Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصميم الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الردود الخليوي تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية / إجهاد القص المحفزات

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54397
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 3, 1
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

Abstract

أجهزة ميكروفلويديك قادرة على خلق الخلوية البيئة الصغيرة الدقيقة والسيطرة عليها من درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وتركيز الملح، وغيرها من المحفزات المادية أو الكيميائية. وقد تستخدم عادة لفي الدراسات المختبرية الخلية من خلال توفير في الجسم الحي مثل المناطق المحيطة بها. خصوصا، كيف إستجابة الخلايا لالتدرجات الكيميائية، المجالات الكهربائية، واجهادات القص وضعت العديد من المصالح حيث أن هذه الظواهر ليست مهمة في فهم خصائص ووظائف الخلوية. هذه الرقائق الموائع الدقيقة يمكن أن تكون مصنوعة من ركائز الزجاج، رقائق السليكون، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) البوليمرات، البولى (PMMA) ركائز، أو بولي إيثيلين تيرفثالات ركائز (PET). من هذه المواد، ركائز PMMA رخيصة ويمكن معالجتها بسهولة باستخدام الاستئصال بالليزر والكتابة. على الرغم من أن عدد قليل من أجهزة ميكروفلويديك وقد تم تصميم وملفقة لتوليد متعددة، تتعايش المحفزات الكيميائية والكهربائية، اعتبر أيا منهافعالة بما فيه الكفاية في الحد من تكرار التجربة، خاصة لأغراض الفحص. في هذا التقرير، وصفنا لدينا تصميم وتصنيع اثنين من رقائق ميكروفلويديك القائم على PMMA للتحقيق في الاستجابات الخلوية، في إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية والهجرة، تحت الكيميائية / الكهربائية محفزات الإجهاد / القص واحدة أو التعايش. الشريحة الأولى يولد خمسة تركيزات النسبية من 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 في المناطق الثقافة، جنبا إلى جنب مع التدرج إجهاد القص التي تنتج داخل كل من هذه المجالات. الشريحة الثانية يولد نفس التركيزات النسبية، ولكن مع خمسة مختلفة شدة المجال الكهربائي التي تم إنشاؤها ضمن كل منطقة ثقافة. هذه الأجهزة لا توفر سوى الخلايا مع دقة، يمكن السيطرة عليها البيئة الصغيرة، ولكن أيضا زيادة كبيرة في الإنتاجية التجريبية.

Introduction

في محاصرون خلايا الجسم الحي من قبل مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والكربوهيدرات، والدهون، والخلايا الأخرى. أنها functionalize من خلال الاستجابة للمؤثرات البيئية الصغيرة مثل التفاعل مع ECM والردود على التدرجات الكيميائية من عوامل النمو المختلفة. تقليديا، يتم إجراء دراسات الخلايا في المختبر في أطباق زراعة الخلايا حيث استهلاك الخلايا والكواشف كبير وتنمو الخلايا في ثابت (غير المتداولة) البيئة. في الآونة الأخيرة، وقد وفرت الأجهزة ملفقة الصغيرة تتكامل مع مكونات الموائعية منصة بديلة للدراسات الخلية بطريقة أكثر يمكن السيطرة عليها. هذه الأجهزة قادرة على خلق بيئة صغيرة دقيقة من المحفزات الكيميائية والفيزيائية مع التقليل من استهلاك الخلايا والكواشف. ويمكن إجراء هذه الرقائق ميكروفلويديك من ركائز الزجاج، رقائق السليكون، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) البوليمرات، البولى (PMMA) ركائز، أو polyethylenetereالفثالات (PET) ركائز 1-3. الأجهزة القائمة PDMS-شفافة وحيويا، ومنفذة للغازات، مما يجعلها مناسبة لزراعة الخلايا على المدى الطويل والدراسات. PMMA وPET ركائز هي رخيصة وسهلة لتتم معالجتها باستخدام الاستئصال بالليزر والكتابة.

يجب أن أجهزة ميكروفلويديك توفر الخلايا مع الدقيقة بيئة مستقرة وتحت السيطرة حيث الخلايا تخضع للمؤثرات الفيزيائية الكيميائية المختلفة و. على سبيل المثال، تستخدم رقائق ميكروفلويديك لدراسة الكيميائي للخلايا. بدلا من الطرق التقليدية التي تستخدم بويدن غرفة والشعرية 4،5 هذه الأجهزة الموائعية المنمنمة يمكن أن تولد التدرجات الكيميائية الدقيقة لدراسة السلوكيات الخلايا 1،6،7. مثال آخر هو دراسة هجرة الخلايا الاتجاه تحت المجالات الكهربائية (EFS)، وهي ظاهرة اسمه انجذاب كهربي. تم الإبلاغ عن السلوكيات Electrotactic من الخلايا لتكون ذات صلة تجديد الأعصاب 8، 9 التطور الجنيني،والتئام الجروح 10،11. وأجريت العديد من الدراسات للتحقيق في انجذاب كهربي من مختلف أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا سرطان 12،13، 14،15 الخلايا اللمفية، خلايا سرطان الدم 11، والخلايا الجذعية 16. تقليديا، يتم استخدام أطباق بتري ونظارات غطاء لبناء غرف electrotactic لتوليد التماثلية 17. هذه الاجهزة بسيطة تثير مشاكل التبخر المتوسطة والتماثلية غير دقيقة، ولكن يمكن التغلب عليها عن طريق أجهزة ميكروفلويديك قنوات الموائعية المغلقة، واضحة المعالم 12،18،19.

لدراسة منهجية الاستجابات الخلوية تحت مؤثرات الكيميائية والكهربائية الدقيقة، يمكن السيطرة عليها، فإنه سيكون ذا فائدة كبيرة لتطوير أجهزة ميكروفلويديك قادرة على توفير الخلايا مع مؤثرات متعددة في نفس الوقت. على سبيل المثال، لي وآخرون. ذكرت جهاز ميكروفلويديك القائم PDMS لخلق واحدة أو تتعايش التدرجات الكيميائية والتماثلية 20. كاو وآخرون. ديفهربت شريحة ميكروفلويديك مماثل لتعديل الكيميائي للخلايا سرطان الرئة بواسطة التماثلية 6. وعلاوة على ذلك، لزيادة الإنتاجية، هوى وآخرون. تصميم وملفقة شريحة متعددة المزدوج والكهربائية والميدانية القائمة على PMMA لتوفير الخلايا مع 8 مختلف المحفزات مجتمعة، (تركيز 2 نقاط القوة EF × 4 الكيميائية) يجري 21. لزيادة في جميع أنحاء وإضافة حافز إجهاد القص، وضعنا جهازين ميكروفلويديك القائم على PMMA لدراسة الاستجابات الخلوية تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية محفزات الإجهاد / القص.

رواه لو وآخرون 22،23، وهذه الأجهزة تحتوي على خمس قنوات الثقافة خلية مستقلة تخضع لالمستمر فلويديك التدفق، ومحاكاة في الجسم الحي الدورة الدموية. في الشريحة الأولى (المادة الكيميائية القص رقاقة الإجهاد أو رقاقة CSS)، وخمسة تركيزات النسبية من 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 يتم إنشاؤها في المناطق الثقافة، والتدرج إجهاد القص هو الم Ùدائرة الهندسة المدنية داخل كل مجال من مجالات الثقافة الخمسة. في الشريحة الثانية (رقاقة الكيميائية الكهربائية الحقل أو رقاقة مركز دراسات الحدود)، وذلك باستخدام مجموعة واحدة واحدة من الأقطاب الكهربائية ومضخات 2 حقنة، يتم إنشاء خمسة نقاط القوة EF بالإضافة إلى خمسة التركيزات الكيميائية المختلفة داخل هذه المناطق الثقافة. يتم تنفيذ العمليات الحسابية العددية ومحاكاة لتصميم أفضل وتعمل هذه الرقائق، وخلايا سرطان الرئة مثقف داخل هذه الأجهزة تخضع للمؤثرات واحدة أو التعايش لرصد استجاباتها فيما يتعلق إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، معدل الهجرة، واتجاه الهجرة. وأثبتت هذه الرقائق لتكون، الإنتاجية العالية والأجهزة الموثوقة للتحقيق في كيفية استجابة الخلايا لمختلف المحفزات الدقيقة البيئية لتوفير الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم رقاقة وتلفيق

  1. رسم أنماط أن يكون ذاب على ركائز PMMA والأشرطة ضعف الجانب باستخدام البرمجيات التجارية (24).
    1. لدراسة تأثيرات التركيزات الكيميائية والضغوط القص، رسم "شجرة عيد الميلاد" نمط بعرض متفاوتة في نهايته في كل مجال من مجالات الثقافة الخمس (الشكل 1A و 1B).
    2. لدراسة تأثيرات التركيزات الكيميائية والمجالات الكهربائية، رسم "شجرة عيد الميلاد" نمط مع اثنين من أكثر القنوات الموائعية للجسور الملح (الشكل 2A و 2B).
  2. الكاتب نمط الفردية على ورقة PMMA أو الشريط المزدوج الجانب عن طريق تحميل الملف المقابل إلى خطاط ليزر CO 2.
    1. بدوره على الناسخ الليزر، وتحقق من ارتباطه بجهاز الكمبيوتر. فتح نمط أن يكون ذاب باستخدام البرمجيات التجارية.
    2. وضع ورقة PMMA أو الوجهين الشريط سن أعلى مرحلة من الناسخ. ضبط بؤرة ليزر CO 2 إذا لزم الأمر باستخدام شريط المعايرة ومرئية ليزر وني.
    3. تحميل نمط إلى خطاط لالاجتثاث على ورقة PMMA أو الشريط.
    4. التقط ورقة منقوشة أو الشريط، وإزالة قطع غير المرغوب فيها، وتنظيف السطح مع تهب النيتروجين.
      ملاحظة: سمك ورقة PMMA هي 1 ملم، وذلك من وجهين الشريط هو 0.07 ملم أو 0.22 مم.

2. الجمعية رقاقة

  1. مع سوبر الغراء، ونعلق محولات الاكريليك (طول × عرض × الارتفاع = 10 مم × 10 مم × 5 مم، مع المواضيع المسمار في الوسط) إلى الأعلى الأكثر طبقة من شرائح عن طريق مواءمة المواضيع المسمار والثقوب على أعلى طبقة -most. هذه المحولات بمثابة المتوسطة مداخل / مخارج والروابط جسر الملح.
  2. تجميع رقاقة ميكروفلويديك داخل غطاء تدفق الصفحي.
  3. تجميع رقاقة ميكروفلويديك الإجهاد الكيميائية القص (CSS رقاقة).
    1. اttach 3 ورقة من أوراق PMMA مكتوب باستخدام 2 قطعة من مكتوب الشريط على الوجهين. (الشكل 1A و 1B).
    2. إضافة المزيد من قطعة واحدة من الشريط مزدوجة من جانب 0.07 مم إلى الجزء السفلي من رقاقة وإرفاق رقاقة إلى 10 سم القطر طبق بيتري.
    3. وضع رقاقة تجميع في فراغ الغرفة ليلة وضحاها.
  4. لتجميع شرائح الحقل الكيميائية الكهربائية (مركز دراسات الحدود رقاقة)، ​​ونعلق ورقة PMMA إلى الشريط على الوجهين من سمك = 0.22 مم (الشكل 2A و 2B).
    1. إرفاق ورقة PMMA مكتوب والشريط على الوجهين إلى 10 سم القطر طبق بيتري باستخدام هذا نفس قطعة من الشريط.
  5. ترك الشريحة تجميعها داخل غطاء محرك السيارة وتعرضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة للتعقيم.
  6. ربط مداخل لاثنين من الحقن 3 مل عبر أنابيب بلاستيكية والمكسرات إصبع ضيق. قم بتوصيل منفذ لأنبوب النفايات عبر أنبوب بلاستيكي والجوز إصبع ضيق.
    ملاحظة: الأوتوكلافجميع الأنابيب والمكسرات في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
  7. خفض ببطء الغطاس على حقنة لرئيس الوزراء القنوات الموائعية مع برنامج تلفزيوني. دفع الحقن ذهابا وإيابا لإزالة الفقاعات.
  8. وضع رقائق داخل حاضنة ليلا 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2.
    ملاحظة: وتهدف هذه خطوتين لغسل رقاقة وإزالة أي فقاعات المتبقية داخل رقاقة.
  9. تأخذ شريحة من الحاضنة.
  10. إعداد الجسور الملح أجار لتوليد المجالات الكهربائية في رقاقة مركز دراسات الحدود.
    1. حل 3٪ انصهار منخفضة الاغاروز نقطة في المخزن 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام الميكروويف.
    2. حقن الاغاروز في القناة جسر الملح على مراحل الحل وإدراج الأقطاب قبل يتصلب حل.
    3. وضع أقطاب الفضة / الفضة كلوريد في المكسرات الأنبوبية.
  11. ربط المحاقن إلى مضخات الحقنة، وباستمرار تدفق مستنبت (Dulbecco لتعديل EagleR17؛ ق المتوسطة، DMEM) في قناة الموائعية لمدة 10 دقيقة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة ليحل محل برنامج تلفزيوني.

إعداد 3. خلية وإعداد التجريبية

ملاحظة: قبل الدافئ برنامج تلفزيوني 1X، مستنبت (DMEM زائد FBS)، والتربسين في 37 ° C حمام الماء قبل الاستخدام.

  1. لوحة 2 × 10 سرطان الرئة 5 خلايا CL1-5 25،26 في طبق بتري 10 سم المتوفرة مع DMEM زائد 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). احتضان الخلايا داخل حاضنة تحت 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية حتى 90٪ التقاء.
  2. نضح المتوسطة ويغسل خلايا مرة واحدة مع درجة حرارة ما قبل برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 2 مل من العازلة التربسين 0.05٪ إلى الخلايا والانتظار لمدة 2 إلى 3 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
  3. نقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي معقمة وإضافة 6 مل من مستنبت في أنبوب. عكس بلطف أنبوب لخلط وإخراج 5 ميكرولتر من المتوسطة التي تحتوي على خلية لإحصاء عدد الخلايا في hemocytometeص.
  4. أنبوب الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. تعليق 10 6 الخلايا في 1 مل من مستنبت ووضع المتوسطة التي تحتوي على خلية في حقنة 1 مل.
  5. لبث المتوسطة التي تحتوي على الخلايا في رقاقة ميكروفلويديك من مأخذ وتأكد من أن الحل يوزع كل ذلك من خلال مجالات الثقافة الخمسة. احتضان شريحة داخل حاضنة تحت 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

4. إعداد التجريبية

  1. تأخذ شريحة من الحاضنة ووضعه على رأس سخان الزجاج الشفاف أكسيد الإنديوم القصدير (ايتو).
    ملاحظة: يتم توصيل زجاج ايتو إلى وحدة تحكم يتناسب-لا يتجزأ المشتقة (PID) للحفاظ على درجة حرارة 37 ± 0.5 درجة مئوية عن طريق التغذية المرتدة من مقرنة الحراري فرضت بإحكام بين سخان ايتو ورقاقة.
  2. وضع التجميع رقاقة سخان على رأس مرحلة XY بمحركات من مجهر مقلوب لتتبع هجرة الخلايا أو مرحلة XY ثابتالمجهر الفلورسنت المقلوب لقياس إنتاج ريوس.
  3. لتوليد التركيزات الكيميائية المختلفة، وملء اثنين من المحاقن مع 5 مل من المحاليل الكيميائية تركيزات النسبية 0 و 1 (المنحلة في مستنبت) ويضخ منها إلى رقاقة في معدلات تدفق المطلوب: في الشريحة المغلق، بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة لمدة 1 ساعة. في رقاقة مركز دراسات الحدود، بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة لدقيقة 20 الأولى ومعدل التدفق من 20 ميكرولتر / ساعة لمدة 120 دقيقة (مجموع الوقت = 2 ساعة) آخر.
  4. في رقاقة مركز دراسات الحدود، لتتبع هجرة الخلايا، برنامج المرحلة XY من المجهر لتكرار التقاط الصور، عبر الرقمية أحادية العدسة العاكسة (DSLR) وكاميرا، من مجال معين في وجهات النظر (FOVs) داخل مناطق ثقافة كل 15 دقيقة لمدة 2 ساعة.
  5. لقياس إنتاج ريوس، استخدم المؤشر القائم على مضان 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce ثنائي الأسيتات (2'-7'-DCFDA).
    1. إعداد مخزون 2'-7'-DCFDA في 10 ملم في البيولوجيا الجزيئية الصف ديسلفوكسيد ميثيل ([دمس]). تمييع DCFDA في DMEM فقط دون مصل (5 ميكرومتر في DMEM). وdeacetylase المحتملة يمكن أن يزيد من الإشارات الخلفية ويقلل من الإشارات في الخلايا.
    2. بعد 1 ساعة من التحفيز إجهاد القص في رقاقة CSS أو بعد 2 ساعة من التحفيز EF في رقاقة مركز دراسات الحدود، ضخ 2'-7'-DCFDA (5 ميكرومتر في DMEM) في رقاقة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة ل أول دقيقة 20 ومعدل التدفق من 20 ميكرولتر / ساعة لمدة 20 دقيقة أخرى. للغسيل، ضخ DMEM في رقاقة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / ساعة لمدة 20 دقيقة.
    3. التقاط الصور عن طريق كاميرا الجهاز المسؤول عن جانب (CCD)، من يقين FOVs داخل المناطق الثقافة لتحليل شدة الفلورسنت.

5. حسابات التركيزات الكيميائية، تؤكد القص، والحقول الكهربائية

  1. في كل رقاقة CSS ورقاقة مركز دراسات الحدود، وحساب تركيزات المواد الكيميائية في مجالات الثقافة الخمسة. على سبيل المثال، عن طريق حقن H 2 O 2 من concentrبالجمع 0 و 200 ميكرومتر من مداخل اثنين، وتركيزات 0، 25، يتم إنشاء 100، 175، و 200 ميكرومتر.
    ملاحظة: بافتراض أن جميع السوائل تقسيم تدفق بسلاسة وعلى قدم المساواة في جميع أنحاء مفترق الطرق، وتركيزات النسبية في المناطق الثقافة الخمسة هي 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 على التوالي.
  2. في الشريحة المغلق، وحساب إجهاد القص (τ) في كل مجال من مجالات الثقافة باستخدام المعادلة 1 27، حيث س هو معدل حجم التدفق، η هو اللزوجة الموائعية، ح هو ارتفاع للقناة، وث هو عرض القناة.
    ملاحظة: من خلال وضع س = 0.3 مل / دقيقة في كل مدخل (Q = 0.12 مل / دقيقة في كل مجال من مجالات الثقافة)، η = 0.0008 با · الصورة لمستنبت، ح = 1 ملم، وث = 1 ~ 4 ملم، و يتم احتساب إجهاد القص تتراوح بين 0.0048 باسكال (4 ملم منطقة واسعة) إلى 0.0192 باسكال (1 ملم منطقة واسعة).
  3. فيرقاقة مركز دراسات الحدود، وحساب قوة EF في كل مجال من مجالات الثقافة باستخدام E = I / (الزراعة العضوية EFF) (قانون أوم)، حيث الأول هو التيار الكهربائي التي تتدفق عبر القناة الموائعية، σ هو الموصلية الكهربائية للمستنبت، ووممثل المؤسسة هي منطقة فعالة مستعرضة للقناة.
    ملاحظة: استخدام σ = 1.38 Ω -1 م -1 لمستنبت و A ممثل المؤسسة = 0.22 مم 2 (العرض = 1 ملم والارتفاع = 0.22 ملم)، ويتم احتساب قوة EF لتكون E (السيارات / مم) = أنا ( أ) × 3.3 × 10 6.
    1. كما هو مبين في الشكل 2D، علاج الدائرة المكافئة كما خمس دوائر قيصرية مع أربعة (8 + 35 + 8) قطاعات واحد (5 + 35 + 5) قطعة.
      ملاحظة: من خلال تحليل هذه الدوائر المتوازية وفقا للقانون الجهد كيرشوف وقانون أوم، التيارات المتدفقة عبر خمسة الثقافة هيكما، وأنا من 1 إلى I 5 من أسفل إلى أعلى، وتحسب أن يكون حوالي 0.49 الأول (منطقة 1)، 0.25 الأول (المنطقة 2)، 0.13 الأول (منطقة 3)، 0.08 الأول (مساحتها 4)، و 0.05 الأول (المنطقة 5) على التوالي، حيث أنا هو مجموع المباشرة الحالية (العاصمة). مع العاصمة تطبيقها من 0.157 مللي أمبير، التماثلية من 254، 130، 67، 41، و 26 فولت / مم يتم إنشاؤها داخل المناطق الثقافة الخمسة.
      ملاحظة: للاطلاع على تحليل الكهربائي مبسط للشبكة ميكروفلويديك، تعتبر جميع قطاعات الموائعية كما المقاومات مع المقاومة يتناسب مع أطوالها.

تحليل 6. البيانات

ملاحظة: يتم إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج يماغيج.

  1. تحليل الإنتاج ريوس.
    1. تشغيل برنامج ImageJ. انتقل إلى "ملف" → فتح لتحميل صورة الفلورسنت ليتم تحليلها.
    2. انتقل إلى "صورة" → "النوع" → "16 بت" لتغيير ايمالعمر إلى اللون الرمادي.
    3. رسم مضلع أن أرفق خلية. انتقل إلى "تحليل" → "القياس" لقياس كثافة الفلورسنت يعني من الخلية.
    4. كرر 6.1.3 لجمع شدة من 50 خلايا على الاقل من ثلاث تجارب مستقلة، وحساب كثافة متوسط ​​مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
    5. كرر 6.1.1-6.1.4 لكل حالة تجريبية.
  2. تحليل الهجرة الخلية.
    1. تشغيل برنامج ImageJ. انتقل إلى "ملف" → فتح لتحميل صورة أخذت في الوقت = 0 لتحليلها.
    2. رسم مضلع أن أرفق خلية. انتقل إلى "تحليل" → "القياس" لقياس مركز كتلة الخلية كما (س 1، ص 1).
    3. كرر 6.2.1- 6.2.2 لقياس مركز الكتلة من نفس الزنزانة (س 2، ص 2) من صورة أخرى تأخذ في الوقت = ر.
    4. حساب معدل الهجرة (في ميكرون / ساعة) منهذه الخلية كما المعادلة 2 .
    5. كرر 6.2.1-6.2.4 لجمع معدلات الهجرة من 50 خلايا على الاقل من ثلاث تجارب مستقلة، وحساب معدل الهجرة متوسط ​​مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
    6. من 6.2.2 و6.2.3، وحساب توجيه الأعضاء الهجرة من هذه الخلية كما θ جيب التمام أو المعادلة 3 حيث θ هي الزاوية بين متجه من EF التطبيقية (من الموجب إلى السالب) والمتجه من البداية إلى نهاية الموقف من الخلية (الشكل 2G).
    7. كرر 6.2.6 لجمع توجيه الأعضاء الهجرة من 50 خلايا على الاقل من ثلاث تجارب مستقلة، وحساب توجيه الأعضاء الهجرة متوسط ​​مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
    8. حساب معدل الهجرة متوسط ​​مع وزارة شؤون المرأة وتوجيه الأعضاء الهجرة متوسط ​​مع SEM لكل حالة تجريبية.
      ملاحظة: توجيه الأعضاء+1 يشير إلى أن جميع الخلايا تهاجر نحو الكاثود، وقيمة -1 إلى أن جميع الخلايا ترحيل نحو القطب الموجب. وتوجيه الأعضاء من مجموعة من الخلايا تتحرك عشوائيا بالقرب 0.
  3. تحليل محاذاة الخلية.
    1. تشغيل برنامج ImageJ. انتقل إلى "ملف" → "فتح" لتحميل صورة ليتم تحليلها.
    2. علاج الخلايا باعتبارها القطع الناقص ورسم خط للإشارة إلى المحور الطويل للخلية. انتقل إلى "تحليل" → "القياس" لقياس زاوية β بين خط واتجاه EF الأفقي.
    3. كرر 6.3.2 لجمع β من 50 خلايا على الاقل من ثلاث تجارب مستقلة، وحساب متوسط ​​جيب التمام β مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
    4. كرر 6.3.1-6.3.3 لكل حالة تجريبية.
      ملاحظة: كوس β من +1 إلى أن جميع الخلايا محاذاة بالتوازي مع EF التطبيقية، وقيمة 0 يشير إلى أن جميع الخلايا محاذاة perpendicularlذ إلى EF التطبيقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الإجهاد الكيميائية القص (CSS) رقاقة

ويتكون رقاقة CSS من ثلاث ورقات PMMA، كل من سمك 1 ملم، وتعلق معا عن طريق اثنين من الأشرطة على الوجهين، كل من سمك 0.07 مم (الشكل 1A و 1B). "شجرة عيد الميلاد" هيكل يولد خمسة تركيزات النسبية من 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 في مجالات الثقافة الخمسة. من خلال تصميم منطقة الثقافة باعتبارها مثلث، إجهاد القص التدرج، بلغت قوته المتعلقة معدل حجم التدفق، واللزوجة الموائعية، والبعد عن القناة الموائعية، والتي تم إنشاؤها ضمن كل من المجالات. ومن ثم تعلق هذه الشريحة، عبر 0.07 مم الشريط على الوجهين آخر، إلى طبق بيتري لزراعة الخلايا CL1-5 سرطان الرئة ولوحظ أن إنتاج ROS ردا على التركيزات الكيميائية المختلفة والضغوط القص. إنتاج ROS في خلايا سرطان الرئة يرتبط بشدة للووقد تجلت نانوغرام الانبثاث سرطان والتنمية، وبعض المواد الكيميائية وإجهاد القص للمشاركة في الجيل ROS 23.

أولا، لدراسة تأثير H 2 O 2، والتحفيز الكيميائي، على إنتاج ROS، وحضنت الخلايا مع تدفق مستمر من H 2 O 2 الحلول في 0، 25، 100، 175، و 200 ميكرومتر. كما هو مبين في الشكل 1C، زادت كثافة الفلورسنت كما تركيز H 2 O 2 زيادة، مشيرا إلى أن H 2 O 2 حفز إنتاج ريوس. المقبل، لدراسة تأثير إجهاد القص على إنتاج ROS، تعرض الخلايا إلى الانحدار إجهاد القص من 0.0048 السلطة الفلسطينية إلى 0.0192 السلطة الفلسطينية. ويبين الشكل 1D أن كثافة الفلورسنت زادت مثل إجهاد القص زيادة (كانت الضغوط القص الأعلى وأدناها في المناطق الأمامي والخلفي، على التوالي)، واقتراحجي أن ارتفاع إجهاد القص يسببها زيادة الإنتاج ROS. أيضا، تم استخدام هذه الشريحة CSS لدراسة إنتاج ROS ردا على تركيزات مختلفة من ألفا-توكوفيرول، وحفز مضاد للأكسدة شكل من أشكال فيتامين E. خلايا من إجهاد القص بالإضافة إلى α-توكوفيرول 0، 3.2، 12.5، 21.9 ، و 25 ميكروغرام / مل. كما هو مبين في الشكل 1E، لتركيزات α-توكوفيرول أقل من 21.9 ميكروغرام / مل، انخفضت كثافة الفلورسنت كما تركيز زيادة، مما يدل على تأثير α-توكوفيرول في الحد من إنتاج روس. لكن، وكما زاد تركيز 25 ميكروغرام / مل، وزيادة كثافة يعني أيضا، مما يشير إلى أن هذه نسبة عالية من α-توكوفيرول لا يلغي ROS بكثير بالمقارنة مع لتركيزات أقل.

الكيميائية والكهرباء الميدان (مركز دراسات الحدود) رقاقة

ويتكون رقاقة مركز دراسات الحدود من PMMA 1 مم سميكة و0.22 ملم الشريط على الوجهين مع قنوات الموائعية نقوش على ذلك (الشكل 2A و 2B). وبالمثل، فإن "شجرة عيد الميلاد" هيكل يخلق خمسة تركيزات النسبية من 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 في مجالات الثقافة الخمسة. وبالإضافة إلى ذلك، وترتبط هذه المجالات الخمسة المتوازية عموديا لتشكيل مسار فلويديك مماثلة إلى الدوائر الكهربائية. يرتبط الحقل الكهربائي المتولدة داخل منطقة الثقافة الموصلية من السوائل، ومساحة المقطع العرضي للقناة، والتيار المباشر (العاصمة) تمر في المنطقة. وفقا للقانون الجهد كيرشوف وقانون أوم، والتيارات في مجالات الثقافة الخمسة هي 0.49 الأول، 0.25 الأول، 0.13 الأول، 0.08 الأول، و 0.05 الأول، على التوالي، حيث أنا هي العاصمة التطبيقية (الشكل 2C). يتم إرفاق هذه الشريحة، من خلال 0.22 مم الشريط على الوجهين، إلى طبق بيتري لزراعة الخلايا CL1-5 سرطان الرئة لمراقبة الهجرة الخلية وإنتجن ريوس ردا على التركيزات الكيميائية المختلفة والمجالات الكهربائية.

أولا، تم استخدام هذه الشريحة لدراسة إنتاج ROS ردا على تركيزات مختلفة من honokiol، نقاط قوة مختلفة من التماثلية، والعلاجات مجتمعة على حد سواء. Honokiol، وهي مادة البوليفينول جزيء صغير معزول عن جنس ماغنوليا، وجدت لديك antiangiogenic، المضادة للالتهابات، وخصائص مضادة للورم في الدراسات قبل السريرية 28. كما هو مبين في الشكل 2D، وROS أنتجت كان تقريبا الشيء نفسه بالنسبة التماثلية أقل من 67 فولت / مم، ولكن تم زيادة مع زيادة التماثلية أعلى من هذه القيمة. ويبين الشكل 2E أنه في ظل العلاجات مجتمعة من المجالات الكهربائية وhonokiol، ومستوى ROS بقي تقريبا نفسه، مشيرا إلى أن honokiol تحول دون إنتاج ROS الخارجية (أي، ROS المتعلقة التحفيز EF)، وخصوصا في ظل التماثلية أعلى. هجرة الخلايا تحت كيميائية واحدة أو تتعايشوكان التحقيق المحفزات / الكهربائية أيضا باستخدام هذه الشريحة مركز دراسات الحدود. كما رأينا في الشكل 2F، دون إضافة honokiol، ارتفع معدل الهجرة كما زادت قوة EF. بعد إضافة honokiol تركيزات مختلفة، انخفض معدل الهجرة بشكل عام، مما يشير إلى أن honokiol خفض هجرة الخلايا ربما عن طريق تثبيط إنتاج ريوس. يظهر توجيه الأعضاء الهجرة في الشكل 2G. في ظل وجود EF فقط، وأظهرت خلايا سرطان الرئة الهجرة بارزة الاتجاه نحو القطب الموجب (مع قيم سالبة). بعد إضافة honokiol تركيزات مختلفة، كان هناك انخفاض طفيف في توجيه الأعضاء الهجرة لجميع المناطق التي حفزت EF.

شكل 1
الشكل 1: الكيميائية القص الإجهاد (CSS) رقاقة تستخدم لدراسة تأثيرات المواد الكيميائية والقص تشدد على خلايا سرطان الرئة 2.3
(أ) لا بد ثلاث طبقات من ركائز PMMA معا عن طريق اثنين من الأشرطة على الوجهين لتشكيل رقاقة CSS. (ب) رقاقة CSS متكاملة. (C) أعلى: نيون والصور مشرق الميدان من CL بعد 1-5 خلايا يعالجون مع تركيزات مختلفة من H 2 O 2. شريط النطاق = 50 ميكرون. أسفل: كثافة الفلورسنت متوسط ​​مع SEM تآمر على تركيزات مختلفة من H 2 O 2. (D) الأعلى: الصور فلوري من CL 1-5 الخلايا تحت ضغوط القص المختلفة. شريط النطاق = 50 ميكرون. أسفل: كثافة الفلورسنت متوسط ​​مع SEM تآمر على اجهادات القص المختلفة. (E) الأعلى: الفلورية ومشرق الميدان صور CL بعد 1-5 خلايا يجري حفز مع إجهاد القص مع تركيزات مختلفة من α-توكوفيرول. شريط النطاق = 50 ميكرون. أسفل: كثافة الفلورسنت متوسط ​​مع SEM تآمر على تركيزات مختلفة من α-توكوفيرول. عرض البيانات هنا ثكما نشرت أصلا في اشارة 23. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: رقاقة الحقل الكيميائية الكهربائية (مركز دراسات الحدود) تستخدم لدراسة تأثيرات المواد الكيميائية والحقول الكهربائية في خلايا سرطان الرئة 22.
لا بد (A) طبقة واحدة من PMMA على طبق الثقافة عن طريق الشريط على الوجهين لتشكيل رقاقة مركز دراسات الحدود. (ب) نمط فلويديك من الشريحة CSS. (ج) الدائرة الكهربائية ما يعادل شريحة ميكروفلويديك. (D) يسار: الفلورية ومشرق الميدان صور CL بعد 1-5 خلايا يعالجون مع القوى المختلفة في التماثلية. شريط النطاق = 50 ميكرون. الحق: يعني فلوريكثافة مع SEM تآمر على القوى المختلفة في التماثلية. (E) اليسار: نيون والصور مشرق الميدان من CL بعد 1-5 خلايا يعالجون مع honokiol جنبا إلى جنب والتماثلية. شريط النطاق = 50 ميكرون. الحق: يعني كثافة الفلورسنت مع وزارة شؤون المرأة المرسومة في honokiol جنبا إلى جنب والتماثلية. (F) ومعدلات الهجرة من خلايا CL1-5 بعد أن تعامل مع التماثلية فقط (وضعت السيطرة) وhonokiol جنبا إلى جنب والتماثلية (وضع علامة honokiol). (G) وتوجيه الأعضاء هجرة الخلايا CL1-5 بعد أن تعامل مع التماثلية فقط (وضعت السيطرة) وhonokiol جنبا إلى جنب والتماثلية (وضعت honokiol). البيانات المقدمة هنا نشرت أصلا في اشارة 22. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هي ملفقة رقائق القائم على PMMA باستخدام الاستئصال بالليزر والكتابة التي هي طرق أرخص وأسهل بالمقارنة مع رقائق مقرها PDMS والتي تتطلب الطباعة الحجرية الناعمة أكثر تعقيدا. بعد تصميم رقاقة ميكروفلويديك، تصنيع وتجميع ويمكن أن يتم ضمن مسافة 5 دقائق. هناك بعض الخطوات الحاسمة التي ينبغي أن تدفع الانتباه إلى في أداء التجربة. الأول هو "تجميع" القضية. يجب أن يكون لاصق المحولات بشكل صحيح إلى الأعلى الأكثر طبقة من شرائح. الغراء قد تسرب إلى قنوات الموائعية إذا تم تطبيق أكثر من اللازم، وسائل يمكن أن يتسرب من الشريحة في حالة استخدام الغراء قليلا جدا. أيضا، في تجميع ركائز PMMA والأشرطة على الوجهين، من المهم أن ممارسة الضغط للضغط على كل رقاقة بإحكام لمنع أي تسرب السائل. والثاني هو "فقاعة" القضية. لإزالة فقاعات، وتدفقت برنامج تلفزيوني 1X باستمرار في قناة الموائعية ل 1 أو 2 دقيقة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة ثم رقاقة هو عالذي تغلب عليه اسهم داخل حاضنة بين عشية وضحاها تحت 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. إذا كان هناك فقاعات المتبقية داخل قنوات الموائعية، فإن تدفق يكون غير موحدة، مما تسبب في تركيز المواد الكيميائية nonhomogeneous وتوزيع EF. والثالث هو "خلية تحميل" القضية. عدد الخلايا التي تم تحميلها في مجالات الثقافة ينبغي أن تسيطر عليها بشكل جيد. إذا كان عدد الخلايا منخفض جدا، وينبغي إجراء العديد من التشغيل التجريبي لجمع ما يكفي من البيانات لغرض الإحصائي. إذا كان عدد الخلايا مرتفع جدا، وسوف يكون من الصعب التمييز بين الخلايا الفردية وتحديد هجرتهم.

في الشريحة المغلق، "شجرة عيد الميلاد" هيكل جنبا إلى جنب مع منطقة ثقافة الثلاثي يولد التركيزات الكيميائية المختلفة في خمس مناطق، لكل منها التدرج إجهاد القص. كانت معروفة الضغوط القص الموائعية أن تؤثر على المرفق، والتشكل، والهجرة، ونشاط الخلايا. ضغوط القص من ما يصل الى 0.25-0.6 با يمكن التفاعل مرفق الخلية، ولم يبلغ عن والقيم وحتى أعلى من الضغوط (0.5 -10 باسكال) لإزالة الخلايا الملتصقة 29. كانت معروفة اجهادات القص الصفحي تتراوح 0،8-1،5 با محاذاة الخلايا المستحثة في اتجاه تدفق 30، والقيم أقل من ذلك (0،1-1 باسكال) للتأثير على مورفولوجيا الخلايا ونفاذية 29. وعلاوة على ذلك، شهدت خلايا العضلات الملساء تعرض لضغوط القص 2-120 با انخفاضا في عدد الخلايا (31). لو وآخرون. ذكرت تصميم وبناء القص أجهزة ميكروفلويديك للتحليل الكمي للالتصاق الخلية 27. تم تعديل إجهاد القص داخل القناة الموائعية عن طريق تغيير أبعاد القناة. الذقن وآخرون. وصف والدورة الدموية نظام المختبر على واحد في رقاقة للسيطرة على معدل التدفق من مستنبت في القناة الصغيرة لتقليد الشخصية تدفق الدم في الأوعية 32. تم تعديل إجهاد القص داخل القناة الموائعية عن طريق تغيير معدل التدفق المتوسط. في الحد ذاته الجهازين، على الرغم من إجهاد القص من أي قيم يمكن أن تتولد، وكان واحد فقط قيمة واحدة المتاحة داخل منطقة ثقافة واحدة في وقت واحد. وبالمقارنة، فإن رقاقة CSS الحالي لديه ميزة توفير التدرج إجهاد القص في منطقة مثلثة الشكل واحد، وزيادة الإنتاجية تجريبية خاصة لغرض الفحص.

في رقاقة مركز دراسات الحدود والمناطق ثقافة هيكل "شجرة عيد الميلاد" هي عموديا متصلة لتشكيل مسار فلويديك مماثلة إلى الدوائر الكهربائية. في واحدة تطبق التيار المباشر، يتم إنشاء خمسة نقاط القوة EF داخل المناطق الثقافة مع كل وجود تدفق تركيز مادة كيميائية معينة. أجريت تقليديا، والتجارب electrotactic على أطباق بتري حيث يمكن أن تحدث مشاكل التماثلية غير دقيقة، تبخر المتوسط، خلية كبيرة / استهلاك كاشف، وزيادة التدفئة جول. المغلقة، وأجهزة ميكروفلويديك مصغرة التغلب على كفاءة هذه العيوب. على سبيل المثال، لدراسة انجذاب كهربي سو ذاكرة الدم خلايا تي الإنسان، لين وآخرون. ذكرت جهاز ميكروفلويديك البلاستيك تحتوي على اثنين متطابقة، جنبا إلى جنب القنوات الصغيرة، خدم اثنين من نصائح ماصة تعديل كمخازن المتوسطة، واثنين من أقطاب البلاتين لتطبيق EF 15. لزيادة الإنتاجية، ملفقة رقائق electrotactic أساس PMMA لتوفير القوة EF متعددة في جهاز واحد واحد 12،33. أيضا، وأجهزة ميكروفلويديك قادرة على توليد مادة كيميائية يمكن السيطرة عليها والمحفزات الكهربائية وفي وقت واحد من الفائدة المرتفعة. لي وآخرون. ملفقة جهاز ميكروفلويديك القائم PDMS لتوليد واحدة أو تتعايش الكيميائية التدرجات / التماثلية للتحقيق في الكيميائي أو الهجرة electrotactic خلايا T 14. كاو وآخرون يعملون جهاز ميكروفلويديك مماثل لتعديل الكيميائي للخلايا سرطان الرئة باستخدام التماثلية 12. في هذين الجهازين، تم تطبيق هيكل Y-شكل لإنشاء معامل تركيز مستقر في واحد EF التطبيقية واحد. هوى وآخرون. ذكرت شريحة والكهربائية والمجال متعددة مزدوجة لدراسة تأثير المتزامن للمواد الكيميائية وEFS على خلايا سرطان الرئة 21. كان هذا الجهاز قادرا على توفير 8 مجموعات من المحفزات الكهربائية / الكيميائية (2 × 4 الكهربائية الكيميائية) في تجربة واحدة. على الرغم من أن الإنتاجية زادت، وقدرة هذه الشريحة على سبيل الحصر (1) فقط قوة واحدة EF (زائد واحد صفر كعنصر تحكم)، و (2) مطلوبة أربع مضخات حقنة لإعادة ضخ المواد الكيميائية إلى أربعة قنوات مستقلة. وعلى سبيل المقارنة، ورقاقة مركز دراسات الحدود الحالي في الاستفادة من توليد خمس نقاط القوة EF جنبا إلى جنب مع خمسة التركيزات الكيميائية عبر مجموعة واحدة واحدة من الأقطاب الكهربائية ومضخات 2 حقنة.

على الرغم من هذه الرقائق من السهل أن تكون ملفقة، لديهم بعض القيود. أولا، خمسة فقط تركيزات "محددة" وخمس نقاط القوة EF "محددة" يمكن أن تتولد. ثانيا، عرض القناة الموائعية لا يمكن أن يكون أقل من 1 ملم بسبب التركيز للCO 2 شعاع الليزر. ومع ذلك، من خلال التحكم الدقيق التركيز الكيميائي في مدخل والتيار الكهربائي التي تمر عبر قناة الموائعية، أي تجمعات ونقاط القوة EF لا يمكن أن يتحقق في مجالات الثقافة. في الختام، رقائق CEF CSS الحالي وتكون قادرة على توفير خلايا مع المثيرات واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية / إجهاد القص السيطرة عليها. في رقاقة واحدة CSS واحد، خمسة التركيزات الكيميائية المختلفة في توليفة مع التدرج إجهاد القص يمكن أن تتولد. وبالإضافة إلى ذلك، في رقاقة واحدة CEF واحد، خمسة التركيزات الكيميائية المختلفة بالاشتراك مع خمس نقاط القوة EF يمكن أن تنشأ. عن طريق زيادة فروع هيكل "شجرة عيد الميلاد"، مرت من هذه الرقائق يمكن زادت. وأثبتت هذه الرقائق لتكون، لتوفير الوقت سهلة وموثوق بها، ومنصة عالية الإنتاجية للدراسات السلوك الخلوي تحت المحفزات الكيميائية / الكهربائية / إجهاد القص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Cell culture medium
Trypsin Gibco 25300-054 detach cell from the dish
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10082147 Cell culture medium
10 cm cell culture Petri dish Nunc 150350 Cell culture
Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629 Cell Counting Equipment
PMMA Customized Customized Microfluidic chip
Adaptor Customized Customized Microfluidic chip
0.07/0.22 mm double-sided tape  3M 8018/9088 Microfluidic chip
Low melting point agarose Sigma A9414 Salt bridge
2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate Sigma D6883 Intracellular ROS measurement
Indium tin oxide (ITO) glass Merck 300739 Heater
Proportional-integral-derivative controller  JETEC Electronics Co. TTM-J4-R-AB Temperature controller
Thermal coupler TECPEL TPK-02A Temperature controller
CO2 laser scriber Laser Tools & Technics Corp. ILS2 Microfluidic chip fabrication
Syringe pumps New Era NE-300 Pumping medium and chemicals into the chip
Power supply Major Science  MP-300V Supplying direct currents
Inverted microscope Olympus CKX41 Monitoring cell migration
Inverted fluorescent microscope Nikon TS-100 Monitoring cell migartion and fluorescencent signals
DSLR camera Canon 60D Recording bright-field images 
CCD camera Nikon DS-Qi1 Recording fluorescent images 
super glue 3M Scotch 7004 Attaching adaptors to PMMA substrates
AutoCAD Autodesk Inc. Designing microfluidic chips
DMSO Sigma D8418 Dissolving DCFDA
ImageJ National Institutes of Health Quantifying fluorescent intensities and cell migration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
  2. Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  4. Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
  5. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  6. Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
  7. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
  8. Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
  9. Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
  10. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  11. Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
  12. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  13. Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
  14. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
  15. Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
  16. Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
  17. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
  18. Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
  19. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  20. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  21. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
  22. Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
  23. Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
  24. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
  25. Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
  26. Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
  27. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  28. Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
  29. Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
  30. Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
  31. Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
  32. Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
  33. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 114، رقاقة ميكروفلويديك، الهجرة الخلية، أنواع الاكسجين التفاعلية، المجال الكهربائي، انجذاب كهربي، إجهاد القص
تصميم الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الردود الخليوي تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية / إجهاد القص المحفزات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, T. Y., Sun, Y. S., Hou, H. S., … More

Chou, T. Y., Sun, Y. S., Hou, H. S., Wu, S. Y., Zhu, Y., Cheng, J. Y., Lo, K. Y. Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli. J. Vis. Exp. (114), e54397, doi:10.3791/54397 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter