Abstract
Mikrofluidik-Vorrichtungen sind in der Lage eine präzise und steuerbare zelluläre Mikroumgebung von pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration und andere physikalische oder chemische Stimuli zu schaffen. Sie wurden durch die Bereitstellung in vivo wie Umgebung für in - vitro - Zellstudien verwendet. Vor allem, wie Zellen als Reaktion auf chemische Gradienten, elektrische Felder und Scherspannungen hat viele Interessen gezogen, da diese Phänomene sind wichtig bei der zellulären Eigenschaften und Funktionen zu verstehen. Diese mikrofluidischen Chips von Glassubstraten, Siliciumwafern, Polydimethylsiloxan (PDMS) Polymere, Polymethylmethacrylat (PMMA) -Substraten oder Polyethylenterephthalat (PET) -Substraten hergestellt werden. Aus diesen Materialien sind PMMA-Substrate billig und leicht verarbeitet werden können Laserablation und Schreiben verwenden. Obwohl einige mikrofluidischen Vorrichtungen konstruiert und hergestellt mehrere zur Erzeugung koexistierenden chemische und elektrische Reize, keiner von ihnen wurde alseffizient genug experimentellen Wiederholungen bei der Reduzierung, insbesondere für Screening-Zwecke. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Konstruktion und Herstellung von zwei PMMA-Basis mikrofluidischen Chips für zelluläre Reaktionen zu untersuchen, bei der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und die Wanderung, die unter Ein- oder koexistieren chemisch / Elektro / Schubspannung Reize. Der erste Chip erzeugt fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8, und 1 in den Kulturbereichen zusammen mit einer Scherspannungsgefälle innerhalb jeder dieser Bereiche erzeugt. Der zweite Chip erzeugt die gleichen relativen Konzentrationen, aber mit fünf verschiedenen elektrischen Feldstärken innerhalb jeder Kulturbereich geschaffen. Diese Geräte bieten nicht nur Zellen mit einer präzisen, steuerbaren Mikroumgebung, sondern auch stark die experimentellen Durchsatz zu erhöhen.
Introduction
In vivo - Zellen werden durch eine Vielzahl von Biomolekülen , einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM), Kohlehydraten, Lipiden und anderen Zellen umgeben. Sie funktionalisieren durch Mikro-Umweltreize wie Wechselwirkungen mit ECM und Antworten auf chemische Gradienten verschiedener Wachstumsfaktoren reagieren. Herkömmlicherweise werden in vitro - Zellstudien in Zellkulturschalen durchgeführt , wobei der Verbrauch von Zellen und Reagenzien groß ist und die Zellen wachsen in einem statischen (nicht zirkulierende) -Umgebung. Vor kurzem Mikro hergestellten integrierten Geräte mit fluidische Komponenten haben eine alternative Plattform für Zellstudien in kontrollierbarer Weise zur Verfügung gestellt. Solche Vorrichtungen sind in der Lage eine genaue Mikroumgebung von chemischen und physikalischen Stimuli zu schaffen, während der Verbrauch von Zellen und Reagenzien zu minimieren. Diese mikrofluidischen Chips von Glassubstraten, Siliciumwafern, Polydimethylsiloxan (PDMS) Polymere, Polymethylmethacrylat (PMMA) Substraten hergestellt werden oder polyethyleneterephthalat (PET) Substrate 1-3. PDMS-basierte Geräte sind transparent, biokompatibel und für Gase durchlässig, so dass sie geeignet für die Langzeitzellkultur und Studien zu machen. PMMA und PET-Substrate sind billig und einfach zu verarbeiten sind Laserablation und Schreiben verwenden.
Mikrofluidik-Vorrichtungen sollten die Zellen mit einer stabilen und steuerbaren Mikroumgebung bereitzustellen, wo Zellen ausgesetzt sind unterschiedliche chemische und physikalische Reize. Beispielsweise werden Mikrofluidik-Chips verwendet, die Chemotaxis von Zellen zu untersuchen. Statt der traditionellen Methoden , die Boyden - Kammer und Kapillare 4,5 Diese miniaturisierten Fluidikvorrichtungen präzise chemische Gradienten verwenden für 1,6,7 Zellen 'Verhalten zu studieren erzeugen kann. Ein anderes Beispiel ist, Zellen 'gerichtete Migration unter elektrischen Feldern (EFS), ein Phänomen namens electro zu studieren. Electrotactic Verhalten von Zellen berichtet 8, 9 Embryonalentwicklung zur Nervenregeneration verbunden zu sein,und Wund 10,11 heilen. Und viele Studien durchgeführt wurden 12,13 die electro verschiedener Zelltypen , einschließlich Krebszellen zu untersuchen, Lymphozyten 14,15, Leukämiezellen 11, und Stammzellen 16. Herkömmlicherweise werden Petrischalen und Deckgläser verwendet für electrotactic Kammern zu bauen EFs zu erzeugen 17. Solche einfachen Setups stellen Probleme mittlerer Verdunstung und ungenau EFs, aber sie können von mikrofluidischen Vorrichtungen eingeschlossen, gut definierte fluidische Kanäle 12,18,19 überwunden werden.
Um systematisch zelluläre Reaktionen unter präzise steuerbare chemische und elektrische Reize hat, wäre es von großem Nutzen sein, um mikrofluidische Geräte entwickeln, die Zellen mit mehreren Stimuli zugleich bietet. Beispielsweise Li et al. berichteten 20 ein PDMS-basierte Mikrofluidik - Vorrichtung ein- oder koexistieren chemische Gradienten und EFs für die Erstellung. Kao et al. developed eine ähnliche Mikrofluidik - Chip 6 die Chemotaxis von Lungenkrebszellen durch EFs zu modulieren. Darüber hinaus ist der Durchsatz, Hou et al zu erhöhen. entwickelt und gefertigte Chip eine PMMA-basierten Multichannel-Dual-elektrischen Feld Zellen mit 8 verschiedenen kombinierten Reize zu bieten, wobei (2 EF Stärken x 4 chemischen Konzentrationen) 21. Um die gesamten erhöhen und die Schubspannung Reiz hinzufügen, entwickelten wir zwei PMMA-Basis mikrofluidischen Vorrichtungen zur Untersuchung von zellulären Reaktionen unter Einzel- oder koexistieren chemisch / Elektro / Schubspannung Reize.
Berichtet von Lo et al. 22,23, diese Geräte enthalten fünf unabhängige Zellkultur Kanäle unterliegt einer ständigen fluidischen fließende, die in vivo - Kreislauf - System nachahmt. In dem ersten Chip (chemisch-Scherspannung Chip oder dem CSS-Chip), fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 sind in den Kulturbereichen erzeugt wird, und einer Scherspannungsgefälle ist produced innerhalb jedes der fünf Kulturbereichen. In dem zweiten Chip (der chemisch-elektrischen Feldes Chip oder dem CEF-Chip), durch einen einzigen Satz von Elektroden und zwei Spritzenpumpen verwendet wird, werden fünf EF Stärken neben fünf verschiedenen chemischen Konzentrationen innerhalb dieser Kulturbereichen erzeugt. Numerische Berechnungen und Simulationen sind besseres Design durchgeführt, und arbeiten diese Chips und Lungenkrebszellen innerhalb dieser Vorrichtungen kultiviert unterliegen Einfach- oder koexistierenden Stimuli für ihre Antworten in Bezug auf die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu beobachten, die Migrationsrate, und die Wanderungsrichtung. Diese Chips werden demonstriert werden zeitsparend mit hohem Durchsatz und zuverlässige Geräte für die Untersuchung, wie Zellen auf verschiedene Mikro-Umweltreize reagieren.
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Protocol
1. Chip-Design und Fertigung
- Zeichnen Muster abzutragenden auf PMMA - Substraten und doppelseitige Klebebänder mit kommerziellen Software - 24.
- Um die Auswirkungen von chemischen Konzentrationen und Scherspannungen studieren, ziehen einen "Weihnachtsbaum" Muster mit unterschiedlicher Breite an seinem Ende in jeder der fünf Kulturflächen (1A und 1B).
- Um die Auswirkungen von chemischen Konzentrationen und elektrischen Feldern zu studieren, ziehen einen "Weihnachtsbaum" Muster mit zwei weiteren Fluidik - Kanäle für Salzbrücken (2A und 2B).
- Scribe ein individuelles Muster auf einer PMMA - Platte oder einem doppelseitigen Klebeband , indem die entsprechende Datei in den CO 2 -Laser scriber laden.
- Schalten Sie den Laser scriber, und überprüfen Sie die Verbindung mit dem Computer. Öffnen Sie das Muster zu abzutragenden die kommerzielle Software.
- Legen Sie eine PMMA-Platte oder ein doppelseitiges Klebeband on oben auf der Bühne des scriber. Stellen Sie den Fokus des Lasers CO 2 , falls erforderlich , die Kalibrierung bar und die sichtbare He-Ne - Laser.
- Legen Sie das Muster in die Anreißer für die Ablation auf der PMMA-Platte oder dem Band.
- Pick-up die gemusterte Folie oder ein Band, entfernen Sie unerwünschte Stücke, und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffblasen.
HINWEIS: Die Dicke der PMMA-Platte beträgt 1 mm, und die des doppelseitigen Klebebands beträgt 0,07 mm oder 0,22 mm.
2. Chipmontage
- Mit Superkleber, befestigen Acryl-Adapter (Länge x Breite x Höhe = 10 mm x 10 mm x 5 mm, mit Schraubengewinde in der Mitte) an die oberste Schicht des Chips durch das Gewinde ausrichten und die Löcher auf der Oberseite -Die meisten Schicht. Diese Adapter dienen als Medium / Auslässe und Salzbrücke Anschlüsse.
- Montieren Sie den Mikrofluidik-Chip in einer Laminar-Flow-Haube.
- Montieren Sie den chemisch-Schubspannung Mikrofluidik-Chip (CSS-Chip).
- EINttach 3 Blätter beschrieben PMMA-Platten unter Verwendung von 2 Stück doppelseitiges Klebeband beschrieben. (1A und 1B).
- Fügen Sie ein weiteres Stück der 0,07 mm dicken doppelseitigem Klebeband auf der Unterseite des Chips und befestigen Sie den Chip auf einen Durchmesser von 10 cm Petrischale.
- Setzen Sie die Montage-Chip in der Vakuumkammer über Nacht.
- Um die chemisch-elektrischen Feldchip (CEF - Chip), bringen Sie die PMMA - Platte mit einem doppelseitigen Klebeband mit einer Dicke = 0,22 mm (2A und 2B) montieren.
- Bringen Sie die beschriebenen PMMA-Platte und doppelseitiges Klebeband auf einen Durchmesser von 10 cm Petrischale das gleiche Stück Klebeband.
- Lassen Sie den montierten Chip im Inneren der Kapuze und setzen Sie es für 30 Minuten zur Sterilisation mit UV.
- Verbinden Sie die Eingänge zu zwei 3-ml-Spritzen über Kunststoffrohre und handfest Nüsse. Verbinden Sie den Ausgang zu einem Abfallrohr über einen Kunststoffschlauch und einem fingerfest Mutter.
HINWEIS: Die AutoklavenAlle Rohre und Muttern bei 121 ° C für 15 min vor der Verwendung. - Langsam drücken Sie den Kolben der Spritze zu grundieren die fluidischen Kanäle mit PBS. Push Spritzen hin und her, um Blasen zu entfernen.
- Setzen Sie die Chips in einem Inkubator über Nacht bei 37 ° C unter 5% CO 2.
HINWEIS: Diese beiden Schritte zielen darauf ab, den Chip und entfernen Sie alle verbleibenden Blasen innerhalb des Chips zu waschen. - Nehmen Sie den Chip aus dem Inkubator.
- Bereiten Agar Salzbrücken zur Erzeugung elektrischer Felder im CEF-Chip.
- Löse 3% niedrigschmelzender Agarose in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Puffer unter Verwendung einer Mikrowelle.
- Injizieren Lösung-Phasen-Agarose in die Salzbrücke Kanal und legen Sie die Elektroden vor Lösung erstarrt.
- Legen Sie Silber / Silberchlorid-Elektroden in die Rohrmuttern.
- Schließen Sie die Spritzen an die Spritzenpumpen und fließen kontinuierlich das Kulturmedium (Dulbecco modifiziertem eagler17; s medium, DMEM) in den Fluidkanal für 10 min bei einer Flussrate von 20 ul / min PBS zu ersetzen.
3. Zellpräparation und Versuchsaufbau
HINWEIS: vorwärmen 1x PBS, Kulturmedium (DMEM plus FBS) und Trypsin in einem 37 ° C Wasserbad vor dem Gebrauch.
- Platte 2 x 10 5 Zellen Lungenkrebs CL1-5 25,26 in einer 10 cm Petrischale geliefert mit DMEM plus 10% fötalem Rinderserum (FBS). Inkubieren der Zellen in einem Inkubator unter 5% CO 2 bei 37 ° C , bis 90% Konfluenz.
- Saugen Sie das Medium und waschen Sie einmal, um die Zellen mit vorgewärmten 1x PBS. 2 ml 0,05% Trypsin-Puffer zu den Zellen und warten, für 2 bis 3 min bei 37 ° C um die Zellen zu lösen.
- Transfer der Zellen in ein 15 ml steriles Zentrifugenröhrchen und 6 ml Kulturmedium in das Röhrchen. vorsichtig umdrehen das Röhrchen zum Mischen und nehmen 5 ul der zellhaltigen Medium für die Zellzahl in einem hemocytomete Zählenr.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 5 min. Suspendieren 10 6 Zellen in 1 ml Kulturmedium und legen die Zelle enthaltenden Medium in einer 1 ml - Spritze.
- die zellhaltigen Medium in den Mikrofluidik-Chip aus der Steckdose ziehen lassen und stellen Sie sicher, dass die Lösung alle durch die fünf Kulturkreisen verteilt. Inkubieren Sie den Chip im Inneren eines Inkubators unter 5% CO 2 bei 37 ° C für 2 Stunden.
4. Versuchsaufbau
- Nehmen Sie den Chip aus dem Inkubator und legen Sie es auf einer transparenten Indium-Zinn-Oxid (ITO) Glasheizung.
HINWEIS: Die ITO-Glas mit einer Proportional-Integral-Differential- (PID) -Steuerung zur Aufrechterhaltung der Temperatur bei 37 ± 0,5 ° C über Rückkopplung von einem Thermokopplers eingespannt fest zwischen der ITO-Erhitzer und dem Chip verbunden ist. - Setzen Sie den Chip-Heizanordnung auf einem motorisierten XY Bühne eines umgekehrten Mikroskops zur Nachführung der Zellmigration oder einen festen XY Stufe derein invertiertes Fluoreszenzmikroskop für die Produktion von ROS gemessen wird.
- Zur Erzeugung unterschiedlicher chemischer Konzentrationen füllen zwei Spritzen mit 5 ml von chemischen Lösungen von relativen Konzentrationen 0 und 1 (in Kulturmedium) gelöst, und die Pumpe sie in den Chip an gewünschten Strömungsraten: in der CSS-Chip, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml / min für 1 Stunde; in dem CEF-Chip, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 & mgr; l / min für die ersten 20 min und einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 & mgr; l / h für eine weitere 120 min (Gesamtzeit = 2 h).
- In der CEF-Chip, für die Verfolgung von Zellmigration, Programm der XY-Tisch des Mikroskops Fotos zu wiederholen, wobei über eine digitale einäugige Spiegelreflexkamera (DSLR) Kamera, bestimmte Sichtfelder (FOVs) innerhalb Kulturkreisen alle 15 min für 2 h.
- Für die Produktion von ROS zu messen, verwenden Sie die fluoreszenzbasierte Indikator 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetat (2'-7'-DCFDA).
- Bereiten Sie die Lager von 2'-7'-DCFDA bei 10 mM in die Molekularbiologie diMethylsulfoxid (DMSO). Verdünnte DCFDA in DMEM nur ohne Serum (5 & mgr; M in DMEM). Das Potential Deacetylase könnten die Hintergrundsignale zu erhöhen und die Signale in den Zellen zu verringern.
- Nach 1 Stunde der Scherspannung Stimulus in dem CSS-Chip oder nach 2 h EF Stimulus in dem CEF-Chip, der Pumpe 2'-7'-DCFDA (5 & mgr; M in DMEM) in den Chip mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 & mgr; l / min für die ersten 20 min und einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 & mgr; l / h für weitere 20 min. Zum Waschen, für 20 min DMEM in den Chip mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 & mgr; l / h pumpen.
- Nehmen Sie Fotos über eine Charge-Coupled Device (CCD) Kamera, bestimmter FOVs in Kulturkreisen für die Fluoreszenzintensitäten zu analysieren.
5. Die Berechnungen der chemischen Konzentrationen, Scherspannungen und elektrische Felder
- Sowohl in der CSS-Chip und dem CEF-Chip, berechnen die chemischen Konzentrationen in den fünf Kulturkreisen. Beispielsweise durch H 2 O 2 von Konzentr Injizierenations 0 und 200 & mgr; M von den zwei Einlässen, Konzentrationen von 0, 25, 100, 175, und 200 & mgr; M erzeugt werden.
HINWEIS: Unter der Annahme, dass alle Flüssigkeiten geteilter Strömung glatt und gleichmäßig um die Gabel sind die relativen Konzentrationen in den fünf Kulturbereichen 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 sind. - In der CSS - Chip berechnet man die Schubspannung (τ) in jedem der Bereiche Kultur mit
27, wobei Q der Volumenstrom ist, η die Viskosität fluidischen ist, h die Höhe des Kanals und w die Breite des Kanals.
HINWEIS: Q Einstellung = 0,3 ml / min in jedem Einlass (Q = 0,12 ml / min in jeder Kulturbereich), η = 0,0008 Pa · s für das Kulturmedium, h = 1 mm und w = 1 bis 4 mm, die Schubspannung errechnet sich aus 0,0048 Pa (4 mm breiten Bereich) bis 0,0192 Pa (1 mm breiten Bereich) zu reichen. - Imdie CEF - Chip, berechnen in jeder der Kulturbereiche der EF Stärke unter Verwendung von E = I / (& Sgr; A eff) (Ohmsche Gesetz), wobei I der elektrische Strom über den Fluidkanal fließt, σ ist die elektrische Leitfähigkeit des Kulturmediums, und A eff ist die effektive Querschnittsfläche des Kanals.
HINWEIS: Die Verwendung von σ = 1,38 Ω -1 m -1 für Kulturmedium und A eff = 0,22 mm 2 (Breite = 1 mm und Höhe = 0,22 mm) wird das EF Stärke E (mV / mm) = I berechnet werden ( A) × 3,3 × 10 6.- Wie in 2D gezeigt, mit vier (8 + 35 + 8) Segmente und eine (5 + 35 + 5) -Segment das Ersatzschaltbild als fünf C-Abschnitt Schaltungen behandeln.
Hinweis: Durch diese Parallelschaltung der Analyse zu Kirchhoffschen Spannungsgesetz und das Ohmsche Gesetz nach, Ströme über fünf Kultur fließen, sindwie, I 1 bis I 5 von unten nach oben, berechnet um 0,49 I (Bereich 1), 0,25 I (Bereich 2), 0,13 I (Bereich 3), 0,08 I (Bereich 4) und 0,05 I (Bereich sein 5) sind, wobei I die Gesamtgleichstrom (dC). Mit einer angelegten Gleich von 0,157 mA, EFs 254, 130, 67, 41 und 26 mV / mm sind in den fünf Kulturbereichen erzeugt.
HINWEIS: Für eine vereinfachte elektrische Analyse des mikrofluidischen Netzwerk, alle fluidischen Segmente werden als Widerstände mit dem Widerstand als proportional zu ihrer Länge.
- Wie in 2D gezeigt, mit vier (8 + 35 + 8) Segmente und eine (5 + 35 + 5) -Segment das Ersatzschaltbild als fünf C-Abschnitt Schaltungen behandeln.
27, wobei Q der Volumenstrom ist, η die Viskosität fluidischen ist, h die Höhe des Kanals und w die Breite des Kanals. 6. Datenanalyse
Hinweis: Die Datenanalyse ist die ImageJ-Software durchgeführt werden.
- Analysieren Sie die Produktion von ROS.
- Führen Sie die ImageJ Software. Gehen Sie auf "Datei" → Öffnen ein Fluoreszenzbild zu laden analysiert werden.
- Gehen Sie auf "Bild" → "Typ" → "16-Bit", um die im ändernAlter zu einer Grauskala.
- Zeichnen Sie ein Polygon um eine Zelle zu umschließen. Gehen Sie auf "Analysieren" → "Messen" die mittlere Fluoreszenzintensität der Zelle zu messen.
- Wiederholen 6.1.3 Intensitäten von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten sammeln, und berechnen Sie die mittlere Intensität mit Standardabweichung vom Mittelwert (SEM).
- Wiederholen Sie 6.1.1-6.1.4 für jeden experimentellen Zustand.
- Analysieren Zellmigration.
- Führen Sie die ImageJ Software. Gehen Sie auf "Datei" → Öffnen eines Bildes zum Zeitpunkt = 0 genommen zu laden analysiert werden.
- Zeichnen Sie ein Polygon um eine Zelle zu umschließen. Gehen Sie auf "Analysieren" → "Messen" , um das Zentrum der Masse der Zelle messen , wie (x 1, y 1).
- Wiederholen 6.2.1- 6.2.2 den Massenschwerpunkt der gleichen Zelle zu messen , wie (x 2, y 2) von einem anderen Bild zur Zeit t = nehmen.
- Berechnen Sie die Migrationsrate (in & mgr; m / h)Diese Zelle als
. - Wiederholen Sie 6.2.1-6.2.4 zu Migrationsraten von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten, und berechnen Sie die mittlere Wanderungsgeschwindigkeit mit Standardfehler des Mittelwertes (SEM) sammeln.
- Von 6.2.2 und 6.2.3, die Berechnung der Migration Gerichtetheit dieser Zelle als Kosinus θ oder
, Wobei θ der Winkel zwischen dem Vektor der angelegten EF (von positiv zu negativ) und der Vektor vom Start bis zur Endposition der Zelle (Figur 2G). - Wiederholen 6.2.6 Migration Gerichtetheit von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten zu sammeln, und berechnen Sie die mittlere Migration Gerichtet mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM).
- Berechnen Sie den mittleren Migrationsrate mit SEM und die mittlere Migration Gerichtet mit SEM für jede Versuchsbedingung.
HINWEIS: Ein Gerichtetvon 1 zeigt an, dass alle Zellen in Richtung der Kathode wandern, und ein Wert von -1 zeigt an, dass alle Zellen in Richtung der Anode wandern. Die Gerichtetheit einer Gruppe von zufällig bewegenden Zellen nahe 0.
- Analysieren Zellenausrichtung.
- Führen Sie die ImageJ Software. Gehen Sie auf "Datei" → "Öffnen" ein Bild zu laden, werden analysiert.
- Behandeln Sie die Zelle als eine Ellipse und ziehen Sie eine Linie, die lange Achse einer Zelle anzuzeigen. Gehen Sie auf "Analysieren" → "Messen" den Winkel messen β zwischen der Linie und der horizontalen EF - Richtung.
- Wiederholen 6.3.2 bis β von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten zu sammeln, und berechnen mittlere Kosinus β mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM).
- Wiederholen Sie 6.3.1-6.3.3 für jeden experimentellen Zustand.
HINWEIS: A cos β von +1 anzeigt , dass alle Zellen parallel zum angelegten EF auszurichten und einen 0 - Wert zeigt an, dass alle Zellen perpendicularl ausrichteny zum angelegten EF.
. 
, Wobei θ der Winkel zwischen dem Vektor der angelegten EF (von positiv zu negativ) und der Vektor vom Start bis zur Endposition der Zelle (Figur 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der Chemie-Scherspannung (CSS) Chip
Der CSS - Chip besteht aus drei PMMA - Platten, die jeweils mit einer Dicke von 1 mm angebracht , miteinander über zwei doppelseitige Klebebänder, die jeweils mit einer Dicke von 0,07 mm (1A und 1B). Der "Weihnachtsbaum" Struktur erzeugt fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 in den fünf Kulturkreisen. Durch die Ausbildung des Kulturbereich als ein Dreieck, ein Scherspannungsgefälle, mit einer Größe, um die Volumenströmungsrate, die Fluidviskosität und die Dimension des Fluidkanals Zusammenhang wird in jedem der Bereiche erzeugt. Dieser Chip wird dann angebracht, über einen weiteren 0,07 mm dicken doppelseitigen Klebebands, in eine Petrischale zum Kultivieren von Lungenkrebs CL1-5 Zellen und die Produktion von ROS wurde als Reaktion auf unterschiedlichen chemischen Konzentrationen und Schubspannungen beobachtet. Die Produktion von ROS in Lungenkrebszellen ist sehr an den lu bezogenng Krebsmetastasen und Entwicklung, und bestimmte Chemikalien und Scherspannung wurden demonstriert in ROS 23 beteiligt zu sein.
Zuerst wird die Wirkung von H 2 O 2, einem chemischen Stimulus, auf die Produktion von ROS zu untersuchen, wurden die Zellen inkubiert mit kontinuierlicher H fließ 2 O 2 -Lösungen bei 0, 25, 100, 175 und 200 uM. Wie in 1C gezeigt ist , stieg die Fluoreszenzintensität , wenn die Konzentration von H 2 O 2 erhöht, was darauf hinweist , dass H 2 O 2 die Produktion von ROS stimuliert. Als nächstes wurden die Wirkung der Scherbeanspruchung auf die Produktion von ROS, Zellen zu einer Scherspannungsgefälle von 0,0048 Pa bis 0,0192 Pa. 1D zeigt , dass die Fluoreszenzintensität (die Schubspannungen waren erhöht , da die erhöhte Scherspannung ausgesetzt zu untersuchen , die höchste und die niedrigste in der Vorder- und Rückseite Bereichen, jeweils), deuten darauf hin,ing, dass höhere Scherbeanspruchung mehr ROS-Produktion induziert. Auch wurde diese CSS-Chip verwendet, um die Produktion von ROS in Reaktion auf verschiedene Konzentrationen von α-Tocopherol zu studieren, ein Antioxidationsmittel einer Form von Vitamin E. Die Zellen wurden durch Scherspannung und α-Tocopherol von 0 stimuliert, 3,2, 12,5, 21,9 und 25 & mgr; g / ml. Wie in Figur 1E gezeigt, für α-Tocopherol - Konzentrationen von weniger als 21,9 & mgr; g / ml verringerte sich die Fluoreszenzintensität , wenn die Konzentration erhöht wird , bei der Verringerung der Produktion von ROS die Wirkung von α-Tocopherol anzeigt. Wenn jedoch die Konzentration auf 25 ug / ml erhöht wird, die mittlere Intensität ebenfalls erhöht, was darauf hindeutet, dass diese hohe Konzentration an α-Tocopherol nicht viel ROS eliminieren hat im Vergleich zu niedrigeren Konzentrationen.
Der Chemie-elektrisches Feld (CEF) Chip
Der CEF-Chip besteht aus einem 1 mm dicken PMMA und einer 0,22-mm - Doppelseitiges Klebeband mit fluidischen Kanäle auf sie gemustert (2A und 2B). In ähnlicher Weise erzeugt die "Christmas tree" -Struktur fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8, und 1 in den fünf Kulturbereichen. Darüber hinaus werden diese fünf parallele Flächen senkrecht verbunden, um einen fluidischen Pfad analog zu einer elektrischen Schaltung zu bilden. Das elektrische Feld innerhalb einer Kultur Bereich erzeugt wird, auf der Leitfähigkeit des Fluids in Beziehung, die Querschnittsfläche des Kanals, und der Gleichstrom (DC) durch den Bereich verläuft. Nach Kirchhoff Spannungs Gesetz und das Ohmsche Gesetz, sind die Ströme in den fünf Bereichen Kultur 0.49 I, 0,25 I, 0,13 I, 0,08 I und 0,05 I, bzw. wo ich die angelegte Gleich (2C) ist. Dieser Chip befestigt ist, über die 0,22 mm dicke doppelseitiges Klebeband, in eine Petrischale für die Kultivierung von Lungenkrebs CL1-5 Zellen die Zellmigration und die productio zu beobachtenn von ROS in Reaktion auf die verschiedenen chemischen Konzentrationen und elektrischen Feldern.
Zuerst wurde dieser Chip zur Untersuchung der Produktion von ROS in Reaktion auf verschiedene Konzentrationen von Honokiol, verschiedene Stärken von EFs und kombinierten Behandlungen von beiden verwendet. Honokiol, ein Polyphenol Kleinmolekül aus der Gattung isoliert Magnolia, gefunden wurde antiangiogene zu haben, entzündungshemmende und Anti - Tumor - Eigenschaften in präklinischen Studien 28. Wie in 2D gezeigt, erzeugt der ROS für EFs niedriger als 67 mV / mm nahezu gleich war, wurde aber über diesen Wert mit zunehmender EFs erhöht. 2E zeigt , dass der ROS Level unter kombinierten Behandlungen von elektrischen Feldern und Honokiol, blieb fast das gleiche, was darauf hinweist , dass Honokiol die Produktion von exogenen ROS gehemmt (dh., ROS zu EF Reiz bezogen), vor allem bei höheren EFs. Die Zellmigration unter Einzel- oder koexistieren chemischen/ Elektrische Reize wurde auch dieses CEF-Chip untersucht werden. Wie in Figur 2F ersichtlich , ohne den Zusatz von Honokiol stieg die Migrationsrate als die EF Festigkeit erhöht. Nach der Zugabe von Honokiol verschiedener Konzentrationen verringerte sich die Migrationsrate im Allgemeinen, dass Honokiol reduzierte Zellmigration was darauf hindeutet, möglicherweise die Produktion von ROS durch Hemmung. Die Migration Gerichtetheit ist in Abbildung 2G gezeigt. In Gegenwart von EF nur zeigte Lungenkrebszellen prominent gerichtete Migration in Richtung auf die Anode (negative Werte). Honokiol verschiedener Konzentrationen Nach der Zugabe gab es einen leichten Rückgang der Migration Gerichtet für alle EF-stimulierten Bereichen.
Abbildung 1: Der Chemie-Scherspannung (CSS) Chip verwendet , um die Effekte von Chemikalien zu studieren und Schubspannungen auf Lungenkrebszellen 2.3
(A) drei Schichten aus PMMA Substrate sind miteinander über zwei doppelseitige Klebebänder gebunden des CSS - Chip zu bilden. (B) Die integrierte CSS - Chip. (C) nach oben: Fluoreszierende und Hellfeld - Bilder von CL 1-5 Zellen nach mit verschiedenen Konzentrationen von H 2 O 2 behandelt wird. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Unten: Mittlere Fluoreszenzintensität mit SEM aufgetragen bei verschiedenen Konzentrationen von H 2 O 2. (D) Oben: Fluoreszenzbilder von CL 1-5 Zellen unter verschiedenen Scherspannungen. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Unten: Mittlere Fluoreszenzintensität mit SEM aufgetragen bei unterschiedlichen Scherspannungen. (E) nach oben: Fluoreszierende und Hellfeld - Bilder von CL 1-5 Zellen nach mit verschiedenen Konzentrationen von α-Tocopherol mit Schubspannung stimuliert wird. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Unten: Mittlere Fluoreszenzintensität mit SEM aufgetragen bei verschiedenen Konzentrationen von α-Tocopherol. Die präsentierten Daten hier wwie ursprünglich 23 in Bezug veröffentlicht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Der Chemie-elektrisches Feld (CEF) Chip 22 verwendet wird, die Effekte von Chemikalien und elektrische Felder auf Lungenkrebszellen zu studieren.
(A) Eine Schicht aus PMMA ist über ein doppelseitiges Klebeband auf eine Kulturschale gehalten , die CEF - Chip zu bilden. (B) Das fluidische Muster des CSS - Chip. (C) Die äquivalente elektrische Schaltung des mikrofluidischen Chips. (D) Links: Fluoreszierende und Hellfeld - Bilder von CL 1-5 Zellen , nachdem sie mit verschiedenen Stärken von EFs behandelt werden. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Rechts: Die mittlere FluoreszenzIntensität mit SEM aufgetragen bei verschiedenen Stärken von EFs. (E) Links: Fluoreszierende und Hellfeld - Bilder von CL 1-5 Zellen , nachdem sie mit kombinierten Honokiol und EFs behandelt. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Rechts: Die mittlere Fluoreszenzintensität mit SEM bei kombinierten Honokiol und EFs aufgetragen. (F) Die Migrationsraten von CL1-5 Zellen nach nur mit EFs behandelt werden (als Kontrolle markiert) und kombiniert Honokiol und EFs (markiert als Honokiol). (G) Die Migration von Gerichtet CL1-5 Zellen nach nur mit EFs behandelt werden (als Kontrolle markiert) und kombiniert Honokiol und EFs (als Honokiol markiert). Daten , die hier vorgestellt wurde ursprünglich in Bezug 22 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
PMMA-Basis-Chips werden unter Verwendung von Laserablation und Schreiben hergestellt, die sind billiger und einfacher Methoden im Vergleich zu PDMS-basierten Chips, die komplizierter Weich-Lithographie erfordern. Nach einem mikrofluidischen Chip entwerfen, können die Fertigung und Montage innerhalb von nur 5 Minuten durchgeführt werden. Es gibt einige wichtige Schritte, dass darauf zu achten, sollte das Experiment durchführen. Die erste ist die "Montage" -Ausgabe. Die Adapter sollten richtig an die oberste Schicht des Chips geklebt werden. Kleber könnte in die fluidischen Kanäle auslaufen, wenn sie zu viel aufgetragen wird, und Flüssigkeit aus dem Chip austreten könnte, wenn zu wenig Klebstoff verwendet wird. Auch die PMMA-Substrate in der Montage und die doppelseitige Klebebänder, ist es wichtig, Druck aufzubringen, um den gesamten Chip zu drücken fest jede Flüssigkeit ein Auslaufen zu verhindern. Die zweite ist die "Blase" Thema. Zu entfernen Blasen wird 1x PBS floß kontinuierlich in den Fluidkanal für 1 oder 2 min bei einer Flussrate von 20 ul / min, und dann ist der Chip püber Nacht unter 5% CO 2 bei 37 ° C innerhalb eines Inkubators geschnürt. Wenn es Blasen verbleibenden innerhalb der fluidischen Kanäle sind, wird die Strömung nicht einheitlich sein, inhomogenen chemischen Konzentration und EF Verteilung verursacht. Die dritte ist die "Zelle Laden" -Ausgabe. Die Zahl der in den Kulturbereichen geladen Zellen sollten gut gesteuert. Wenn die Zellzahl zu niedrig ist, sollten viele Versuchsdurchläufe durchgeführt werden, um genügend Daten für statistische Zwecke zu sammeln. Wenn die Zellzahl zu hoch ist, wird es schwierig sein, einzelne Zellen zu unterscheiden und ihre Migration zu quantifizieren.
In der CSS-Chip erzeugt ein "Weihnachtsbaum" Struktur mit dreieckigem Kulturbereich in fünf Bereichen unterschiedlicher chemischer Konzentrationen kombiniert, die jeweils eine Scherspannung Gradienten. Fluidic wurden Scherspannungen bekannt, die Anlage zu beeinflussen, um die Morphologie, die Migration und die Aktivität der Zellen. Schubspannungen von nur 0,25 bis 0,6 Pa Zellanheftung Schnittstelle könnteUnd sogar höhere Werte von Spannungen (0,5 -10 Pa) gemeldet wurden 29 anhaftende Zellen zu entfernen. Laminaren Scherspannungen im Bereich von 0,8 bis 1,5 Pa induzierte Zellausrichtung in Strömungsrichtung 30, und noch niedrigere Werte (0,1-1 Pa) bekannt waren , um zelluläre Morphologie und die Durchlässigkeit 29 beeinflussen. Darüber hinaus unterzogen glatten Muskelzellen Spannungen von 2-120 Pa erlebt einen Rückgang der Zellzahl 31 zu scheren. Lu et al. die Konstruktion und den Bau von mikrofluidischen Schergeräten berichtet für die quantitative Analyse der Zelladhäsion 27. Die Scherbeanspruchung innerhalb des Fluidkanals durch Ändern der Abmessungen des Kanals modifiziert. Chin et al. ein hämodynamisches Lab-on-a-Chip - System beschrieben , um die Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums in dem Mikrokanal zum Steuern der Strömungsverlauf des Blutes in dem Behälter 32 zu imitieren. Die Scherbeanspruchung innerhalb des fluidischen Kanal wurde durch Änderung der Strömungsgeschwindigkeit des Mediums modifiziert. In demse zwei Vorrichtungen, auch wenn eine Scherspannung von beliebigen Werten erzeugt werden könnte, nur einen einzigen Wert war auf einmal in einem Kulturbereich. Im Vergleich dazu hat die vorliegende CSS-Chip den Vorteil eines Scherspannungsgefälle in einem dreieckigen Bereich Bereitstellung Erhöhung des experimentellen Durchsatz insbesondere für ein Screening-Zwecke.
In der CEF-Chip, sind die Kulturbereiche des "Weihnachtsbaum" Struktur senkrecht verbunden, um einen fluidischen Pfad analog zu einer elektrischen Schaltung zu bilden. An einem Gleichstrom fünf EF Stärken angewendet werden in den Kulturbereichen erzeugt mit jedem einen Fluss einer spezifischen chemischen Konzentration aufweist. Herkömmlicherweise wurden auf Petrischalen electrotactic Experimente durchgeführt, bei denen Probleme ungenauer EFs, mittlere Verdunstung, große Zelle / Reagenzienverbrauch und eine erhöhte Joule-Erwärmung auftreten könnten. Geschlossene, Miniatur-Mikrofluidik-Vorrichtungen effizient diese Nachteile zu überwinden. Zum Beispiel, zu studieren, die electro of menschlichem Blut Gedächtnis - T - Zellen, Lin et al. berichteten zwei identischen, Seite an Seite angeordneten Mikrokanälen, zwei modifizierten Pipettenspitzen als Medienspeicher bedient, und zwei Platinelektroden für EF Anwendung eines Kunststoff mikrofluidischen Vorrichtung 15 enthält. Um den Durchsatz zu erhöhen, PMMA-basierten electrotactic Chips wurden hergestellt , um mehrere EF Stärken in einem einzigen Gerät 12,33 bereitzustellen. Auch mikrofluidischen Vorrichtungen, die zur Erzeugung von steuerbaren chemischen und elektrischen Reize gleichzeitig sind von hohem Interesse. Li et al. fabriziert eine PDMS-basierte Mikrofluidik - Vorrichtung auf einzelne oder koexistieren chemischen Gradienten / EFs zur Untersuchung der chemotaktische oder electrotactic Migration von T - Zellen 14 erzeugen. Kao et al. Eine ähnliche Mikrofluidik - Vorrichtung verwendet , um die Chemotaxis von Lungenkrebszellen zu modulieren , indem EFs 12 verwendet wird . In diesen beiden Vorrichtungen wurde eine Y-förmige Struktur mit einer stabilen Konzentrationsgradienten in einer einzigen angelegten EF zu erzeugen angewendet. Hou et al. einer mehrkanaligen-Dual-elektrischen Feld Chip berichtet die gleichzeitige Wirkung von Chemikalien und EFs auf Lungenkrebszellen 21 zu studieren. Dieses Gerät war in der Lage 8 Kombinationen von elektrischen / chemische Reize zu bieten (2 elektrische x 4 chemisch) in einem Experiment. Obwohl der Durchsatz erhöht, ist diese Fähigkeit der Chip wurde beschränkt auf (1) nur eine EF Stärke (plus eine Null als Kontrolle), und (2) vier Spritzenpumpen für das Pumpen von Chemikalien in vier unabhängige Kanäle erforderlich sind. Im Vergleich dazu hat die vorliegende CEF-Chip den Vorteil der Erzeugung von fünf EF Stärken zusammen mit fünf chemischen Konzentrationen über einen einzigen Satz von Elektroden und zwei Spritzenpumpen.
Obwohl diese Chips leicht hergestellt werden, haben sie einige Einschränkungen auf. Zunächst nur fünf "spezifischen" Konzentrationen und fünf "spezifischen" EF Stärken erzeugt werden. Zweitens kann die Breite des Fluidkanals nicht kleiner als 1 mm aufgrund der von der FokussierungsCO 2 -Laserstrahl. Jedoch durch genau die chemische Konzentration in dem Einlass und dem elektrischen Strom, der durch den Fluidkanal zu steuern, kann jede Konzentration und EF Stärken können in den Kulturbereichen erreicht werden. Abschließend sind die vorliegende CSS und CEF-Chips in der Lage, Zellen mit steuerbaren Einzel- oder koexistieren chemisch / Elektro / Schubspannung Reize bietet. In einem einzigen Chip CSS, fünf verschiedenen chemischen Konzentrationen in Kombination mit einem Scherspannungsgefälle erzeugt werden. Darüber hinaus können in einem einzigen Chip CEF, fünf verschiedenen chemischen Konzentrationen in Kombination mit fünf EF Stärken erzeugt werden. Durch die Erhöhung der Zweige des "Christmas tree" -Struktur, der Durchsatz dieser Chips weiter erhöht werden kann. eine einfache, zeitsparende, zuverlässige und Hochdurchsatz-Plattform sein für Untersuchungen von Zellverhalten unter chemischen / Elektro / Schubspannung Reize Diese Chips werden demonstriert.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
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