Abstract
Микрожидком устройства способны создавать точную и контролируемую клеточный микро-среде рН, температуры, концентрации соли и других физических или химических раздражителей. Они обычно используются для исследований клеток в пробирке, обеспечивая в естественных условиях , как окружение. В частности, как клетки ответ на химические градиенты, электрических полей и напряжений сдвига привлек много интересов, так как эти явления имеют важное значение для понимания клеточных свойств и функций. Эти микрофлюидальные чипы могут быть изготовлены из стеклянных подложек, кремниевых пластин, полидиметилсилоксан (PDMS) полимеры, полиметилметакрилат (ПММА) субстратов, или полиэтилентерефталата (ПЭТ) подложках. Из этих материалов, PMMA субстраты являются дешевыми и легко могут быть обработаны с использованием лазерной абляции и записи. Хотя несколько микрофлюидальные устройства были разработаны и изготовлены для создания нескольких, сосуществующие химические и электрические стимулы, не рассматривалось ни одно из нихдостаточно эффективно в уменьшении экспериментальных повторы, особенно для целей скрининга. В этом докладе мы описываем наше проектирование и изготовление двух ПММА на основе микрожидкостных чипов для исследования клеточных реакций, в производстве активных форм кислорода и миграции, по разовым или сосуществующих химических / электрических напряжений стимулов / сдвига. Первый чип генерирует пять относительных концентраций 0, 1/8, 1/2, 7/8, и 1 в регионах культуры, вместе с градиентом напряжения сдвига, полученного в каждой из этих областей. Второй чип генерирует те же относительные концентрации, но с пятью различными электрического напряженности поля, создаваемых в каждой области культуры. Эти устройства не только обеспечивают клетки с точным, контролируемым микросреду, но и значительно повысить экспериментальную пропускную способность.
Introduction
In vivo - клетки окружены различными биомолекулами , включая внеклеточного матрикса (ЕСМ), углеводы, липиды и другие клетки. Они функционализации путем реагирования на микро-стимулы окружающей среды, такие как взаимодействие с ECM и реакции на химические градиенты различных факторов роста. Традиционно, исследования клеточных ин витро проводят в чашки для культивирования клеток , где потребление клеток и реагентов является большим и клетки растут в статическом (внеоборотные) среды. В последнее время устройства микро быстровозводимых интегрированные с жидкостных компонентов обеспечили альтернативную платформу для исследований клеток в более контролируемым образом. Такие устройства способны создавать точную микросреду химических и физических раздражителей, при сведении к минимуму потребление клеток и реагентов. Эти микрофлюидальные чипы могут быть изготовлены из стеклянных подложек, кремниевых пластин, полидиметилсилоксан (ПДМС), полимеры, полиметилметакрилат (ПММА) субстраты, или polyethylenetereфталат (ПЭТ) подложках 1-3. Устройства ПДМС основе являются прозрачными, биосовместимыми и проницаема для газов, что делает их пригодными для длительной культуры и исследований клеток. PMMA и PET подложки являются дешевым и легко обрабатывается с помощью лазерной абляции и записи.
Микрожидком устройства должны обеспечивать клетки со стабильной и контролируемой микро-среды, в которой клетки подвержены различным химическим и физическим раздражителям. Например, микрофлюидальные чипы используются для изучения хемотаксис клеток. Вместо традиционных методов , которые используют Бойден камеры и капиллярная 4,5 эти миниатюрные жидкостный устройства могут генерировать точные химические градиенты для изучения поведения клеток 1,6,7. Другим примером может служить для изучения миграции клеток направленного "под электрическими полями (EFS), явление назвали электротаксис. Сообщили Electrotactic поведение клеток , чтобы быть связано с регенерации нерва 8, 9 , эмбриональное развитие,и ранозаживляющие 10,11. И многие исследования были проведены для изучения электротаксис различных типов клеток , включая раковые клетки 12,13, лимфоциты 14,15, лейкозных клеток 11, и стволовые клетки 16. Обычно чашки Петри и покровные стекла используются для построения electrotactic камер для генерации ЭФ 17. Такие простые расстановок создают проблемы среднего испарения и неточных ЭФ, но они могут быть преодолены с помощью микрожидкостных устройств закрытых, четко определенных жидкостных каналов 12,18,19.
Для того, чтобы систематически изучать клеточные ответы в рамках точных, контролируемых химических и электрических стимулов, было бы весьма полезным для разработки микрожидкостных устройств, способных обеспечивать клетки с множественными стимулами одновременно. Например, Ли и др. сообщает микрожидком устройство PDMS основе для создания одного или сосуществующих химические градиенты и ЭФ 20. Као и др. DEVскрывшийся аналогичный микрожидкостных чип модулировать хемотаксис клеток рака легких с помощью ЭФ 6. Кроме того, чтобы увеличить пропускную способность , Hou и соавт. спроектированы и изготовлены ПММА на основе чипа многоканальная-двойного электрического поля , чтобы обеспечить клетки с 8 различными комбинированными раздражителями, будучи (2 EF сильные х 4 химических концентраций) 21. Для дальнейшего увеличения повсюду и добавить напряжение сдвига стимула, мы разработали два микрожидкостных устройств на основе ПММА для изучения клеточных реакций при одно- или сосуществующих химических / электрических напряжений стимулов / сдвига.
Сообщил Lo и др. 22,23, эти устройства содержат пять независимых каналов клеточной культуры , подлежащем непрерывному жидкостный текучий, имитируя кровеносной системы в естественных условиях. В первом чипе (химического сдвига чипа напряжения или чипа CSS), пять относительных концентраций 0, 1/8, 1/2, 7/8 и 1 формируются в областях культуры, и градиент напряжения сдвига произвоCED внутри каждой из пяти областей культуры. Во втором кристалле (химико-электрического поля микросхемы или чипа CEF), с помощью одного одного комплекта электродов и 2 шприцевые насосы, пять EF сильные генерируются в дополнение к пяти различных химических концентраций в этих областях культуры. Численные расчеты и моделирование выполняются более эффективно разрабатывать и эксплуатировать эти чипы, и рак легких клетки, культивируемые внутри этих устройств могут быть одно- или сосуществующих стимулов для наблюдения за их ответы в отношении производства активных форм кислорода (ROS), скорость миграции, и направление миграции. Эти чипы продемонстрировано, экономии времени, высокой пропускной способностью и надежные устройства для исследования, как клетки реагируют на различные микро-стимулы окружающей среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Чип Проектирование и изготовление
- Рисовать узоры быть абляции на ПММА субстратов и двухсторонних лент с использованием коммерческого программного обеспечения 24.
- Для изучения влияния химических концентраций и напряжений сдвига, нарисовать "Рождественская елка" узор с различной шириной в его конце в каждой из пяти областей культуры (рис 1А и 1В).
- Для изучения влияния химических концентраций и электрических полей, нарисовать "Рождественская елка" узор с еще двумя жидкостных каналов для солевых мостиков (рис 2А и 2В).
- Писец индивидуальный узор на ПММА листа или двухсторонним ленты, загрузив соответствующий файл в лазерный Scriber CO 2.
- Включите лазерный рисок, и проверьте его подключение к компьютеру. Откройте шаблон, чтобы быть абляции с использованием коммерческого программного обеспечения.
- Поместите PMMA лист или двухсторонней ленты Oп вершина стадии Scriber. Отрегулируйте фокусировку лазера CO 2 при необходимости с помощью панели калибровки и видимый He-Ne - лазера.
- Загрузите шаблон в Scriber для абляции на листе PMMA или ленты.
- Возьмите узорчатый лист или ленту, удалить ненужные куски и очистить поверхность с продувкой азотом.
Примечание: Толщина листа ПММА составляет 1 мм, и что из двухсторонней ленты составляет 0,07 мм или 0,22 мм.
2. Чип Ассамблеи
- С супер клей, приложите акриловые адаптеры (длина х ширина х высота = 10 мм х 10 мм х 5 мм, с винтовой резьбой в центре) на самом верхнем слое чипа, совместив винтовой резьбы и отверстия на верхней -Большая слой. Эти адаптеры служат средой входов / выходов и разъемы солевого мостика.
- Соберите микрожидкостных чип внутри ламинарный.
- Собрать химико-касательное напряжение микрожидкостных чип (CSS чип).
- ttach 3 листов ПММА листов сана с использованием 2 части описанной двухсторонней ленты. (Рисунок 1А и 1В).
- Добавить еще один кусок толстой 0,07 мм двухсторонней ленты к нижней части чипа и прикрепить чип к 10 см диаметром чашки Петри.
- Поместите чип сборки в вакуумной камере в течение ночи.
- Для сборки химико-электрофритюрница полевой (CEF чип), прикрепить лист ПММА к двухсторонней ленты толщиной = 0,22 мм (рис 2А и 2В).
- Прикрепите отчерченной PMMA лист и двухстороннюю ленту до 10 см диаметром чашки Петри, используя этот же кусок ленты.
- Оставьте в собранном виде чип внутри капота и подвергать его воздействию УФ в течение 30 минут для стерилизации.
- Соедините входные отверстия для двух 3-мл шприцы с помощью пластиковых труб и пальцев непроницаемого гаек. Подключите выход к трубе отходов с помощью пластиковой трубки и затянуто от руки гайки.
Примечание: Автоклавывсе трубы и гайки при 121 ° С в течение 15 мин перед использованием. - Медленно нажать на поршень шприца до простых жидкостный каналов с PBS. Нажмите шприцы назад и вперед, чтобы удалить пузырьки.
- Поместите фишки в термостате в течение ночи при температуре 37 ° С в атмосфере 5% CO 2.
Примечание: Эти два шага направлены мыть чип и удалить все оставшиеся пузырьки внутри чипа. - Возьмем чип из инкубатора.
- Подготовка агара солевые мостики для генерирования электрических полей в кристалле CEF.
- Растворите 3% легкоплавкой агарозе в фосфатном буфере 1x-солевой буферный раствор (PBS), используя микроволновую печь.
- Вводят раствор поэтапное агарозы в бридж канал соли и вставить электроды перед тем раствор затвердевает.
- Поместите серебро / серебро-хлоридные электроды в трубчатых гаек.
- Подключите шприцы к шприцевые насосы, а также поток непрерывно культуральной среды (Дульбекко модифицированная EagleR17; s среда, DMEM), в жидкостном канале в течение 10 мин при скорости потока 20 мкл / мин, чтобы заменить PBS.
3. Подготовка и Cell Экспериментальная установка
Примечание: Предварительно теплой 1x PBS, питательная среда (DMEM плюс FBS), и трипсин в C водяной бане при 37 ° перед использованием.
- Пластина 2 х 10 5 рака легких CL1-5 клетки 25,26 в 10 см чашки Петри , поставляемой с DMEM плюс 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS). Инкубируйте клетки внутри инкубатора в атмосфере 5% СО 2 при температуре 37 ° С до 90% слияния.
- Аспирируйте среды и промыть клетки один раз с предварительно нагретую 1x PBS. Добавляют 2 мл 0,05% трипсина буфера к клеткам и ждать от 2 до 3 мин при 37 ° С для отделения клеток.
- Передача клеток в 15 мл стерильной центрифужную пробирку и добавляют 6 мл культуральной среды в трубу. Аккуратно инвертировать трубку для смешивания и вынимают 5 мкл клеточной среде, содержащей для подсчета количества клеток в hemocytometeр.
- Центрифуга трубки на 300 х г в течение 5 мин. Приостановка 10 6 клеток в 1 мл культуральной среды и поместить клеточную среду , содержащую в 1 мл шприца.
- Настаивать клеточной среде, содержащей в микрожидком чип от розетки и убедитесь, что решение распространяет все через пять областей культуры. Выдержите чип внутри инкубаторе в 5% СО 2 при 37 ° С в течение 2 часов.
4. Экспериментальная установка
- Возьмите чип из инкубатора и поместить его на верхней части стекла нагревателя прозрачный оксид индия и олова (ITO).
Примечание: ИТО стекло соединено с пропорционально-интегрально-дифференциальный (PID) контроллер для поддержания температуры при 37 ± 0,5 ° С с помощью обратной связи от теплового соединителем плотно зажата между нагревателем ITO и чипом. - Поместите узел чип-нагреватель на верхней части моторизованного столика XY инвертированного микроскопа для отслеживания миграции клеток или фиксированный этап ХУинвертированный флуоресцентный микроскоп для измерения производства РОС.
- Для генерации различных химических концентраций, заполняют два шприца 5 мл химических растворов относительных концентраций 0 и 1 (растворенных в культуральной среде) и перекачивать их в чип при желаемых скоростей потока: в чипе CSS, при скорости потока 0,3 мл / мин в течение 1 ч; в чипе CEF, при скорости потока 20 мкл / мин в течение первых 20 мин и скорости потока 20 мкл / ч в течение еще 120 мин (общее время = 2 ч).
- В чипе CEF, для отслеживания миграции клеток, программу стадия XY микроскопа повторить съемки фотографий, с помощью цифровой однообъективном рефлекса (DSLR) камеры, определенной области взглядов (ПЗ) в пределах культуры районов через каждые 15 мин в течение 2 ч.
- Для измерения производства ROS, использовать флуоресцентную на основе индикатора 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce диацетат (2'-7'-DCFDA).
- Подготовить запас 2'-7'-DCFDA 10 мМ в области молекулярной биологии сорта диметилсульфоксид (ДМСО). Развести DCFDA в DMEM без сыворотки только (5 мкМ в DMEM). Потенциал деацетилаза может увеличить фоновые сигналы и уменьшить сигналы в клетках.
- Через 1 ч напряжения сдвига стимула в микросхеме CSS или через 2 часа Е.Ф. стимула в чипе CEF, насос 2'-7'-DCFDA (5 мкМ в DMEM) в чип при скорости потока 20 мкл / мин в течение первый 20 мин и скорости потока 20 мкл / ч в течение еще 20 мин. Для промывки, насос DMEM в чип при скорости потока 20 мкл / ч в течение 20 мин.
- Возьмите фотографии, через прибор с зарядовой связью (CCD) камеры, определенных областей в пределах ПЗ культуры для анализа флуоресцентных интенсивности.
5. Расчеты концентрации химического вещества, касательных напряжений и электрических полей
- В обоих чипа CSS и чипом CEF, рассчитать концентрации химического вещества в пяти областях культуры. Например, путем введения H 2 O 2 из Концations 0 и 200 мкМ из двух входных отверстий, концентрации 0, 25, 100, 175, и 200 мкМ генерируются.
Примечание: В предположении, что все жидкости сплит-поток плавно и равномерно по вилке, относительные концентрации в пяти областях культуры равны 0, 1/8, 1/2, 7/8 и 1, соответственно. - В чипе CSS, рассчитать напряжение сдвига (т) в пределах каждой из областей культуры с использованием
27, где Q является объемная скорость потока, η является жидкостный вязкость, Н представляет собой высоту канала, а W является шириной канала.
Примечание: При установке Q = 0,3 мл / мин в каждом входе (Q = 0,12 мл / мин в каждой области культуры), η = 0,0008 Па · с для культуральной среды, Н = 1 мм, и W = 1 ~ 4 мм, напряжение сдвига рассчитывается в диапазоне от 0,0048 Па (4 мм шириной области) до 0,0192 Па (1 мм шириной области). - Вчип CEF, рассчитать прочность EF в каждой из областей культуры , используя E = I / (σA EFF) (закон Ома), где я есть электрический ток , протекающий через жидкостный канал, σ является электропроводность культуральной среды, и а эфф эффективная площадь поперечного сечения проходного канала.
Примечание: Используя σ = 1,38 Ω -1 м -1 для культуральной среды и A эфф = 0,22 мм 2 (ширина = 1 мм и высотой = 0,22 мм), прочность EF рассчитывается как E (мВ / мм) = I ( A) × 3,3 × 10 6.- Как показано на рисунке 2D, рассматривать эквивалентную схему как пять кесарева сечения цепей с четырьмя (8 + 35 + 8) сегментов и один (5 + 35 + 5) сегмента.
Примечание: Анализируя эту параллельную цепь в соответствии с законом Кирхгофа напряжения и закона Ома, токи, протекающие через пять культурыа я 1 через I 5 снизу вверх, вычисляются быть около 0,49 I (область 1), 0,25 I (область 2), 0,13 I (область 3), 0,08 I (область 4), и 0,05 г (площадь 5) соответственно, где есть общий постоянный ток (DC). С помощью приложенного постоянного тока 0,157 мА, ЭФ 254, 130, 67, 41, и 26 мВ / мм генерируются в пяти областях культуры.
Примечание: Для упрощенного электрического анализа микрожидком сети, все жидкостные сегменты рассматриваются в качестве резисторов с сопротивлением, пропорциональным их длине.
- Как показано на рисунке 2D, рассматривать эквивалентную схему как пять кесарева сечения цепей с четырьмя (8 + 35 + 8) сегментов и один (5 + 35 + 5) сегмента.
27, где Q является объемная скорость потока, η является жидкостный вязкость, Н представляет собой высоту канала, а W является шириной канала. Анализ 6. Данные
Примечание: анализ данных выполняется с использованием программного обеспечения ImageJ.
- Анализ производства ROS.
- Запустите программу ImageJ. Перейти к разделу "Файл" → Открыть, чтобы загрузить флуоресцентное изображение для анализа.
- Перейти к "Изображение" → "Тип" → "16-бит", чтобы изменить IMвозраст до серой шкалы.
- Нарисуйте многоугольник вложить ячейку. Перейти к "Анализ" → "Измерить" для измерения средней интенсивности флуоресценции клетки.
- Повторите 6.1.3 для сбора интенсивности по меньшей мере, 50 ячеек трех независимых экспериментов, и вычислить среднюю интенсивность со стандартной ошибки среднего (SEM).
- Повторите 6.1.1-6.1.4 для каждого условия эксперимента.
- Анализ миграции клеток.
- Запустите программу ImageJ. Перейти к разделу "Файл" → Открыть, чтобы загрузить изображение, снятое в момент времени = 0 для анализа.
- Нарисуйте многоугольник вложить ячейку. Перейдите в раздел "Анализ" → "Измерить" для измерения центра масс ячейки , как и (х 1, у 1).
- Повторите 6.2.1- 6.2.2 для измерения центра масс той же клетке (х 2, у 2) из другого изображения принимают в момент времени = т.
- Вычислить скорость миграции (в мкм / ч)эта клетка, как
, - Повторить 6.2.1-6.2.4 для сбора скорости миграции по меньшей мере, 50 клеток трех независимых экспериментов, и вычислить среднюю скорость миграции со стандартной ошибки среднего (SEM).
- Из 6.2.2 и 6.2.3, вычислить миграции Направленность этой ячейки , как косинус & thetas или
, Где θ есть угол между вектором приложенного EF (от положительного до отрицательного) и вектор от начала до конечного положения ячейки (рис 2G). - Повторить 6.2.6 для сбора миграции, по крайней направленность не менее 50 клеток трех независимых экспериментов, и вычислить среднее миграции со стандартной направленность ошибка среднего (SEM).
- Вычислить среднюю скорость миграции с SEM и средней миграции с SEM направленность для каждого экспериментального состояния.
ПРИМЕЧАНИЕ: Направленность+1 указывает на то, что все клетки мигрируют к катоду, и значение -1 указывает на то, что все клетки мигрируют к аноду. Направленность группы случайным образом движущихся клеток близко к 0.
- Анализ Cell Alignment.
- Запустите программу ImageJ. Перейти к разделу "Файл" → "Открыть", чтобы загрузить изображение для анализа.
- Лечить клетки в виде эллипса и нарисуйте линию, чтобы указать длинной оси клетки. Перейдите в раздел "Анализ" → "Измерить" для измерения угла & beta ; между линией и горизонтальном направлении EF.
- Повторите 6.3.2 , чтобы собрать & beta ; по крайней мере , 50 клеток из трех независимых экспериментов, и вычислить среднее значение косинуса β со стандартной ошибки среднего (SEM).
- Повторите 6.3.1-6.3.3 для каждого условия эксперимента.
Примечание: A COS р +1 указывает на то, что все клетки выравнивать параллельно приложенному EF, а значение 0 указывает на то, что все клетки выравнивать perpendicularlу приложенному EF.
, 
, Где θ есть угол между вектором приложенного EF (от положительного до отрицательного) и вектор от начала до конечного положения ячейки (рис 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Химико-касательное напряжение (CSS) Чип
Чип УС состоит из трех ПММА листов, каждый толщиной 1 мм, скреплены друг с другом с помощью двух двухсторонних лент, каждая толщиной 0,07 мм (рис 1А и 1В). "Рождественская елка" структура создает пять относительных концентраций 0, 1/8, 1/2, 7/8 и 1 в пяти областях культуры. При проектировании области культуры в виде треугольника, сдвига градиента напряжения, с величиной, связанной объемной скорости потока, жидкостный вязкость и размерность струйного канала, создается в каждой из областей. Этот чип затем присоединен, через другой 0,07 мм толщиной двусторонней клейкой ленты, на чашку Петри для культивирования рака легких CL1-5 клеток и производство ROS наблюдалось в ответ на различные концентрации химического вещества и напряжений сдвига. Производство ROS в клетках рака легких сильно связан с лунг метастазирования и развития, а также некоторые химические вещества и напряжение сдвига были продемонстрированы быть вовлечены в поколение ROS 23.
Во- первых, чтобы изучить влияние H 2 O 2, химического раздражителя, на производстве ROS, клетки инкубировали с непрерывным протекании H 2 O 2 решения при 0, 25, 100, 175 и 200 мкМ. Как показано на фиг.1С, интенсивность флуоресценции возрастает при концентрации H 2 O 2 возрастает, что указывает , что H 2 O 2 стимулировал продукцию ROS. Далее, чтобы исследовать влияние напряжения сдвига на продуцирование ROS, клетки подвергали воздействию напряжения сдвига градиента 0,0048 Па до 0,0192 Па. На рис 1D показывает , что интенсивность флуоресценции возрастает при напряжении сдвига повышенной (касательные напряжения были наибольшими а самый низкий в передней и задней областях, соответственно), предложитьИнг, что более высокие напряжения сдвига индуцированных больше продукции ROS. Кроме того, этот CSS чип был использован для изучения производства ROS в ответ на различные концентрации альфа-токоферола, антиоксидант из формы витамина Е. Клетки стимулировали напряжения сдвига плюс альфа-токоферола от 0, 3.2, 12.5, 21.9 и 25 мкг / мл. Как показано на рисунке 1E, для концентрации α-токоферол ниже , чем 21,9 мкг / мл, интенсивность флуоресценции уменьшается по мере концентрации возрастает, что указывает действие альфа-токоферола в снижении производства РОС. Тем не менее, поскольку концентрация увеличена до 25 мкг / мл, средняя интенсивность также увеличилось, предполагая, что эта высокая концентрация альфа-токоферола не устранили много ROS по сравнению с более низкими концентрациями.
Химико-электрического поля (CEF) Чип
Чип КБФ изготовлена из 1 мм толщиной ПММА и 0,22-мм двусторонней клейкой ленты с жидкостных каналов узорчатых на ней (рис 2А и 2В). Аналогичным образом, "Рождественская елка" структура создает пять относительных концентраций 0, 1/8, 1/2, 7/8 и 1 в пяти областях культуры. Кроме того, эти пять параллельных областей соединены перпендикулярно образуют жидкостный путь, аналогичный электрической цепи. Электрическое поле, создаваемое в области культуры связана с проводимостью жидкости, площадь поперечного сечения канала, а также постоянного тока (DC), проходящей через область. В соответствии с законом Кирхгофа напряжения и закону Ома, токи в пяти областях культуры 0,49 I 0,25 I 0,13 I, 0,08 I, и 0,05 I, соответственно, где я это применяется постоянный ток (рис 2С). Этот чип прилагается, через густую 0,22 мм двусторонняя клейкая лента, на чашку Петри для культивирования рака легких CL1-5 клеток наблюдать миграцию клеток и Productioп ROS в ответ на различные концентрации химического вещества и электрического полей.
Во-первых, этот чип был использован для изучения производства ROS в ответ на различные концентрации хонокиол, различной степенью ЭФ и комбинированной терапии обоих. Honokiol, небольшая молекула полифенол , выделенный из рода Magnolia, было установлено, что антиангиогенные, противовоспалительные и противоопухолевые свойства в доклинических исследованиях 28. Как показано на рисунке 2D РОС производства было почти то же самое для ЭФ ниже 67 мВ / мм, но увеличивалась с увеличением ЭФ выше этого значения. Рисунок 2E показывает , что при комбинированной терапии электрических полей и гонокиол, уровень РОС остался почти то же самое, что указывает , что гонокиол тормозил производство экзогенного ROS (то есть., РОС , связанные с EF раздражитель), особенно при более высоких EFS. Миграция клеток под единым или сосуществует химической/ электрические стимулы также исследовали с помощью этого чипа CEF. Как видно на рисунке 2F, без добавления гонокиол, скорость миграции увеличилась сила EF увеличена. После добавления гонокиол различных концентраций, скорость миграции уменьшилась в целом, предполагая, что гонокиол уменьшенный миграцию клеток, возможно, посредством ингибирования продуцирования РФК. Миграция Направленность показана на рисунке 2G. При наличии EF только, клетки рака легких показал наличие отчетливых направленную миграцию к аноду (с отрицательными значениями). После добавления хонокиол различных концентраций, наблюдалось незначительное снижение миграции устремленности для всех EF-стимулированной областях.
Рисунок 1: Химико-касательное напряжение (CSS) Chip Используется для изучения влияния химических веществ и касательных напряжений на клетках рака легких 2.3
(A) Три слоя ПММА субстратов связаны друг с другом с помощью двух двухсторонних лент , чтобы сформировать чип CSS. (B) Интегрированный чип CSS. (C) Верхняя часть : Люминесцентные и светлого поля изображения CL 1-5 клеток после обработки с различными концентрациями H 2 O 2. Шкала бар = 50 мкм. Внизу: Средняя интенсивность флуоресценции с SEM нанесены при различных концентрациях H 2 O 2. (D) Верхняя часть : флуоресцентные изображения CL 1-5 клеток при различных напряжений сдвига. Шкала бар = 50 мкм. Внизу: Средняя интенсивность флуоресценции с SEM построены на различных напряжений сдвига. (E) Top: Люминесцентные и светлого поля изображения CL 1-5 клеток после стимулируются с напряжением сдвига с различными концентрациями альфа-токоферола. Шкала бар = 50 мкм. Внизу: Средняя интенсивность флуоресценции с SEM нанесены при различных концентрациях альфа-токоферола. Данные, представленные здесь шкак было первоначально опубликовано в ссылке 23. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: химико-электрического поля (CEF) Chip используется для изучения влияния химических и электрических полей на клетки рака легких 22.
(А) один слой из ПММА связан на культуральную чашку с помощью двухсторонней ленты , чтобы сформировать чип CEF. (Б) Жидкостный образец чипа CSS. (С) Эквивалентная электрическая схема микрожидком чипа. (D) Слева: Люминесцентные и ярко-полевые изображения CL 1-5 клеток после обработки различной степенью EFS. Шкала бар = 50 мкм. Справа: Среднее флуоресцентныйИнтенсивность с SEM построены на различных сильных EFS. (E) Слева: Люминесцентные и ярко-полевые изображения CL 1-5 клеток после обработки с комбинированным хонокиол и EFS. Шкала бар = 50 мкм. Справа: Средняя интенсивность флуоресценции с SEM построены при комбинированном хонокиол и EFS. (F) Скорости миграции клеток CL1-5 после обработки ЭФ только (помеченных как контроль) и комбинированной хонокиол и ЭФ (отмечен как хонокиол). (G) Миграция Направленность клеток CL1-5 после обработки ЭФ только (помеченных как контроль) и комбинированной хонокиол и ЭФ (отмечен как хонокиол). Данные , представленные здесь, первоначально была опубликована в ссылке 22. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PMMA на основе чипов, изготовленных с использованием лазерной абляции и письма, которые дешевле и проще методы по сравнению с PDMS на основе чипов, которые требуют более сложной мягкой литографии. После разработки микрожидком чипа, изготовление и сборка может быть сделано в течение всего 5 минут. Есть несколько важных шагов, которые, следует обратить внимание в проведении эксперимента. Первым из них является "монтаж" вопрос. Адаптеры должны быть надлежащим образом приклеены к самой верхней слой чипа. Клей может просочиться в жидкостных каналов, если слишком много применяется, и жидкость может вытекать из чипа, если используется слишком мало клея. Кроме того, при сборке субстраты ПММА и двухсторонний ленты, важно, чтобы оказать давление нажимать на весь чип плотно, чтобы предотвратить утечке жидкости. Во-вторых, "пузырь" вопрос. Для удаления пузырьков, 1X PBS непрерывно текли в жидкостном канале в течение 1 или 2 мин при скорости потока 20 мкл / мин, а затем чип рпронизан внутри инкубатора в течение ночи в 5% СО 2 при 37 ° С. Если имеются пузырьки, остающихся в пределах жидкостных каналов, поток будет неоднородным, вызывая неоднородное химическую концентрацию и распределение EF. В-третьих, "ячейка загрузки" вопрос. Число клеток, загруженных в областях культуры должны быть хорошо контролируется. Если номер ячейки слишком низкое, много экспериментальных пробеги должны быть проведены, чтобы собрать достаточно данных для статистических целей. Если номер ячейки слишком велико, то будет трудно различить отдельные клетки и количественной оценки их миграции.
В чипе CSS, А "Рождественская елка" структура в сочетании с треугольной области культуры порождает различные химические концентрации в пяти областях, каждая из которых имеет градиент сдвига напряжений. Жидкостная напряжения сдвига были известны, чтобы повлиять на прикрепление, морфологию, миграцию и активность клеток. Поперечные стрессы цене 0,25-0,6 Па может взаимодействовать прикрепление клеток, Были сообщены и даже более высокие значения напряжений (0,5 -10 Па) , чтобы удалить прилипшие клетки 29. Ламинарный напряжения сдвига в пределах от 0,8 до 1,5 Па выравнивание индуцированных клеток в направлении потока 30, и даже более низких значений (0,1-1 Па), как известно, влияют на клеточную морфологию и проницаемость 29. Кроме того, клетки гладких мышц подвергается сдвигу напряжений 2-120 Па наблюдалось падение числа клеток 31. Lu и др. сообщили проектирование и строительство микрофлюидальных сдвига устройств для количественного анализа клеточной адгезии 27. Напряжение сдвига в жидкостном канале был изменен путем изменения размеров канала. Чин и др. описал гемодинамической системы лаборатории на чипе для регулирования скорости потока питательной среды в микро-канала , чтобы имитировать профиль потока крови в сосуде 32. Напряжение сдвига в жидкостном канале был изменен путем изменения скорости потока среды. вSE два устройства, даже если напряжение сдвига любых значений может быть сгенерирован, только одно единственное значение было доступно в пределах одной области культуры в одно время. Для сравнения, настоящее CSS-чип имеет преимущество, обеспечивая при сдвиге градиента напряжения в одной треугольной области, увеличивая экспериментальную пропускную способность, особенно для скрининга целей.
В чипе CEF, культуральные районы "Рождественская елка" структуры находятся перпендикулярно соединены с образованием жидкостный путь, аналогичный электрической цепи. В одном применяется постоянный ток, пять EF сильные генерируются внутри областей культуры с каждая из которых имеет поток определенной химической концентрации. Обычно electrotactic эксперименты проводились на чашках Петри, где могут возникнуть проблемы неточных ЭФ, среднего испарения, большой клеток / расход реагентов, и увеличение джоулева нагрева. Замкнутые, миниатюрные микрофлюидальные устройства эффективно преодолеть эти недостатки. Например, для изучения электротаксис оF человеческой памяти крови Т - клетки, Лин и др. сообщил пластмассовый микрожидкостных устройство , содержащее два одинаковых, расположенных бок о бок микроканалы, две модифицированные наконечники пипеток послужившие средних резервуаров, а также два платиновых электродов для EF приложения 15. Для увеличения пропускной способности , PMMA на основе electrotactic чипы были изготовлены для обеспечения нескольких сильных сторон EF в одном устройстве 12,33. Кроме того, микрофлюидальные устройства, способные генерировать управляемый химических и электрических стимулов одновременно имеют высокий интерес. Ли и др. изготовил PDMS на основе микрожидкостных устройств для генерации одного или сосуществующих химические градиенты / ЭФ для исследования хемотаксиса или electrotactic миграцию Т - клеток 14. Као и др. Использовали подобную микрожидкостных устройство для модулирования хемотаксис клеток рака легких с помощью ЭФ 12. В этих двух устройств, структура Y-форма была применена для создания стабильного градиента концентрации в одном прикладном EF, Hou и др. сообщили чип многоканальный двойного электрического поля для изучения одновременного воздействия химических веществ и ЭФ на клетках рака легких 21. Это устройство было в состоянии обеспечить 8 комбинаций электрических / химических раздражителей (2 электрическая х 4 химических) в одном эксперименте. Хотя пропускная способность увеличивается, емкость этого чипа была ограничена (1) только одной силы EF (плюс один нуль в качестве контроля), и (2) четыре шприцевые насосы необходимы для перекачивания химических веществ в четырех независимых каналов. Для сравнения, настоящее КБФ чип имеет преимущество генерации пять сил EF вместе с пятью химических концентраций через один комплект электродов и 2 шприцевых насосов.
Даже если эти чипы легко быть изготовлены, они имеют некоторые ограничения. Во-первых, только пять "конкретные" концентрации и пять "специфические" EF сильные стороны могут быть получены. Во-вторых, ширина жидкостных канала не может быть менее 1 мм за счет фокусировкиСО 2 лазерный луч. Тем не менее, за счет точного контроля концентрации химического вещества в подающих и электрического тока, проходящего через жидкостный канал, любые концентрации и сильные стороны EF могут быть достигнуты в области культуры. В заключение, настоящее CSS и чипы CEF способны обеспечивать клетки с управляемыми одно- или сосуществующих химических / электрических / напряжения сдвига раздражители. В одном чипе CSS, пять различных химических концентраций в сочетании с градиентом сдвига напряжений может быть сгенерирован. Кроме того, в одном чипе CEF, пять различных химических концентраций в сочетании с пятью сильными EF могут быть созданы. Увеличивая ветви "Рождественская елка" структуры, пропускная способность этих чипов может быть дополнительно увеличена. Эти чипы продемонстрировали быть простой, экономящий время, надежной и высокой пропускной способностью платформы для исследований клеточного поведения при химических / электрических / напряжения сдвига раздражители.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J.
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
