Abstract
Under rekonstruktiv knogle- kirurgi, er suprafysiologiske mængder af vækstfaktorer empirisk fyldt på stilladser at fremme vellykket knoglefusion. Store doser af højpotente biologiske midler er påkrævet på grund af vækstfaktor ustabilitet som følge af hurtig enzymatisk nedbrydning samt carrier ineffektivitet i lokalisering tilstrækkelige mængder af vækstfaktor på implantat sites. Derfor kunne strategier, der forlænger stabiliteten af vækstfaktorer, såsom BMP-2 / NELL-1, og styrer deres løsladelse faktisk sænke deres effektive dosis og dermed mindske behovet for større doser under fremtidige knogle regenerering operationer. Dette vil igen reducere bivirkninger og vækstfaktor-omkostninger. Self-samlet PEC er blevet fremstillet for at give bedre kontrol med BMP-2 / NELL-1 levering via heparin bindende og yderligere potenserer vækstfaktor bioaktivitet ved at øge in vivo-stabilitet. Her illustrerer vi enkelhed PEC fabrikation som hjælper i levering perry af en række forskellige vækstfaktorer under rekonstruktive knogle kirurgi.
Introduction
Forekomsten af pseudoarthrose er blevet rapporteret at være så høj som 10 til 45% i degenerative spinal fusion og revision spinal kirurgi 1. At reducere antallet af Pseudartrose under columna fusion og andre rekonstruktive knogle kirurgi, er blevet indført osteogene vækstfaktorer, såsom BMP-2, Nell-1 1 og blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) at fremme de novo osteogenese. Blandt disse, BMP-2 er et populært valg for spinal fusion 2. Selvom styrken af BMP-2 ved inducering og lette ny knogledannelse er blevet veletableret 3; klinisk signifikante komplikationer såsom heterotop knogledannelse, seroma og hæmatomdannelse, inflammatorisk respons, radiculitis, corpus vertebrae osteolyse og retrograd ejakulation fortsat være spørgsmål af interesse på grund af de suprafysiologiske anvendte mængder 4,5.
Derfor sænke dosen af BMP-2 fortsat en relevant strategi ind påfrister at minimere bivirkninger. Desuden er effektive bærersystemer kræves for at undertrykke den initielle afgivelse frigivelse af BMP-2 observeret i moderne collagensvamp bærersystemer og yderligere forbedre forlænget og lokal afgivelse af denne potente cytokin. Lag-på-lag selvsamling af vekslende kationiske og anioniske polyelektrolytter kan anvendes som en afstemmelig metode til at opbygge polyelektrolytkomplekser på overfladen af stillads matrixer eller implanterbare materialer 6. I denne henseende har heparin (kendt for at have den største negative ladningsdensitet for alle biologiske agenser) blevet anerkendt til effektivt binde med en række vækstfaktorer via elektrostatiske og heparinbindende domæner. Faktisk har heparin blevet vist at forlænge halveringstiden og således potentiere bioaktiviteten af flere vækstfaktorer.
Baseret på dette, vores gruppe tilpasset et lag-på-lag selv-samling protokol til fabrikere en heparin-baserede polyelektrolyt kompleks (PEC), at belastninger og bevarer bioaktiviteter af osteogene vækstfaktorer under immobilisering 7,8. Alginat mikroperle kerne blev fremstillet ved tværbinding α-L-guluronat (G) rester af alginat med divalent kation calcium- eller strontiumioner. Alginatet kerne er en bionedbrydelig scaffold matrix; som efter implantering, er det resorberes i fusionen seng giver plads til knogleindvækst. Poly-L-lysin (PLL) eller protamin anvendes som den kationiske lag til interlace med både stilladset matrix (i dette tilfælde, alginat mikroperle bærer kerne) og det negativt ladede heparin; mens de anioniske heparin lag tjener til at stabilisere og lokalisere indlæst vækstfaktorer. Den tredobbelte lag PEC har vist sig at øge væksten faktor lasteevne i et porcint model 9. For nylig er PEC bærere vist sig at kunne reducere den effektive dosis af BMP-2 med mindst 20-fold i rotter 10 og svin modeller af spinalfusion 8.
ntent "> Her rapporterer vi metoder til opdigte PEC'er for øget vækst faktor levering i spinal fusion og de andre rekonstruktive knogle kirurgi ved hjælp BMP-2 som en model osteogen vækstfaktor.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Alginat Fremstilling af opløsning
- Opløs 200 mg natriumalginat (ikke bestrålet) eller 400 mg 8 MRad bestrålet natriumalginat i 10 ml dobbelt destilleret vand og rystes i 1 time til ikke-udstrålede alginat og 15 min for bestrålet alginat. alginatopløsningen ved 4 ° C opbevares natten over. Filtrer alginatopløsningen med en steril 0,2 um sprøjtefilter før alginat mikroperle fabrikation.
2. Alginat mikroperler Fabrication
- Desinficer den elektrostatiske perle generator og sprøjte pumpe med 70% ethanol og placere dem i en klasse II biologisk sikkerhedsskab (figur 1).
- Placer en glas bækkenet med en magnetisk omrører inde i perlen generator.
- Indstil arm elektrode af perlen generatoren 9 cm over bassinet.
- Slut elektrodekablet af perlen generator til fingerskruen 2 af armen elektrode, og hæld 80 ml SrCl 2-opløsning ind ibassin.
- Belastning 5 ml 0,2 um filtreret alginat opløsningen op i sprøjten og gummislange. Efter tilslutning gummislangen til armen elektrode, tænde sprøjtepumpen ved 5 ml / time i 2 minutter for at uddrive luften inde i slangen og levere alginatopløsningen til spidsen af dysen. Sluk sprøjtepumpen.
- Dernæst tænde encapsulator og derefter, at sprøjten pumpe begynder mikroperler generation. Indstil alginat flowhastighed på 5 ml / time og spændingen ved 5,8 kV på encapsulator. Kassér mikroperlerne genereres i de første to minutter (eller den første 0,5 ml alginat opløsning pumpes ud af sprøjten), da disse mikroperler tendens til at være uregelmæssigt størrelse og form.
- Indsamle efterfølgende mikroperler i 0,2 M strontiumchloridopløsning. Sluk både sprøjtepumpen og encapsulator (i den rækkefølge) efter pumpning før planlagte mængde af alginat opløsning. Gentag dette for efterfølgende partier af mikroperle opspind. Ved afslutning, drej påf sprøjtepumpen først, efterfulgt af encapsulator.
- Opbevar mikroperlerne i 20 ml 0,2 M strontiumchloridopløsning ved 4 ° C natten over for at fuldføre tværbinding og stabilisere gelen.
3. Størrelse Måling af alginat Microbeads
- Saml 0,5 ml alginat mikrokugler med en plastik pipette og placere den på en glasplade. Vis mikroperlerne under et optisk mikroskop ved 10X forstørrelse. Tage ti billeder af mikroperlerne med et mikroskop CCD-kamera. Gem billeder med skala bar (500 um) i TIFF-format ved opløsning 2048 x 1536.
- Brug af længde værktøjer i ImageJ, måle størrelsen af mikroperlerne og skala bar (figur 2). Konverter længden mikroperler fra pixel til mikrometer.
- Klik på linje værktøjer og tegne en linje på tværs af midten af alginat perle.
- Klik på "Analyser" på menulinjen, og vælg "Measure". Et pop-up vindue vil fremkomme.
- Konverter diameteren af alginatkugle til den faktiske længde ved anvendelse af formlen: længde alginatkugle / længde skala bar x 500 um. For eksempel, 1.420 (diameter målt ved ImageJ) / 2,657 (skala bar længde målt ved ImageJ) * 500 um = 267 um.
- Overvej den gennemsnitlige størrelse af 100 mikroperler (gennemsnit ± standardafvigelse) som repræsentant størrelse af hvert parti af mikroperler.
4. Sterilisation
- Indsamle mikroperlerne anvendelse af en 100 um nylon si og vaske perlerne med dobbelt destilleret vand.
- Ved hjælp af en spatel, overføre alle mikroperlerne fremstillet af 0,1 ml alginat opløsning i en 2 ml mikrocentrifugerør og dække med gaze for at forhindre udtørring.
- Endelig steriliseres mikroperlerne ved autoklavering anvendelse af flydende tilstand (115 ° C, 15 min) eller i overensstemmelse med manufacturer specifikationer. Tilføj 1,5 l destilleret vand til kammeret for at forhindre perler fra tørring.
5. Protamin og Heparin Coating
- Inde i BSL-2 hætte, inkuberes de sterile mikroperler med 1 ml 2 mg / ml protamin opløsning (steriliseret ved anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter) i 1 time ved stuetemperatur.
- Efter inkubering af mikroperlerne i 1 time (trin 5.1), indsamle 150 pi af protamin løsning for mikro bicinchoninsyre (microBCA) test (afsnit 6).
- Vask protamin coatede mikroperler to gange med dobbeltdestilleret vand. Spin ned med en bordcentrifuge ved 200 xg i 3 min ved stuetemperatur. Efter centrifugering aspireres vand med en sprøjte.
- Inkuber protamin overtrukket mikroperler med 1 ml 0,5 mg / ml heparin-opløsning (steriliseret ved anvendelse af en 0,2 um sprøjte filter) i 30 minutter for at skabe polyelektrolyt kompleks (PEC).
- Efter inkubering af protamin coatede mikroperler feller 30 min (trin 5.4), indsamle 400 pi heparin løsning til at bestemme heparin indhold (afsnit 7).
- Efter inkubation vaskes den ubundne heparin fra PEC ved vask to gange med dobbeltdestilleret vand.
6. Protamin indhold
- Udfør microBCA test i henhold til producentens anvisninger. Kort beskrevet tilsættes 150 pi protamin opløsning (indsamlet før og efter inkubering med mikroperler) i en plade med 96 brønde. Tilsæt 150 pi microBCA arbejdsopløsning.
- Brug albuminopløsning (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 og 200 ug / ml) som kalibreringsstandarder.
- Inkuber blandingen i 60 minutter ved 60 ° C. Absorbansen med et spektrofotometer ved 562 nm.
- Brug standardkurven for at bestemme protamin koncentrationen af hver ukendt prøve i henhold til producentens anvisninger.
- Bestem protamin indhold af mikroperlerne ved at fratrække det samlede protamin ibelægningsopløsning (før inkubation med mikroperler) fra mængden af protamin tilbage i coatingopløsningen (efter inkubation med mikroperler).
7. Heparin indhold
- Forbered 10 ml arbejdsopløsning ved at opløse 4 mg toluidinblåt og 20 mg natriumchlorid i 0,01 N saltsyre.
- Der tilsættes 400 pi prøve (fra trin 5.5) til arbejdsopløsningen i et forhold på 2: 3 og vortex i 30 sek.
- Tilsættes 600 pi n-hexan (ækvivalent volumen til arbejdsdækket reagensopløsning) og vortex blandingen for at ekstrahere toluidinblåt heparin-kompleks.
- Aspirer 200 pi af den vandige fase med en sprøjte efter faseadskillelse.
- Måle mængden af ikke-ekstraherede toluidinblåt indeholdt i den vandige fase under anvendelse af et spektrofotometer ved 631 nm.
- Forbered heparin standardopløsninger af 0-20 pg / ml.
- Plot 631 nm læsning af hver heparin standard vs. heparin koncentration i mg / ml. Brug standardkurven for at bestemme heparin i hver enkelt prøve.
8. Konfokal Billede af lag-på-lag Structure
- Fabrikere protamin, heparin og NELL-1 / BMP-2 fluorescerende analog CF-405 protamin (blå), CF 594 heparin (rød) og FITC-mærket NELL-1 / FITC-mærket (grøn) BMP-2 + heparin + protamin ifølge producentens teknisk datablad.
- Coat 100 ug mikroperler med 300 pi fluorescerende analog (coating som beskrevet i 5,3-5,6) CF-405 protamin (blå) (2 mg / ml, 1 times inkubation), CF 594 heparin (rød) (0,5 mg / ml, 30 min) og FITC-mærket NELL-1 / FITC-mærket (grøn) BMP-2 (1,5 mg / ml, natten over). Vask mikroperlerne to gange med destilleret vand for at fjerne det ubundne fluorescerende protamin, heparin og NELL-1 / BMP-2.
- Observere lag-på-lag struktur (figur 3) ved hjælp af et konfokalt mikroskop ved 10X forstørrelse. 7
9. BMP-2og NELL-1 Optagelse og frigivelse
- Load 13.3 pi 1,5 mg / ml BMP-2 eller NELL-1-opløsning på 100 ug PEC. Inkuber PEC ved 4 ° C under 30 rpm rystning i 10 timer.
- Fordybe mikroperlerne i 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) ved 37 ° C under konstant omrystning (30 omdrejninger i minuttet).
- Saml 1 ml af supernatanten, og erstatte det med en ml PBS efter 1, 3, 6, 10 og 14 dage.
- Evaluere optagelsen og frigive effektivitet af BMP-2 ved anvendelse af ELISA-metoden ifølge producentens protokol. Evaluere optagelsen og frigive effektivitet NELL-1 ved anvendelse af carboxybenzoyl quinolin-2-carboxaldehyd (CBQCA) proteinassay fremgangsmåde ifølge fabrikantens protokol.
- Bestem kumulativ frigivelse på tidspunktet (t):
Kumulativ frigivelse på tidspunktet (t) = Frigivelse på tidspunktet (t) + Forrige frigivelse på tidspunktet (t-1). - Plot kumulativ frigivelse af BMP-2 og NELL-1 mod tiden.
10. In vitro Bioaktivitetaf NELL-1
Bemærk: bioaktivitet NELL-1 frigivet fra PEC blev vurderet ved at måle dets evne til at øge ekspressionen af alkalisk phosphatase (ALP) i kanin-stamceller fra knoglemarv (rBMSC).
- Seed 20.000 rBMSCs per brønd i en plade med 24 brønde og lade dem vokse for én dag med 1 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) + 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter 24 timer udskiftes mediet med 1 ml af et osteogent medium (DMEM suppleret med 10% FBS, 2% penicillin streptomycin, 50 ug / ml ascorbinsyre, 10 mmol / l beta-glycerophosphat, og 10 -8 mol / L dexamethason ) i 7 dage ved 37 ° C og 5% CO2.
- Placer 300 ug PEC-NELL-1 (fra trin 8.2) og PEC inde cellekultur indsatser (TC indsats) at holde PEC adskilt fra cellerne (dette undgår udvaskning af PEC mikroperler under osteogene medium ændring). Sted TC indsætte i 24 brønds plspiste i 14 dage.
- Når hver tredje dag, aspirat 1 ml af den osteogene medium ved at placere en nål uden TC indsats, og erstatte med 1 ml frisk osteogene medium.
- Efter 7 og 14 dages inkubation, fastlægge ALP-aktivitet med en ALP assay kit i overensstemmelse med sættet producentens protokol.
- Lyserer celler med assaybuffer indeholdende 0,1% Triton X-100 ved 4 ° C i 10 min. Skrabe adhærerede celler under anvendelse af en celleskraber. Inkuber cellesuspension ved 4 ° C under omrøring i mindst 60 min.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 2500 xg ved 4 ° C i 10 minutter. Opsaml supernatanten for ALP assay.
- Der tilsættes 50 pi seriefortyndet alkalisk phosphatase standard løsning fra 200 til 0 ng / ml til brøndene i en plade med 96 brønde. De endelige mængder af alkalisk phosphatase standard er 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 og 0 ng / brønd.
- Tilføj supernatanten fra trin 10.5.2 (50 pl / brønd) og fortyndes med fortynding buffer.
- Der tilsættes 50 pi p-nitrophenylphosphat (pNPP) substratopløsning i hver brønd. Bland reagenserne ved forsigtigt at ryste pladen i 30 sek. Inkuber blandingen i 30 minutter i mørke. Absorbansen ved 405 nm ved pladeaflæser.
- Beregn ALP aktivitet ved hjælp af kalibreringskurven.
- Bestem proteinindhold under anvendelse af microBCA proteinassaykit ifølge producentens instruktioner. Normalisere ALP aktivitet ved at dividere ALP aktivitet ved proteinindhold.
11. cellelevedygtighed
- Inkuber 200 mg PEC-NELL-1 med 1 ml DMEM + 10% FBS ved 37 ° C i 24 timer i stedet for 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay.
- Seed 2.000 rBMSCs per brønd (i 100 pi DMEM med 10% FBS) i en plade med 96 brønde og inkuber i 1 dag ved 37 ° C, 5% CO2.
- Erstat DMEM + 10% FBS med 100 pi PEC-NELL-1 / PEC-ekstrakt og inkuberesved 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 1 dag eller 3 dages inkubation tilsættes 10 pi 5 mg / ml MTT-opløsning og yderligere inkubere ved 37 ° C, 5% CO2 i 4 timer i mørke.
- Tilsæt 100 pi DMSO-opløsning til hver brønd for at opløse formazan-krystaller.
- Bestem absorbansen ved 570 nm under anvendelse af en mikropladelæser.
- Beregn den relative vækst:
12. Emballage til Stillads og BMP-2 & NELL-1 Loading
- Pak PEC ind i porerne af en bioresorberbar medicinsk kvalitet Polycaprolacton - tricalciumphosphat (mPCL-TCP) stillads anvendelse af en steriliseret spatel i en BSL-2 kammer.
- Tilføj 1,5 mg / ml opløsning af BMP-2 eller NELL-1 på mPCL-TCP stillads pakket med PEC og inkuberes natten over ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vores bærer, blev protamin valgt som en erstatning af poly-L-lysin, som det har lignende kemiske egenskaber, og det er FDA godkendt som modgift af heparin. Optisk mikroskop resultater viste, at de ikke-bestrålede mikroperler var kugleformede med en diameter på 267 ± 14 um. (0,35 mm dyse, strømningshastighed på 5 ml / time og 5,8 kV). Størstedelen af de bestrålede mikroperler er af dråbeform. Diameteren måles på den runde del af de bestrålede mikroperler var 212 ± 30 um (0,35 mm dyse, strømningshastighed på 4 ml / time & 6 kV). (Figur 4).
Konfokale billeder af PEC mikroperler afslører lag-på-lag coating af CF-405 mærket protamin (blå), CF594-mærket heparin (rød) og FITC-BMP-2 / FITC-NELL-1 (grøn). Resultaterne viser, at PEC kan binde med positivt ladede BMP-2 og negativt ladede NELL-1 via heparin binding domæne (figur 5). Dette tyder på, at samspillet mellem PEC og osteogene vækstfaktorer ikke opkræve afhængig.
For at bevise, at PEC kan optagelse og frigive BMP-2, anvendte vi et ELISA-assay til bestemmelse af mængden af BMP-2 er tilbage efter inkubation, og mængden af BMP-2 i PBS på dag 1, 3, 6, 10 og 14 . Men en lignende fremgangsmåde ikke fungerer godt med NELL-1-proteinet, da heparin blokerer antistoffet bindingssted, en markant nedsættelse af signalet. Derfor blev CBQCA proteinassay anvendes til at bestemme forskellen mellem PEC-NELL-1 og PEC. Fra kurven kumulative frigørelse, PEC'er viser ikke kun en højere NELL-1 optagelse effektivitet sammenlignet med BMP-2, men også frigive den meget langsommere end BMP-2 (NELL-1: 20% vs. BMP-2: 25%) (figur 6). Dette antyder, at PEC binder mere tæt med NELL-1 end BMP-2.
frabout MTT-assayet, PEC-NELL-1 er ikke cytotoksisk (figur 7). Resultatet svarer med Alamar Blå assayresultatet i en tidligere undersøgelse 7. Heparin neutraliserer den positive ladning af protamin som spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af biokompatibilitet PEC.
For at bestemme om NELL-1 frigørelse fra PEC påvirker langsigtet osteogen differentiering, ekspressionsniveauet af et osteogent markering, alkalisk phosphatase (ALP), blev undersøgt ved en kolorimetrisk assay. NELL-1 frigørelse fra PEC øger ALP aktivitet af kanin stamceller fra knoglemarven med 2,2 gange på dag 14 sammenlignet med PEC kontrolgruppen (figur 8). BMP-2 viser maksimal stigning på ALP aktivitet (3,75 gange) på dag 7. Både PEC-BMP-2 og PEC-BMP-2 + extra BMP-2 viser fald i aktiviteten på dag 9.
ALP-aktivitet med BMP-2 i medium uden PEC er vist i
Figur 1: Elektrostatisk perle generator og sprøjtepumpe oprettet i BSL-2 biosikkerhed kabinet (A) Dyse sikret på dyseholder.. (B) Big bassin til strontiumchloridopløsning. (C) Electrode kabel. (D) Slange leverer alginatopløsning. (E) Dyse holder og arm. (F) Elektroder forsyning than spændingsforskel til at regulere perlestørrelsen. (G) Magnetomrører. (H) 5 ml sprøjte. (I) Sprøjte pumpe til regulering alginat flow. (J) Omrører betjeningsknap til at styre omrøring hastighed. (K) Spænding knappen for at regulere den potentielle forskel mellem 0-10 kV. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Måling alginat mikroperler med ImageJ software Efter åbning af billedfilen ved at klikke på Filer → Åbn Følg Trin 1:. Klik på linje værktøj og trække en linje på alginat mikroperler. I trin 2 skal du klikke på Analyser på menulinjen og en pop-up vindue vil fremkomme. Gentag trin 1 og trin 2, indtil alle mikrokugler er meakost-. I trin 3, skal du klikke på linje værktøj, tegne en linje på tværs af skala bar og måle længden af skalaen bar. Konverter længden mikroperler til um ved hjælp af formel:. Længde på alginat / længde Scale bar x 500 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Skematisk fremstilling af polyelektrolytkompleks Alginat kerne (mørkegrøn) positiv ladning protamin lag (svagt grøn), negativ ladning heparin lag (rød), osteogen vækstfaktor, fx BMP-2 / NELL-1 på yderste lag (bleg blå). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Bright field billeder af alginat mikroperler (A) Ikke-bestrålet. (B) 8M Rad bestrålet. Ikke-bestrålede alginat mikroperler er kugleformede og 8M Rad bestrålede modpart er dråbeformede. Forstørrelse 100X. (Scale bar = 500 um.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Konfokal laser scanning mikroskopi billeder af alginat mikroperler inkuberet med fluorescerende analoger af protamin, heparin, NELL-1 og BMP-2 (A) SF 405 Protamin (blå), (B) CF 594 Heparin (rød), (C ) FITC NELL-1 (grøn), og (D Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Optagelse og frigivelse af BMP-2 og NELL-1 (A) Optagelse af NELL-1 protein (sort) BMP-2 (rød), (B) kurve Kumulativ frigivelse af BMP-2 (rød) og NELL- 1 (sort) fra PEC luftfartsselskab. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
<br /> Figur 7:. cytotoksicitetsanalyse (A) MTT-analyse af kanin knoglemarv stængler celle med protamin baseret PEC NELL-1 200 mg / ml ekstrakt (sort), PEC-NELL-1 100 mg / ml ekstrakt (hvid) ved dag 1 og 3. (B) Alamar blå assay af kanin knoglemarv stængler celle med PEC BMP-2 (blå), PEC (grøn) Forsøg blev udført tre gange, og resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. venligst klik her for en større version af denne figur.
Figur 8: Bioaktivitet assay for BMP-2 og NELL-1 frigørelse fra PEC bærer (A) ALP aktivitet af kanin knoglemarv stamcelle inkuberet med PEC-NELL-1 (sort), PEC (rød).. ALP-aktivitet blev målt som absorbansen ved 405 nm. 2.2fold stigning i ALP-aktivitet blev observeret efter inkubation med PEC-NELL-1 ved dag 14. (B) ALP aktivitet af kanin knoglemarv stamcelle inkuberet med PEC-BMP-2 (rød) PEC-BMP-2 + tilsætning af BMP- 2 (grøn) og PEC (blå). Stigning i ALP aktivitet efter inkubering med PEC-BMP-2 og PEC-BMP-2 + tilsætning af BMP-2 på dag 7, ALP aktivitet dråber på dag 9. (C) ALP aktivitet af kanin knoglemarv stamcelle inkuberet med PEC- BMP-2 (rød) BMP-2 (blå) og Medium (grøn). Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: polycaprolacton tricalciumphosphat (PCL-TCP) stillads pakket med PEC bærer (A) Polycaprola.ctone tricalciumphosphat (PCL-TCP) stillads (porestørrelse 1.300 um) pakket med PEC bærer. (B) PCL-TCP stillads. (C) Høj forstørrelse: PEC fastholder sin form efter pakningen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol viser en fremgangsmåde til fremstilling af PEC'er gennem lag-på-lag selv-samling. Lag-på-lag struktur visualiseres under anvendelse af fluorescerende analoger af protamin, heparin, BMP-2 og NELL-1 og konfokal mikroskopi. Optagelse og frigive forsøg viser, at heparin på PEC medierer osteogen vækstfaktor optagelse og frigivelse. Optagelsen effektivitet PEC metoden er: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. PEC bærer har en bedre modulering af NELL-1 (20%) frigivelse sammenlignet med en ren overflade adsorption bærer, såsom calcium apatit partikler (40-80%) 11.
Udover modulerende frigivelse, heparin neutraliserer den overdrevne positive ladning af polykationer såsom protamin at undgå uønsket cytotoksicitet relaterede emner 12. De PEC viser ikke nogen tegn på cytotoksicitet, som bestemt af MTT-analysen og Alamar Blå analysen 7. ALP assay viser PEC bærer kan opretholde Bioactske sammenhæng af både NELL-1 og BMP-2. Selvom udviklet til osteogen vækstfaktor BMP-2 behandling i spinal fusion kirurgi, kan PEC også tage op andre vækstfaktorer med heparin bindende domæner såsom NELL-1 og PDGF-BB. Sammenlignet med andre leveringsmetoder, såsom indkapsling af vækstfaktorer i polyglycolsyre-mikrosfærer, behøver PEC'er ikke kræve organiske opløsningsmidler, der har tendens til at inaktivere vækstfaktorer 13.
En række faktorer i fabrikation procedure PEC kan påvirke luftfartsselskab ydeevne. For det første mikroperler størrelse påvirker overfladeareal / volumen-forhold. Højere osteogen vækstfaktor loading kan opnås med mindre mikroperler. For det andet bør alginatkoncentrationen være tilstrækkelig til at opretholde stabiliteten af mikroperle struktur. Mikroperle stabilitet afhænger af alginat type, kædelængden (påvirket af gamma-bestråling) og det anvendte divalente ion (barium> strontium> calcium). Mens 2% alginat opløsning er tilstrækkelig til at produre PEC'er med stabile mikroperle strukturer, er 4% alginat kræves følgende 8 MRad gammastråling for at kompensere for virkningerne af alginat kædeforkortelse under bestråling. For det tredje er hastigheden af in vivo-nedbrydning af alginat mikroperler stærkt påvirket af alginat kædelængde. Baseret på vores erfaring fra rotte, svin modeller, PEC fremstillet under anvendelse af 8 MRad bestrålet alginat viser hurtig (28 dage) og fuldstændig nedbrydning af alginat kerne (upublicerede data). Nedbrydning af alginat kerne giver plads afgørende for knogleindvækst. For det fjerde kan den natten over inkubation af BMP-2 og NELL-1 ved 4 ° C med konstant omrystning (f.eks 30 rpm) forbedre optagelsen effektivitet. Endelig har protamin lagtykkelse er tidsafhængig. Da omfanget af protamin-heparin interaktion bestemmer frigivelsen af osteogene vækstfaktorer, såsom BMP-2 eller NELL-1, er 1 time af protamin inkubation vedtaget at forbedre stabiliteten af PEC struktur.
in vivo bioaktivitet. I betragtning af den meget begrænsede mængde heparin involveret og koblet med valget af modgiften, dvs., protamin (et yderst effektivt lægemiddel i neutraliserende anti-koagulerende aktiviteter af heparin), forlænget blødningstid i Afskallet knogle er stort set teoretisk og praktisk ligegyldig.
Ilægning de paneuropæiske korridorer i PCL-TCP stillads øger lokalisering af perler på implantater sites. Stilladser yde den nødvendige mekanisk støtte, der er afgørende for rygsøjlen fusion. I de foreliggende undersøgelser, vi brugte PCL-TCP stilladser med 1.300 um porer til at lette korrekt pakning (figur 9). Selv om den nuværende illustration viser PEC osteogen vækstfaktor levering med PCL-TCP stillads, har vores gruppe også vurderet luftfartsselskab ydeevne med en polyetherketonketon (PEKK) Knogle kammer i en kanin studie med lignende effekt.
I denne undersøgelse kunne manglen på sammenligning med andre tidligere evaluerede bærere af rhBMP-2 og NELL-1 repræsenterer en begrænsning.
Afslutningsvis præsenterede procedure giver en nyttig luftfartsselskab til at styre frigivelsen af osteogene vækstfaktorer med heparin områder som BMP-2 og NELL-1. Den beskrevne strategi kombinerer mange fordele: det er ikke begrænset til BMP-2 og som gælder for andre vækstfaktorer med heparinbindende domæner såsom NELL-1. Dosisreduktion på osteogen vækstfaktor kan reducere uønskede bivirkninger, såsom seroma, heterotrof knogledannelse og nedsætte de samlede omkostninger ved behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har nogen interessekonflikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labeled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labeling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100 µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labeling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labeling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5 ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1x | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C.
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
