Abstract
أثناء العمليات الجراحية الترميمية العظام، يتم تحميل كميات supraphysiological من عوامل النمو تجريبيا على السقالات لتعزيز نجاح الاندماج العظمي. مطلوبة جرعات كبيرة من العوامل البيولوجية قوية للغاية نظرا لعامل النمو عدم الاستقرار نتيجة لتدهور الأنزيمية السريع وكذلك عدم الكفاءة الناقل في توطين كميات كافية من عامل النمو في مواقع الزرع. وبالتالي، يمكن أن الاستراتيجيات التي تطيل استقرار عوامل النمو مثل BMP-2 / NELL-1، والسيطرة على الإفراج عنهم بالفعل خفض الجرعة الفعالة، وبالتالي تقلل من الحاجة إلى جرعات أكبر أثناء العمليات الجراحية تجديد العظام في المستقبل. وهذا بدوره سوف يقلل الآثار الجانبية وتكاليف عامل النمو. تم ملفقة المتوقَّع (PECs) الذاتي تجميعها لتوفير تحكم أفضل من BMP-2 / NELL-1 التسليم عن طريق الهيبارين ملزمة وتحقيق المزيد من النمو تحفيز عامل النشاط الحيوي من خلال تعزيز الاستقرار في الجسم الحي. نحن هنا توضيح بساطة PEC تلفيق الذي يساعد في deliveراي لمجموعة متنوعة من عوامل النمو خلال عملية جراحية العظام الترميمية.
Introduction
وقد تم الإبلاغ عن حدوث فصال كاذب إلى أن تصل إلى 10-45٪ في الانصهار في العمود الفقري التنكسية ومراجعة عملية جراحية في العمود الفقري 1. للحد من معدل المفصل الموهم خلال انصهار العمود الفقري وغيرها من العمليات الجراحية الترميمية العظام، أدخلت عوامل النمو المكونة للعظم مثل BMP-2، نيل-1 1 وصفائح المستمدة عامل النمو (PDGF) لتعزيز دي نوفو تكون العظم. ومن بين هؤلاء، BMP-2 هو خيار شعبي لدمج الفقرات 2. على الرغم من أن قوة من BMP-2 في تحريض وتسهيل تكوين العظام الجديدة قد تم راسخة 3؛ لا تزال مضاعفات هامة سريريا مثل تشكيل منتبذ العظام، تورم مصلي وتشكيل ورم دموي، والاستجابة الالتهابية، التهاب الجذر، الفقري عظام النهايات الجسم، والقذف إلى الوراء لتكون من القضايا ذات الاهتمام نظرا لكميات supraphysiological المستخدمة 4،5.
لذلك، وتخفيض جرعة من BMP-2 لا يزال يمثل استراتيجية ذات الصلة في فييغري للحد من الآثار الجانبية. الى جانب ذلك، ثمة حاجة لأنظمة الناقل فعالة لقمع إطلاق سراح دفعة الأولي من BMP-2 التي لوحظت في أنظمة الإسفنج الناقل الكولاجين المعاصر وتعزيز تسليم لفترات طويلة والمترجمة من هذا خلوى قوية. طبقة تلو طبقة التجميع الذاتي للبالتناوب polyelectrolytes الموجبة والأيونية يمكن استخدامها كوسيلة من وسائل الانضباطي لبناء المجمعات متضاعف الكتروليتي على سطح المصفوفات سقالة أو المواد القابلة للزرع 6. في هذا الصدد، وقد اعترف الهيبارين (المعروف لديها أعلى كثافة الشحنة السلبية من كل العوامل البيولوجية) لربط بشوق مع مجموعة متنوعة من عوامل النمو عبر المجالات الكهروستاتيكية والهيبارين ملزمة. في الواقع، وقد تبين الهيبارين لإطالة عمر النصف، وبالتالي تحفيز النشاط الحيوي لعدة عوامل النمو.
وبناء على هذا، تتكيف مجموعتنا بروتوكول التجميع الذاتي طبقة تلو طبقة اختلاق مجمع متضاعف الكتروليتي القائم على الهيبارين (PEC) أن الأحمال ويحافظ على bioactivities من عوامل النمو المكونة للعظم خلال تجميد 7،8. كانت ملفقة جوهر ميكروبيدات الجينات التي يشابك بقايا من الجينات مع ثنائي التكافؤ الموجبة الكالسيوم أو السترونتيوم أيونات α-L-guluronate (G). جوهر الجينات هو سقالة المصفوفة القابلة للتحلل. وبعد الزرع، هو resorbed في السرير الانصهار توفير غرفة لنشوب عظمي. يستخدم بولي-L-ليسين (PLL) أو بروتامين كطبقة الموجبة تشبيك مع كل من مصفوفة سقالة (في هذه الحالة، جوهر الجينات ميكروبيدات الناقل) والهيبارين سالبة الشحنة. في حين أن وظائف طبقة الهيبارين الأيونية لتحقيق الاستقرار وتوطين عوامل النمو تحميلها. وقد تبين طبقة ثلاثية PEC لزيادة قدرة التحميل عامل النمو في نموذج الخنازير 9. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت ناقلات PEC للحد بنجاح الجرعة الفعالة للBMP-2 بنسبة لا تقل عن 20 ضعفا في الفئران (10) ونماذج الخنازير لدمج الفقرات 8.
ntent "> هنا، ونحن التقرير أساليب افتعال المتوقَّع (PECs) لتعزيز النمو تسليم عامل في الانصهار في العمود الفقري وغيرها من العمليات الجراحية الترميمية العظام باستخدام BMP-2 كعامل نمو المكونة للعظم نموذج.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الحل الجيني
- حل 200 ملغ من الجينات الصوديوم (غير المشع) أو 400 ملغ من 8 مراد المشع الجينات الصوديوم في 10 مل من الماء المقطر المزدوج ويهز لمدة 1 ساعة لالجينات غير يشع و 15 دقيقة عن الجينات المشع. تخزين حل الجينات في 4 درجات مئوية خلال الليل. تصفية حل الجينات مع العقيمة 0.2 ميكرومتر حقنة تصفية قبل تلفيق ميكروبيدات الجينات.
2. الجيني ميكروبيدات تلفيق
- تطهير مولد حبة كهرباء وضخ حقنة مع 70٪ من الإيثانول ووضعها في الدرجة الثانية البيولوجية السلامة مجلس الوزراء (الشكل 1).
- وضع حوض زجاجي مع شريط مغناطيسي داخل مولد حبة.
- تعيين القطب ذراع مولد حبة 9 سم فوق الحوض.
- قم بتوصيل كابل كهربائي من مولد حبة لالمسمار مخرش 2 من القطب الذراع، وتصب 80 مل من SrCl 2 الحل فيحوض.
- تحميل 5 مل من 0.2 ميكرون حل الجينات التي تمت تصفيتها في أنبوب حقنة والمطاط. بعد توصيل أنبوب من المطاط إلى القطب الذراع، والتبديل على ضخ حقنة في 5 مل / ساعة لمدة 2 دقيقة لطرد الهواء داخل الأنبوب وتسليم حل الجينات إلى غيض من فوهة. إيقاف ضخ حقنة.
- بعد ذلك، التبديل على encapsulator ثم ضخ حقنة لبدء توليد ميكروبيدات. ضبط معدل تدفق الجينات في 5 مل / ساعة والجهد عند 5.8 كيلو فولت على encapsulator. تجاهل ميكروبيدات ولدت خلال أول دقيقتين (أو الأولية 0.5 مل من محلول الجينات التي تضخ من الحقنة)، كما تميل هذه ميكروبيدات أن يكون الحجم غير منتظمة وعلى شكل.
- جمع ميكروبيدات اللاحقة في محلول كلوريد 0.2 M السترونتيوم. إيقاف كل من ضخ حقنة وencapsulator (بهذا الترتيب) بعد ضخ حجم المعدة مسبقا من حل الجينات. كرر هذا لدفعات لاحقة من تلفيق ميكروبيدات. عند الانتهاء، تحويل لو ضخ حقنة أولا، تليها encapsulator.
- تخزين ميكروبيدات في 20 مل من محلول كلوريد 0.2 M السترونتيوم في 4 درجات مئوية خلال الليل لاستكمال عبر ربط وتثبيت هلام.
3. الحجم قياس ميكروبيدات الجيني
- جمع 0.5 مل من ميكروبيدات الجينات مع ماصة بلاستيكية ووضعها على شريحة زجاجية. عرض ميكروبيدات تحت المجهر الضوئي في 10X التكبير. خذ عشر صور من ميكروبيدات مع الكاميرا المجهر CCD. حفظ الصور مع شريط النطاق (500 ميكرون) في تنسيق TIFF في قرار 2048 س 1536.
- باستخدام أدوات طول في ImageJ، وقياس حجم ميكروبيدات وشريط المقياس (الشكل 2). تحويل طول ميكروبيدات من بكسل إلى ميكرومتر.
- انقر على أدوات الخط ورسم خط عبر وسط حبة الجينات.
- انقر على "تحليل" على شريط القوائم واختيار "القياس". سوف تظهر نافذة منبثقة.
- تحويل قطر حبة الجينات لطول الفعلي باستخدام الصيغة: طول حبة الجينات / طول شريط مقياس × 500 ميكرون. على سبيل المثال، 1.420 (القطر يقاس يماغيج) / 2،657 (مقياس طول شريط تقاس يماغيج) * 500 ميكرون = 267 ميكرون.
- النظر في متوسط حجم 100 ميكروبيدات (يعني ± الانحراف المعياري) كحجم تمثيلي من كل دفعة من ميكروبيدات.
4. التعقيم
- جمع ميكروبيدات باستخدام النايلون مصفاة 100 ميكرون وتغسل حبات مع الماء المقطر مزدوجة.
- باستخدام ملعقة، ونقل جميع ميكروبيدات مصنوعة من 0.1 مل من محلول الجينات في أنبوب microcentrifuge 2 مل، وتغطي مع الشاش لمنع جفاف.
- وأخيرا، تعقيم ميكروبيدات بواسطة التعقيم باستخدام وضع السائل (115 درجة مئوية، لمدة 15 دقيقة) أو وفقا للممواصفات anufacturer و. إضافة 1.5 لتر من الماء المقطر إلى غرفة لمنع حبات من التجفيف.
5. بروتامين والهيبارين طلاء
- داخل غطاء BSL-2، احتضان ميكروبيدات العقيمة مع 1 مل من 2 ملغ / مل حل بروتامين (تعقيمها باستخدام 0.2 ميكرون تصفية حقنة) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد احتضان ميكروبيدات لمدة 1 ساعة (الخطوة 5.1)، وجمع 150 ميكرولتر من الحل بروتامين للحمض bicinchoninic (microBCA) اختبار الصغير (المادة 6).
- غسل بروتامين المغلفة ميكروبيدات مرتين مع الماء المقطر مزدوجة. تدور باستمرار باستخدام أعلى مقاعد البدلاء أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، ونضح الماء باستخدام حقنة.
- احتضان بروتامين المغلفة ميكروبيدات مع 1 مل من 0.5 ملغ / مل حل الهيبارين (تعقيمها باستخدام 0.2 ميكرون تصفية حقنة) لمدة 30 دقيقة إلى إنشاء مجمع متضاعف الكتروليتي (PEC).
- بعد احتضان بروتامين المغلفة ميكروبيدات وأو 30 دقيقة (الخطوة 5.4)، وجمع 400 ميكرولتر من محلول الهيبارين لتحديد محتوى الهيبارين (المادة 7).
- بعد الحضانة، ويغسل الهيبارين غير منضم من المتوقَّع (PECs) عن طريق غسل مرتين مع الماء المقطر مزدوجة.
6. بروتامين المحتوى
- إجراء اختبار microBCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لفترة وجيزة، إضافة 150 حل بروتامين ميكرولتر (جمعها قبل وبعد الحضانة مع ميكروبيدات) في 96 لوحة جيدا. إضافة 150 ميكرولتر microBCA حل العاملة.
- استخدام محلول الزلال (0، 0.5، 1، 2، 5، 10، 20، 40 و 200 ميكروغرام / مل)، ومعايير المعايرة.
- احتضان الخليط لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية. قياس الامتصاصية مع معمل في 562 نانومتر.
- استخدام منحنى القياسية لتحديد تركيز بروتامين من كل عينة غير معروفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تحديد محتوى بروتامين من ميكروبيدات بطرح المبلغ الإجمالي للبروتامين فيحل طلاء (قبل الحضانة مع ميكروبيدات) من مبلغ بروتامين المتبقية في حل طلاء (بعد الحضانة مع ميكروبيدات).
7. الهيبارين المحتوى
- إعداد 10 مل من محلول العمل عن طريق إذابة 4 ملغ طولويدين الأزرق و 20 ملغ كلوريد الصوديوم في 0.01 N حمض الهيدروكلوريك.
- إضافة 400 ميكرولتر من عينة (من الخطوة 5.5) إلى حل العاملة في نسبة 2: 3 ودوامة لمدة 30 ثانية.
- إضافة 600 ميكرولتر من ن الهكسان (حجم يعادل الحل كاشف العمل) ودوامة الخليط لاستخراج طولويدين الأزرق مجمع الهيبارين.
- نضح 200 ميكرولتر من المرحلة المائية بواسطة حقنة بعد الانفصال المرحلة.
- قياس كمية المستخرج من الامم المتحدة طولويدين الأزرق الواردة في المرحلة المائية باستخدام معمل في 631 نانومتر.
- إعداد الحلول الهيبارين مستوى 0-20 ميكروغرام / مل.
- رسم القراءة 631 نيوتن متر من كل معيار الهيبارين مقابل تركيز الهيبارين في ميكروغرام / مل. استخدام منحنى القياسية لتحديد تركيز الهيبارين من كل عينة.
8. متحد البؤر صورة هيكل طبقة تلو طبقة
- افتعال بروتامين، الهيبارين وNELL-1 / BMP-2 التناظرية الفلورسنت CF-405 بروتامين (الأزرق)، CF 594 الهيبارين (الحمراء)، وFITC المسمى NELL-1 / FITC المسمى (الأخضر) BMP-2 + الهيبارين + بروتامين وفقا لالصانع ورقة البيانات التقنية.
- معطف 100 ميكروغرام ميكروبيدات مع 300 ميكرولتر من التناظرية الفلورسنت (طريقة الطلاء كما هو موضح في 5،3-5،6) CF-405 بروتامين (الأزرق) (2 ملغ / مل، 1 ساعة حضانة)، CF 594 الهيبارين (أحمر) (0.5 ملغ / مل، 30 دقيقة)، وFITC المسمى NELL-1 / FITC المسمى (الأخضر) BMP-2 (1.5 ملغ / مل، بين عشية وضحاها). غسل ميكروبيدات مرتين مع الماء المقطر لإزالة غير منضم بروتامين الفلورسنت، الهيبارين وNELL-1 / BMP-2.
- مراقبة هيكل طبقة تلو طبقة (الشكل 3) باستخدام مجهر متحد البؤر في التكبير 10x 7
9. BMP-2وNELL-1 امتصاص والإصدار
- تحميل 13.3 ميكرولتر من 1.5 ملغ / مل من BMP-2 أو NELL-1 حل على 100 ميكروغرام من PEC. احتضان PEC في 4 درجات مئوية تحت 30 دورة في الدقيقة اهتزاز لمدة 10 ساعة.
- تزج ميكروبيدات في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية مع ثابتة تهز (30 دورة في الدقيقة).
- جمع 1 مل من طاف واستبدالها مع 1 مل برنامج تلفزيوني بعد 1 و 3 و 6 و 10 و 14 يوما.
- تقييم امتصاص وإطلاق سراح كفاءة BMP-2 باستخدام طريقة ELISA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تقييم امتصاص وإطلاق سراح كفاءة NELL-1 باستخدام carboxybenzoyl الكينولين-2-كاربوكسالدهيد (CBQCA) طريقة البروتين فحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تحديد الإفراج التراكمي في وقت (ر):
الإفراج التراكمي في وقت (ر) = بيان في وقت (ر) + الإفراج السابق في وقت (تي 1). - رسم الافراج التراكمي للBMP-2 و NELL-1 مع الزمن.
10. في المختبر النشاط الحيويمن NELL-1
ملاحظة: تم تقييم النشاط الحيوي من NELL-1 المفرج عنهم من PEC عن طريق قياس قدرته على زيادة التعبير عن الفوسفاتيز القلوية (ALP) في أرنب العظام خلايا نخاع الجذعية (rBMSC).
- البذور 20،000 rBMSCs لكل بئر في 24 لوحة جيدا والسماح لها أن تنمو ليوم واحد مع 1 مل من Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) + 10٪ الجنين المصل البقري (FBS) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- بعد 24 ساعة، استبدال المتوسطة مع 1 مل من وسيلة عظمي المنشأ (DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 2٪ البنسلين ستربتومايسين، 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك، 10 مليمول / لتر بيتا سكرولي، و 10 -8 مول / لتر ديكساميثازون ) لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- وضع 300 ميكروغرام PEC-NELL-1 (من الخطوة 8.2) وPEC داخل إدراج ثقافة خلية (TC إدراج) للحفاظ على المتوقَّع (PECs) منفصلة من الخلايا (هذا يتجنب تبييض ميكروبيدات PEC خلال تغيير المتوسطة عظمي المنشأ). إدراج مكان TC في 24 جيدا ررأكل لمدة 14 يوما.
- مرة واحدة كل ثلاثة أيام، نضح 1 مل من المتوسط عظمي المنشأ عن طريق وضع إبرة خارج إدراج TC، واستبدالها مع 1 مل من المتوسط عظمي المنشأ الطازجة.
- بعد 7 و 14 يوما من الحضانة، وتحديد نشاط حزب العمال الاسترالى مع عدة ALP الفحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة في المجموعة.
- خلايا ليز مع العازلة فحص تحتوي على 0.1٪ TritonX-100 في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. كشط الخلايا الالتزام باستخدام مكشطة الخلية. احتضان تعليق خلية في 4 درجات مئوية في إطار التحريض لمدة 60 دقيقة على الأقل.
- الطرد المركزي تعليق خلية في 2500 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. جمع طاف للفحص ALP.
- إضافة 50 ميكرولتر من القلوية حل القياسية الفوسفاتيز تخفيفه بشكل متسلسل 200-0 نانوغرام / مل إلى آبار 96 لوحة جيدا. المبالغ النهائية على مستوى الفوسفاتيز القلوية هي 10، 5، 2.5، 1.2، 0.6، 0.3، 0.15، و0 نانوغرام / جيد.
- إضافة طاف من الخطوة 10.5.2 (50 ميكرولتر / جيد) وتمييع مع التخفيف بuffer.
- إضافة 50 ميكرولتر من ص -nitrophenyl حل الفوسفات (pNPP) الركيزة في كل بئر. مزيج من المواد الكيميائية التي تهز بلطف لوحة لمدة 30 ثانية. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في الظلام. قياس الامتصاصية في 405 نانومتر التي كتبها قارئ لوحة.
- حساب النشاط ألب باستخدام منحنى المعايرة.
- تحديد محتوى البروتين باستخدام microBCA عدة البروتين الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تطبيع نشاط حزب العمال الاسترالى بتقسيم النشاط ألب التي كتبها محتوى البروتين.
الجدوى 11. خلية
- احتضان 200 ملغ من PEC-NELL-1 مع 1 مل من DMEM + 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ل3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium (الإنتقالي العسكري) فحص.
- البذور 2000 rBMSCs لكل بئر (في 100 ميكرولتر من DMEM مع 10٪ FBS) في 96 لوحة جيدا واحتضان لمدة 1 يوم عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- استبدال DMEM + 10٪ FBS مع 100 ميكرولتر من استخراج PEC-NELL-1 / PEC واحتضانعند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- بعد يوم 1 أو 3 أيام من الحضانة، إضافة 10 ميكرولتر من 5 ملغ / مل حل الإنتقالي العسكري ومواصلة احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعة في الظلام.
- إضافة 100 حل DMSO ميكرولتر إلى كل بئر لإذابة البلورات formazan.
- تحديد الامتصاصية في 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة.
- حساب معدل النمو النسبي:
12. التعبئة والتغليف في سقالة وBMP-2 و NELL-1 تحميل
- حزمة المتوقَّع (PECs) في المسام من bioresorbable Polycaprolactone الصف الطبية - فوسفات ثلاثي الكالسيوم (mPCL-TCP) سقالة باستخدام ملعقة معقمة داخل غرفة BSL-2.
- إضافة 1.5 ملغ / مل حل من BMP-2 أو NELL-1 على منصة الاعدام mPCL-TCP محملة PEC واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الناقل لدينا، وقد تم اختيار بروتامين كبديل للبولي-L-ليسين لأنه يتمتع بخصائص كيميائية مماثلة، وأنه وافق ادارة الاغذية والعقاقير كمضاد الهيبارين. وأظهرت النتائج المجهر الضوئي أن ميكروبيدات غير المشع كانت كروية الشكل يبلغ قطرها 267 ± 14 ميكرون. (0.35 ملم فوهة، معدل التدفق من 5 مل / ساعة و5.8 كيلو فولت). غالبية ميكروبيدات المشع ذات شكل دمعة. كان القطر يقاس على جزء من جولة في ميكروبيدات المشع 212 ± 30 ميكرون (0،35 ملم فوهة، ومعدل 4 مل / ساعة و6 كيلو فولت تدفق). (الشكل 4).
صور متحد البؤر من ميكروبيدات PEC تكشف طبقة تلو طبقة طلاء CF-405 بروتامين المسمى (الأزرق)، وصفت CF594 الهيبارين (الحمراء)، وFITC-BMP-2 / FITC-NELL-1 (الخضراء). وتشير النتائج إلى أن المتوقَّع (PECs) يمكن ربط مع موجبة BMP-2 و سالبة الشحنة NELL-1 عن طريق بيندي الهيباريننطاق نغ (الشكل 5). وهذا يشير إلى أن التفاعل بين المتوقَّع (PECs) وعوامل النمو المكونة للعظم لا تهمة يتوقف.
لإثبات أن المتوقَّع (PECs) يمكن امتصاص وإطلاق سراح BMP-2، استخدمنا فحص ELISA لتحديد مقدار BMP-2 المتبقية بعد الحضانة، ومبلغ BMP-2 في برنامج تلفزيوني في يوم 1 و 3 و 6 و 10 و 14 ومع ذلك، لا يعمل نهج مماثل بشكل جيد مع البروتين NELL-1، منذ الهيبارين كتل الموقع الأجسام المضادة ملزم، والحد بشكل كبير من إشارة. لذلك، تم استخدام البروتين مقايسة CBQCA لتحديد الفرق بين PEC-NELL-1 و PEC. من منحنى الافراج التراكمي، المتوقَّع (PECs) تظهر أعلى NELL-1 كفاءة امتصاص ليس فقط بالمقارنة مع BMP-2 ولكن أيضا الإفراج عنها أبطأ بكثير من BMP-2 (NELL-1: 20٪ مقابل BMP-2: 25٪) (الشكل 6). هذا يشير إلى أن المتوقَّع (PECs) ربط أكثر إحكاما مع NELL-1 من BMP-2.
الابام الفحص الإنتقالي العسكري، PEC-NELL-1 لا السامة للخلايا (الشكل 7). نتيجة مباريات مع نتيجة الفحص الامار الأزرق في دراسة سابقة 7. الهيبارين تحييد شحنة موجبة من بروتامين الذي يلعب دورا هاما في الحفاظ على التوافق الحيوي للجنة الانتخابات الرئاسية.
لتحديد ما إذا NELL-1 الإفراج عن PEC يؤثر التمايز المكونة للعظم طويل الأجل، ومستوى التعبير عن علامة المكونة للعظم، الفوسفاتيز القلوية (ALP)، تم التحقيق فيها من قبل مقايسة اللونية. NELL-1 الإفراج عن PEC يزيد من نشاط حزب العمال الاسترالى الأرنب العظام خلايا نخاع الجذعية بنسبة 2.2 أضعاف في يوم 14 مقارنة مع مجموعة التحكم PEC (الشكل 8). يظهر BMP-2 زيادة الحد الأقصى للنشاط حزب العمال الاسترالى (3.75 أضعاف) في يوم 7. على حد سواء PEC-BMP-2 و PEC-BMP-2 + اضافية BMP-2 تظهر انخفاض النشاط في يوم 9.
ويظهر النشاط ALP مع BMP-2 في المتوسط دون PEC في
مجموعة كهرباء مولد حبة والمحاقن مضخة حتى في مجلس الوزراء BSL-2 للسلامة الأحيائية (A) فوهة تأمين على حامل فوهة: الشكل 1. (ب) حوض كبير لحل السترونتيوم كلوريد. (C) الكهربائي كابل. (D) خرطوم يسلم حل الجينات. (E) حامل الخرطوم والذراع. العرض تي (F) أقطابكان فرق الجهد لتنظيم حجم حبة. (G) النمام المغناطيسي. (H) 5 مل حقنة. (I) مضخة الحقنة لتنظيم تدفق الجينات. (J) المحرض مفتاح التحكم للسيطرة على سرعة التحريك. (K) الجهد مقبض التحكم لتنظيم فرق الجهد بين 0-10 كيلو فولت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياس ميكروبيدات الجينات مع برنامج ImageJ بعد فتح ملف الصورة عن طريق النقر على ملف → المفتوحة، اتبع الخطوة 1: اضغط على أداة الخط ورسم خط على ميكروبيدات الجينات. في الخطوة 2، انقر فوق تحليل على شريط القوائم ونافذة منبثقة سوف تظهر. كرر الخطوة 1 والخطوة 2 حتى كل ميكروبيدات هي الشرق الأوسط وأفريقيا sured. في الخطوة 3، انقر فوق الأداة خط، رسم خط عبر شريط حجم وقياس طول شريط الحجم. تحويل طول ميكروبيدات إلى ميكرون باستخدام صيغة: طول الجينات / طول شريط مقياس × 500 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تمثيل تخطيطي من مجمع متضاعف الكتروليتي الأساسية ملح الجيني (الأخضر الداكن) طبقة إيجابي تهمة بروتامين (باللون الأخضر)، السلبية طبقة تهمة الهيبارين (الحمراء)، عامل نمو عظمي المنشأ، على سبيل المثال، BMP-2 / NELL-1 على الطبقة الخارجية (شاحب الأزرق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
> 
الرقم 4: صور مشرق الميدان من ميكروبيدات الجينات (A) غير المشع. (ب) 8M راد المشع. ميكروبيدات الجينات غير المشع كروية والمشع في 8M راد نظيره هو شكل الدمعة. التكبير 100X. (مقياس بار = 500 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: متحد البؤر المسح الضوئي ليزر الصور المجهري ميكروبيدات الجينات حضنت مع نظائرها الفلورسنت من بروتامين، الهيبارين، NELL-1 و BMP-2 (أ) CF 405 بروتامين (الأزرق)، (ب) CF 594 الهيبارين (أحمر)، (C ) FITC NELL-1 (الأخضر)، و (D الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6: امتصاص وإطلاق BMP-2 و NELL-1 (A) امتصاص من NELL-1 بروتين (أسود) BMP-2 (الحمراء)، (ب) منحنى الافراج التراكمي للBMP-2 (الحمراء)، وNELL- 1 (أسود) من PEC الناقل. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
<ر /> الشكل 7: السمسة الفحص (A) MTT فحص نخاع أرنب العظام ينبع الخلية مع بروتامين أساس PEC NELL-1 200 ملغ / مل استخراج (أسود)، PEC-NELL-1 100 ملغ / مل استخراج (أبيض) في يوم 1 و 3. (ب) فحص الامار الأزرق من نخاع العظم أرنب ينبع الخلية مع PEC BMP-2 (الأزرق)، PEC أجريت (الأخضر) تجارب في ثلاث نسخ ويتم عرض النتائج على النحو يعني ± الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8: النشاط الحيوي الفحص لBMP-2 و NELL-1 الإفراج عن PEC الناقل (A) النشاط ALP الأرنب العظام الخلايا الجذعية في نخاع حضنت مع PEC-NELL-1 (أسود)، PEC (الحمراء). وقد تم قياس النشاط ALP كما الامتصاصية في 405 نانومتر. 2.2أضعاف كما لوحظ زيادة في النشاط ALP بعد الحضانة مع PEC-NELL-1 في يوم 14. (ب) النشاط ALP الأرنب العظام الخلايا الجذعية في نخاع حضنت مع PEC-BMP-2 (الحمراء) PEC-BMP-2 + إضافة BMP- 2 (الخضراء) وPEC (الأزرق). زيادة في نشاط حزب العمال الاسترالى بعد الحضانة مع PEC-BMP-2 و PEC-BMP-2 + إضافة BMP-2 في يوم 7 قطرات نشاط حزب العمال الاسترالى يوم 9. (C) ALP النشاط الأرنب العظام الخلايا الجذعية في نخاع حضنت مع PEC- BMP-2 (الحمراء) BMP-2 (الأزرق) والمتوسطة (الخضراء). يتم عرض النتائج على النحو يعني ± الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9: الفوسفات Polycaprolactone ثلاثي الكالسيوم (PCL-TCP) سقالة محملة PEC الناقل (A) Polycaprola.ctone فوسفات ثلاثي الكالسيوم (PCL-TCP) سقالة (حجم المسام 1300 ميكرون) معبأة مع PEC الناقل. (ب) PCL-TCP سقالة. (C) عالية التكبير: يحافظ على PEC شكله بعد التعبئة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويعرض هذا البروتوكول طريقة لإعداد بيكس من خلال طبقة تلو طبقة التجميع الذاتي. هو تصور بنية طبقة تلو طبقة باستخدام نظائرها الفلورسنت من بروتامين، الهيبارين، BMP-2 و NELL-1 و متحد البؤر المجهري. امتصاص وإطلاق سراح الاختبارات تظهر أن الهيبارين على PEC يتوسط عظمي المنشأ امتصاص عامل نمو والافراج عنهم. كفاءة امتصاص طريقة PEC هي: NELL-1: 86.7 ± 2.7٪، BMP-2: 70.5 ± 3.1٪. الناقل PEC لديه تعديل أفضل من NELL-1 (20٪) الإفراج مقارنة محض سطح حاملة الامتزاز مثل جزيئات الأباتيت الكالسيوم (40-80٪) 11.
وبالاضافة الى تحوير الإفراج عنهم، الهيبارين يحيد شحنة موجبة المفرط للpolycations مثل بروتامين لتجنب المشاكل المتعلقة سمية الخلايا غير المرغوب فيها (12). والمتوقَّع (PECs) لا تظهر أي علامات للخلايا، وفقا لما يحدده الفحص الإنتقالي العسكري وفحص الامار الأزرق 7. يظهر فحص ALP الناقل PEC يمكن الحفاظ على bioactivity كل NELL-1 و BMP-2. على الرغم من أن وضعت لعامل نمو عظمي المنشأ BMP-2 العلاج في العمليات الجراحية الانصهار في العمود الفقري، ويمكن PEC أيضا تناول عوامل النمو الأخرى مع الهيبارين ملزمة المجالات مثل NELL-1 وPDGF-BB. بالمقارنة مع غيرها من طرق التسليم مثل التغليف من عوامل النمو في المجهرية حامض polyglycolic، المتوقَّع (PECs) لا تتطلب المذيبات العضوية التي تميل إلى تعطيل عوامل النمو 13.
قد تؤثر على عدد من العوامل في الإجراء تلفيق PEC أداء الناقل. أولا، حجم ميكروبيدات يؤثر على نسبة مساحة سطح / حجم. أعلى نمو عظمي المنشأ عامل الحمولة لا يمكن أن يتحقق مع ميكروبيدات أصغر. ثانيا، يجب أن يكون التركيز الجينات كافية للحفاظ على استقرار هيكل ميكروبيدات. الاستقرار ميكروبيدات يعتمد على نوع الجينات، طول سلسلة (المتضررين من أشعة جاما) وأيون ثنائي التكافؤ المستخدمة (الباريوم> السترونتيوم> الكالسيوم). بينما 2٪ حل الجينات غير كافية لMANUFACTU إعادة المتوقَّع (PECs) مع الهياكل ميكروبيدات مستقرة، مطلوب 4٪ الجينات التالية 8 مراد أشعة غاما للتعويض عن آثار تقصير سلسلة الجينات خلال التشعيع. ثالثا، فإن معدل في الجسم الحي تدهور ميكروبيدات الجينات تتأثر بشدة طول سلسلة الجينات. بناء على خبرتنا من الفئران والخنازير النماذج، ملفقة PEC باستخدام المشع 8 مراد يظهر الجينات التدهور السريع (28 يوما)، والكامل للالجينات الأساسية (بيانات غير منشورة). تدهور جوهر الجينات يوفر أساسية غرفة لنشوب عظمي. رابعا، حضانة بين عشية وضحاها من BMP-2 و NELL-1 في 4 درجات مئوية مع الهز المستمر (على سبيل المثال، 30 دورة في الدقيقة) يمكن أن تحسن كفاءة امتصاص. وأخيرا، وسمك بروتامين الطلاء هو الوقت يعتمد. منذ مدى التفاعل بين بروتامين الهيبارين يحدد الافراج عن عوامل النمو المكونة للعظم مثل BMP-2 أو NELL-1، واعتمدت 1 ساعة من الحضانة بروتامين لتحسين ثبات الهيكل PEC.
الصورة = "jove_content"> استخدام الهيبارين في هذه التقنية أمر بالغ الأهمية في تحقيق الاستقرار في عوامل النمو الحساسة، وبالتالي من المهم للإطالة في النشاط الحيوي الجسم الحي. ونظرا لكمية محدودة جدا من الهيبارين المعنية وإلى جانب اختيار الترياق، أي بروتامين (دواء فعال للغاية في تحييد الأنشطة المضادة للتخثر للهيبارين)، لفترة طويلة وقت النزيف في العظام مقشور نظري إلى حد كبير وغير منطقي من الناحية العملية.
تحميل المتوقَّع (PECs) في سقالة PCL-TCP يعزز توطين الخرز في مواقع الزرع. توفر السقالات الدعم الميكانيكية اللازم والحاسم لانصهار العمود الفقري. في الدراسات الحالية، كنا السقالات PCL-TCP مع 1300 ميكرون المسام لتسهيل التغليف المناسب (الشكل 9). على الرغم من أن الشكل الحالي يظهر PEC عظمي المنشأ تسليم عامل النمو مع سقالة PCL-TCP، وتقييم مجموعتنا أيضا أداء الناقل مع polyetherketoneketone (PEKK) غرفة العظام في دراسة أرنب واحد مع فعالية مماثلة.
في هذه الدراسة، فإن عدم وجود مقارنة مع شركات الطيران الأخرى تقييمها سابقا من rhBMP-2 وNELL-1 تمثل الحد.
في الختام، يوفر هذا الإجراء قدم الناقل مفيد للسيطرة على الافراج عن عوامل النمو المكونة للعظم مع المجالات الهيبارين مثل BMP-2 و NELL-1. الاستراتيجية المبينة يجمع العديد من المزايا: فهو لا يقتصر على BMP-2 والتي تنطبق على عوامل النمو الأخرى مع الهيبارين ملزمة المجالات مثل NELL-1. تخفيض جرعة على عامل نمو عظمي المنشأ يمكن أن تقلل من الآثار الجانبية غير المرغوب فيها مثل تورم مصلي، تكوين العظام غيرية وخفض التكلفة الإجمالية للعلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labeled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labeling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100 µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labeling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labeling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5 ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1x | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C.
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
