sie zeigten unterschiedliche Effizienzsteigerungen in der Limbus-epithelialen Zelltransduktion durch die AV bei MOI 30.10. Beide Polykationen, Poly-L-Lysin und Polybren, waren nicht toxisch und die effektivstein 3-4 fachen Anstieg in der Zahl der GFP-positiven Zellen resultierenden (7, obere Reihe). ibiBoost war auch wirksam , aber leicht toxisch und ViraDuctin unwirksam war und ziemlich giftig (Abbildung 7, untere Reihe). Deshalb bieten Polykationen sichere und effiziente Weise interessierende Gen-Expression auf den AV-Transduktion zu steigern und sollte für die Genexpression und Wundheilungs Experimente verwendet werden.
Abbildung 1: c-Met Gentransduktion führt zu deutlich Hornhautepithels Wundheilungszeit (Mittelwert ± SEM) verringert. Darüber hinaus kombiniert die Gentherapie (Combo) mit AV Beherbergung c-Met - Gen und shRNAs zu MMP-10 und Cathepsin F Gene normalisiert vollständig epithelialen Wundheilungszeit. Signifikanz (p-Werte) wurde durch gepaarte Student t-Test im Vergleich mit JEWEILIGEN etabliert e Vektor-Behandlungen. Die Balken stellen den Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Heilung von 8,5 mm epithelialen Wunden in einem Paar von diabetischer Cornea. Obere Reihe, Vektor-transduzierten Hornhaut; Heilung ist in 8 Tagen abgeschlossen. Untere Reihe, AV-CMET Kerl Cornea transduziert; Heilung ist in 5 Tagen abgeschlossen. Die Pfeile zeigen Wunde (W) Rand. *, Nicht geheilt Teil (auch bei hoher Vergrößerung als Einschub gezeigt), mit den spinnenförmige apoptosed Stromatumoren Keratozyten. Sie sind sichtbar, bis die Epithelschicht auf ihnen wächst. Bar = 50 & mgr; m. Phasenkontrast. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Immunfärbung von diabetische korneale Abschnitte für verschiedene Marker nach Limbus Gentherapie. Beide AV-CMET und Combo-Behandlungen führen zur Behandlung des diabetischen Markern (Integrin α3β1 und Nidogen-1) und mutmaßliche Stammzellmarker (K15 und ΔNp63α) deutlich erhöht Limbus Färbung in. Pfeile auf Nidogen-1 Platten markieren Hornhautepithels Basalmembran. Bar = 30 & mgr; m. e, Epithel; s, Stroma. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: immunzytochemische Färbung von primären Limbus Epithelkulturen für ein mutmaßliches K15 LESC Marker. Obere Reihe, normal Kultur; die meisten Zellen show eine starke Färbung für K15. Untere Reihe, diabetische Kultur; die meisten Zellen zeigen nur eine schwache Färbung. Die richtigen Platten sind mit DAPI Kern Gegenfärbelösung vorgestellt. Normalen und diabetischen Zellen wurden mit gleicher Belichtungszeit fotografiert. Bar = 20 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Das Niveau der GFP-Expression in transduzierten Limbus Epithelzellen hängt von MOI von AV-GFP: (a) 30 pfu / Zelle; (B) 120 PBE / Zelle; (C) von 300 pfu / Zelle an 3 Tagen nach der Transduktion. Fotografien von lebenden Zellen sind dargestellt. Bar = 300 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Die Zellmigration wird negativ beeinflusst durch die Konzentration von AV - Erhöhung wie Kratzwunde Test ergab: (a) Kontrolle; (B) 20 pfu / Zelle; (C) 80 pfu / Zelle; (D) 120 PBE / Zelle. Fotografien von lebenden Zellen sind dargestellt. Bar = 500 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Limbale epithelialen mit AV-GFP transduzierte Zellen bei 30 pfu / Zelle. (A) Kontrolle; (B) Poly-L-Lysin; (C, d) transduction Reagenz; 5 Tagen nach der Transduktion. Transduction Reagenz caused einen signifikanten zytotoxischen Effekt führt zu Zellabrundung und Tod (d, Phasenkontrast). Fotografien von lebenden Zellen sind dargestellt. Bar = 400 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Hornhaut wird aufgrund seiner Oberflächenstelle ein ideales Gewebe für die Gentherapie, wo die Genübertragung, sowie die Bewertung der Wirksamkeit und Nebenwirkungen, einfach sind. Allerdings ist eine klinische Umsetzung dieser leistungsstarken Ansatz immer noch langsam aufgrund knappen Informationen über die genetischen Ursachen der Erkrankungen der Hornhaut und der Gentherapie Targets 24. Diabetische Komplikationen Hornhautveränderungen einschließlich können in der Natur weitgehend epigenetische sein, die 9 in metabolischen Speicher übersetzt. Aus diesem Grund erhalten die diabetischen Geweben und Zellen ihre Anomalien ex vivo und können in der Organ- und Gewebekultur untersucht werden. Diabetes verursacht auch, spezifische Änderungen in der Genexpression und Muster, die durch die Gentherapie korrigiert werden. Wir haben mehrere Marker in der diabetischen Hornhautepithel einschließlich der Stammzellkompartiments 5,6,8 verändert identifiziert und verwendet , um die menschliche Hornhautorgankulturen 7,8 zu normalisierenGentherapie die Markerexpression und epitheliale Wundheilung in der diabetischen Hornhaut beeinträchtigt.
Wir haben die AV als Genabgabevehikel wegen seiner starken Transgen - Expression ausgewählt, dessen nicht-integrierenden Natur und seine Selektivität für Epithelzellen, welche Eigenschaften besser als die des adeno-assoziierten Virus (AAV) 25. Die AV-Transduktion der Hornhautorgankulturen hat mehrere wichtige Schritte. Die Corneas sollte innerhalb von 48 Stunden post mortem an das Labor geliefert werden, um den Verlust von Epithel zu minimieren, die während der Lagerung auftritt. Um die Virusaufnahme zu erhöhen, ist es wichtig Caveolae Transportverstärker, wie Sildenafil, während Transduktion 21 hinzuzufügen. Wenn die Validierung der Transduktion Wirkung auf die Proteinexpression, die Verwendung von mehreren Markierungen empfohlen (Abbildung 3), als spezifische Stammzellmarker nicht endgültig identifiziert. Wenn die epitheliale Wunden zu machen, gibt es eine Notwendigkeit, die che zu verwendenmical debridement aufgrund der Fragilität der diabetischen Membran epithelialen Keller in seiner Ablösung während der manuellen Schaben zur Folge hat. Eine sorgfältige tägliche Überwachung des Heilungsprozesses wird mit objektiven Kriterien der Heilung, wie das Verschwinden von toten subepithelialer Keratozyten aus Sicht erforderlich , wenn das Epithel über sie nachwächst (Abbildung 2). Schließlich aufgrund einiger AV und / oder GFP Toxizität zu den primären Limbus Zellen ist es wichtig , die virale Dosis zu senken, die gleichzeitig nicht-toxische Transduktion Booster verwendet, beispielsweise Polykationen, um sicherzustellen , effiziente und sichere transduction (Figuren 5 - 7).
Das Gen-Therapie-System kann das Tier organ kultiviert Cornea zu verwenden, modifiziert werden. Sie sind viel billiger als Mensch, kann in Mengen auf einer regelmäßigen Basis erhalten werden und kann für das Screening, beispielsweise der Wundheilung modulierenden Medikamente geeignet sein. Allerdings bieten die menschliche Cornea potenziell breitere Möglichkeiten fürdie Studie aufgrund der Fülle von Reagenzien, insbesondere Antikörper. Im Falle der Wirkstoff-Screening in nicht-diabetischen Tierhornhaut kann die Débridement mechanisch erfolgen. Wenn ein Antikörper für einen bestimmten Marker nicht gut in einigen menschlichen Cornea nicht funktioniert, kann es aufgrund der individuellen Variabilität und / oder Dauer der Erkrankung oder des Schweregrads sein. In diesem Fall prüft andere Marker können empfohlen werden. Die Fähigkeit von n-Heptanol um die Zellen zu entfernen, kann im Laufe der Zeit deutlich zu verringern, möglicherweise aufgrund der Oxidation während der Lagerung. Wenn dies geschieht, wird eine neue, zuvor ungeöffneten Ampulle müssen verwendet werden. Wenn die Arbeit mit den teuren menschlichen Hornhaut kann eine zweite Runde von debridement versucht werden. Sildenafil hat eine kurze Halbwertszeit in wässrigen Lösungen; Daher muss jedes Mal frisch eine Hornhaut Transduktion hergestellt werden durchgeführt. Der Erfolg der Limbus-Kultivierung von Zellen kann auf dem Spenderalter abhängen; die Zellen von jüngeren Spendern in der Regel besser wachsen. Ein einzelnes Gen-Therapie Mittel kann kein Signif entlockenicant Wirkung; in diesem Fall kann eine Kombination solcher Mittel sein , optimal 17. Wenn die primären Hornhautzellen Anzeichen von Toxizität zeigen, ist es wichtig , die virale und Polykation (beispielsweise Poly-L-Lysin) dosiert zu minimieren toxische Wirkung beim Konservieren effiziente Transduktion zu senken.
Obwohl diabetische Organkulturen viele Anzeichen der Krankheit und veränderte Genexpression reproduzieren, sind sie denervierten und die Lieferung von Immunzellen fehlt, was die Wundheilung beeinträchtigen kann und Stammzellen. In dieser Hinsicht können die Tiermodelle einige Vorteile bieten, obwohl die Tiere nicht das gesamte Spektrum der menschlichen Krankheitszeichen zu reproduzieren. Die anderen Gentherapie Ziele gibt, die effizient diabetischen Cornea normalisieren. Ein Beispiel für solche Ziele können microRNA, speziell, mir-146a oder mir-424 23 sein. Die Kombinationen der verwendeten Zielgen Modifikationen mit der Hemmung der spezifischen microRNA kann möglicherweise eine stärkere positive Wirkung erzeugen. another Einschränkung schließt die Notwendigkeit einer relativ langen Inkubation der Hornhaut mit der topisch verabreicht AV (beispielsweise in Form von Augentropfen), um eine maximale Virusaufnahme zu gewährleisten. Dies kann ein Problem in der Klinik stellen, obwohl die Augenlider Abkleben in Verlängerung der Inkubation unterstützen könnte. Die Verwendung einer niedrigen Konzentration von Sildenafil in der viralen Lösung könnte die AV-Aufnahme zu beschleunigen. Die AV-Übertragungs Effekt ist vergänglich, die die heilende Potenzial des AV-basierten Gentherapie kann begrenzen. Obwohl es lange genug dauert die diabetische Wundheilungs Abschwächung zu korrigieren, anhalt Normalisierung der epithelialen Stammzellen kann eine länger anhaltende Wirkung erforderlich ist , wie zum Beispiel 24 durch das AAV-basierten Gentherapie bereitgestellt. Es sollte erwähnt werden, dass die Immunogenität ein schwerwiegender Nachteil der frühen AV-Vektoren war. Allerdings sind die neue Generation der rekombinanten AV einschließlich "feigen" Viren dieser Nebenwirkung weitgehend frei, erhöhen ihre Chancen des Seins potent translational Gentherapie Fahrzeuge 26.
Kleinmolekül - Modulatoren von verschiedenen Wegen , die für die Wundheilung wichtig sein kann 16,17,21, 27-30 sind in den experimentellen Modellen und der Klinik verwendet. Sie sind jedoch nicht auf einen spezifischen Zelltyp gerichtet, können unterschiedliche Wirkungen in unterschiedlichen Zellen und kann nur auf einige Aspekte der diabetische korneale Erkrankung 31,32 wirken. Die Gentherapie bietet eine Möglichkeit , die Genexpression in einer gewünschten Richtung in spezifischen Zellen zu ändern, die wir in dieser Arbeit erreicht die Epithelzellen Transduktion unter Verwendung von sowohl Genüberexpression (c-Met) und silencing (MMP-10 und Cathepsin F). Dieser Ansatz ermöglicht auch die Expression von spezifischen Krankheitsmarkergene modulieren, einzeln oder in Kombinationen 5,6. Unsere Experimente haben gezeigt, dass auch bei Kombination von drei verschiedenen AVs Genexpressions Modulatoren beherbergen, alle drei Gene betroffen waren, wie erwartet, und dieBehandlung war effizienter als wenn jeder AV wurde allein 17 verwendet.
In schweren diabetischen Keratopathie mit persistierendem Epithelfehler oder unvollständige Epithelheilung auf Vitrektomie oder Laser-Photokoagulation, ein Ersatz von dysfunktionalen Limbusstammzellen eine Alternative zur Gentherapie sein. In diesen Fällen kultiviert und limbalen Epithelzellen auf Gentherapie in vitro expandierten kann auf den erkrankten Hornhaut transplantiert werden. Unsere Daten zeigen , dass kultivierte Limbus - Zellen aus den diabetischen Cornea zeigen ähnliche Unterschiede in der Stammzellmarker Ausdruck als ex vivo Cornea sie gute Ziele für die Gentherapie zu machen. Allerdings muss diese Behandlung optimiert werden, aufgrund der hohen Empfindlichkeit solcher Zellen an der Viruslast und Transfektionsreagenz verwendet. Wir konnten zeigen, dass die kationischen Transfektionsreagenzien effiziente und sichere Lieferung mit hoher Expression eines Gens von Interesse in der kultivierten diabetischen Hornhautepithel gewährleistet. Tiese Ergebnisse können den Weg für eine erfolgreiche Gentherapie in vitro erweitert LESC für die zukünftigen Transplantationszwecke in Fällen von schwerer diabetischer Keratopathie ebnen. Weil erblichen und erworbenen Mangel LESC auch mit der Reduzierung der Hornhautnerven ähnliche Diabetes 33,34, die Transplantation von gesunden LESC angereicherten Kulturen auf die erkrankte Hornhaut könnte möglicherweise lindern die diabetische corneale Neuropathie sowie assoziiert ist.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
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