Abstract
Microfluidic enhetene er i stand til å skape en nøyaktig og kontrollerbar cellulære mikromiljø pH, temperatur, saltkonsentrasjon, og andre fysiske eller kjemiske stimuli. De har vært vanlig benyttet for in vitro-cellestudier ved å tilveiebringe in vivo-som omgivelser. Spesielt hvordan cellene respons til kjemiske gradienter, elektriske felt, og skjærspenninger har trukket mange interesser siden disse fenomenene er viktig for å forstå mobilnettet egenskaper og funksjoner. Disse microfluidic brikker kan være laget av glass-substrater, silisiumskiver, polydimetylsiloksan (PDMS) polymerer, polymetylmetakrylat (PMMA) substrater eller polyetylentereftalat (PET) substrater. Ut av disse materialene, PMMA substrater er billig og lett kan behandles ved hjelp av laser ablasjon og skriving. Selv om noen få microfluidic enheter har blitt designet og fabrikkert for å generere flere, coexisting kjemiske og elektriske stimuli, ble ingen av dem anseseffektiv nok til å redusere eksperimentelle gjentar, spesielt for screening formål. I denne rapporten beskriver vi vår design og fabrikasjon av to PMMA-basert microfluidic chips for å undersøke cellulære responser, i produksjon av reaktive oksygenforbindelser og migrasjon under enkle eller coexisting kjemiske / elektriske / skjærspenning stimuli. Den første brikken genererer fem relative konsentrasjoner på 0, 1/8, 1/2, 7/8, og en i kultur regioner, sammen med en skjærspenning gradient produsert inne i hvert av disse områdene. Den andre brikken genererer de samme relative konsentrasjoner, men med fem forskjellige elektriske feltstyrker opprettet innenfor hver kultur område. Disse enhetene ikke bare gi celler med en presis, kontrollerbar mikro-miljø, men også øke den eksperimentelle gjennomstrømming.
Introduction
In vivo-celler er omgitt av en rekke av biomolekyler, inkludert ekstracellulære matriks (ECM), karbohydrater, lipider og andre celler. De functionalize ved å svare på mikro-miljø stimuli som interaksjoner med ECM og svar på kjemiske gradienter av ulike vekstfaktorer. Tradisjonelt er in vitro cellestudier utført i cellekulturskåler hvor forbruket av celler og reagenser er stor og cellene vokse i en statisk (ikke-sirkulerende) miljø. Nylig har mikro-fabrikkert enheter integrert med fluidkomponenter gitt en alternativ plattform for cellestudier i en mer kontrollerbar måte. Slike anordninger er i stand til å opprette en nøyaktig mikro-miljø av kjemiske og fysikalske stimuli, mens forbruket av celler og reagenser minimaliseres. Disse microfluidic brikker kan være laget av glass-substrater, silisiumskiver, polydimetylsiloksan (PDMS) polymerer, polymetylmetakrylat (PMMA) substrater, eller polyethylenetereftalat (PET) substrater 1-3. PDMS-baserte enheter er gjennomsiktige, biokompatible, og permeabel for gasser, noe som gjør dem egnet for langtids cellekulturer og studier. PMMA og PET underlag er billig og lett å bli behandlet ved hjelp av laser ablasjon og skriving.
Microfluidic anordninger bør gi celler med en stabil og kontrollerbar mikro-miljø, hvor cellene er utsatt for forskjellige kjemiske og fysikalske stimuli. For eksempel er microfluidic flis som brukes til å studere kjemotaksis av celler. I stedet for tradisjonelle metoder som benytter Boyden kammer og kapillær 4,5 disse miniatyriserte fluidic enheter kan generere nøyaktige kjemiske gradienter for å studere cellenes atferd 1,6,7. Et annet eksempel er å undersøke cellenes retnings migrasjon i henhold elektriske felter (EFS), et fenomen som heter electrotaxis. Electrotactic atferd av celler ble rapportert å være relatert til nerve regenerering 8, embryoutvikling 9,og sårtilheling 10,11. Og mange studier har blitt utført for å undersøke electrotaxis av ulike celletyper, inkludert kreftceller 12,13, lymfocytter 14,15, leukemiceller 11, og stamceller 16. Konvensjonelt, er petriskåler og dekkglass brukes til å konstruere electrotactic kamre for å generere EFs 17. Slike enkle oppsett utgjøre problemer med middels fordampning og upresise EFs, men de kan overvinnes ved microfluidic enheter av lukkede, veldefinerte fluidic kanaler 12,18,19.
Å systematisk studere cellulære responser i henhold til presise og kontrollerbare kjemiske og elektriske stimuli, vil det være av stor bruk for å utvikle microfluidic enheter i stand til å gi celler med flere stimuli samtidig. For eksempel Li et al. rapporterte en PDMS-baserte mikrofluidanordning for å lage én eller kjøl kjemiske gradienter og EFs 20. Kao et al. devrømte en lignende microfluidic chip å modulere kjemotaksis av lungekreftceller ved EFs 6. Dessuten, for å øke gjennomstrømningen, Hou et al. designet og fabrikkert en PMMA-baserte multikanal-dual-elektrisk felt chip for å gi celler med 8 forskjellige kombinerte stimuli, å være (2 EF styrker x 4 kjemiske konsentrasjoner) 21. For ytterligere å øke hele og legge skjærspenningen stimulans, utviklet vi to PMMA-baserte microfluidic enheter for å studere cellulære responser etter én eller kjøl kjemiske / elektriske / skjærspenning stimuli.
Rapportert av Lo et al. 22,23, disse enhetene inneholder fem uavhengige cellekultur kanaler hvor det hele tiden fluidic flytende, etterligne in vivo sirkulasjonssystemet. I den første chip (kjemisk-skjærspenning chip eller CSS chip), fem relative konsentrasjoner på 0, 1/8, 1/2, 7/8 og 1 er generert i kultur regioner, og en skjærspenning gradient er prosert inne i hver av de fem dyrkningsområdene. I den andre brikken (kjemisk-elektriske felt chip eller CEF chip), ved hjelp av en enkelt sett av elektroder og 2 sprøytepumper, blir fem EF styrke generert i tillegg til fem forskjellige kjemiske konsentrasjoner innenfor disse dyrkningsområdene. Numeriske beregninger og simuleringer utføres for å bedre utforming og drift av disse prosessorene, og lungekreftceller dyrket inne i disse enhetene er gjenstand for én eller andre sykdoms stimuli for å observere sine svar med hensyn til produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), den migrasjonsrate, og migrering retning. Disse brikkene er vist å være tidsbesparende, høy gjennomstrømming og pålitelige systemer for å undersøke hvordan cellene reagerer på ulike mikro miljømessige stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip design og fabrikasjon
- Draw mønstre som skal ablated på PMMA underlag og dobbel-side tape bruker kommersiell programvare 24.
- For å studere effekter av kjemiske konsentrasjoner og skjærspenninger, tegne et "juletre" mønster med en varierende bredde i sin ende i hver av de fem kulturområder (figur 1A og 1B).
- For å studere effekter av kjemiske konsentrasjoner og elektriske felt, tegne et "juletre" mønster med to fluidkanaler for salt broer (figur 2a og 2b).
- Scribe en person mønster på en PMMA ark eller en dobbel-side tape ved å laste den tilsvarende filen inn i CO 2 laser riss.
- Slå på laseren nent, og sjekke sin tilkobling til datamaskinen. Åpne mønsteret som skal ablateres ved hjelp av kommersiell programvare.
- Plasser en PMMA ark eller en dobbeltsidig tape on toppen av scenen i telegraf. Juster fokus på CO 2 laser om nødvendig med kalibrerings bar og synlig He-Ne laser.
- Last inn mønster i riss for ablasjon på PMMA ark eller tape.
- Plukk opp mønstrede ark eller tape, fjerne uønskede stykker, og rengjør overflaten med nitrogen blåser.
MERK: Tykkelsen av PMMA ark er 1 mm, og at av den dobbeltsidige tapen er 0,07 mm eller 0,22 mm.
2. Chip Assembly
- Med superlim, fest akryl adaptere (lengde x bredde x høyde = 10 mm x 10 mm x 5 mm, med gjenger i midten) til det øverste laget av brikken ved å innrette gjengene og hullene på toppen -De fleste lag. Disse adapterne tjene som medium innløp / utløp og salt brokoplingsstykker.
- Monter microfluidic chip inne i en laminær hette.
- Monter den kjemiske-skjærspenning microfluidic chip (CSS chip).
- ENttach 3 ark med risset PMMA ark ved hjelp av 2 stykker risses dobbeltsidig tape. (Figur 1A og 1B).
- Legge til én del av den 0,07 mm tykke dobbeltsidig tape på undersiden av brikken og feste brikken til en 10 cm diameter petriskål.
- Sette sammenstillingen chip i vakuumkammeret for over natten.
- For å montere den kjemisk-elektriske feltet brikke (chip CEF), feste PMMA ark til en dobbeltsidig tape med en tykkelse = 0,22 mm (figur 2A og 2B).
- Fest beskrevet PMMA ark og dobbeltsidig tape til en 10 cm diameter petriskål ved hjelp av denne samme stykke tape.
- La den monterte chip inne i hetten og utsettes for UV i 30 min for sterilisering.
- Koble innløpene til to 3-ml sprøyter via plastrør og fingertett nøtter. Koble uttaket til en avfalls rør via et plastrør og et håndfast mutter.
MERK: Autoklaveralle rør og muttere ved 121 ° C i 15 min før bruk. - Sakte trykke ned stempelet på sprøyten for å prime fluidumsforbindelsene kanaler med PBS. Push sprøyter frem og tilbake for å fjerne bobler.
- Sette chips i en inkubator over natten ved 37 ° C under 5% CO 2.
MERK: Disse to trinnene har som mål å vaske chip og fjerne eventuelle gjenværende bobler i brikken. - Ta chip ut av inkubatoren.
- Forbered agar salt broer for å generere elektrisk felt i CEF chip.
- Oppløs 3% lavt smeltepunkt agarose i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) buffer ved bruk av en mikrobølgeovn.
- Injiser løsningen-faset agarose i saltbroen kanal og sette elektrodene før løsningen stivner.
- Plasser sølv / sølv-klorid elektroder inn i de rørformede nøtter.
- Koble sprøytene til sprøytepumper, og kontinuerlig flyt kulturmedium (Dulbeccos Modified EagleR17; s medium, DMEM) inn i fluidkanalen i 10 minutter ved en strømningshastighet på 20 mL / min for å erstatte PBS.
3. Cell Forberedelse og Forsøksoppsett
MERK: Pre-varm 1 x PBS, kulturmedium (DMEM pluss FBS), og trypsin i et 37 ° C vannbad før bruk.
- Plate 2 x 10 5 lungekreftceller CL1-5 25,26 i en 10 cm petriskål forsynt med DMEM pluss 10% føtalt bovint serum (FBS). Inkuber cellene inne i en inkubator under 5% CO2 ved 37 ° C inntil 90% konfluens.
- Aspirer medium og vaske cellene gang med forvarmet 1x PBS. Tilsett 2 ml av 0,05% trypsin-buffer til cellene og vente på 2 til 3 minutter ved 37 ° C for å løsne cellene.
- Overfør cellene til en 15 ml steril sentrifuge rør og tilsett 6 ml kulturmedium inn i røret. Snu røret for blanding og ta med 5 ul av det celleholdige medium for telling av celletallet i en hemocytometer.
- Sentrifuger røret på 300 x g i 5 min. Suspenderer 10 6 celler i 1 ml kulturmedium og plassere den celleinneholdende medium i en 1 ml sprøyte.
- Sette mot celleholdige medium inn i microfluidic chip fra stikkontakten, og sørge for at løsningen distribuerer alle gjennom de fem kulturområder. Inkuber brikken inne i en inkubator under 5% CO2 ved 37 ° C i 2 timer.
4. Forsøksoppsett
- Ta chip ut av inkubatoren og plassere den på toppen av en gjennomsiktig indium tinn oksid (ITO) glass varmeapparat.
MERK: ITO glass er koblet til en proporsjonal-integral-derivat (PID) kontroller for å opprettholde temperaturen ved 37 ± 0,5 ° C via tilbakemelding fra en termisk kopling fastklemt tett mellom ITO varmeren og brikken. - Sett chip-varmeelementmontasjen på toppen av en motorisert XY fase av et invertert mikroskop for sporing av cellemigrering eller et fast XY trinnen invertert fluorescerende mikroskop for å måle produksjonen av ROS.
- For å generere forskjellige kjemiske konsentrasjoner, fylle to sprøyter med 5 ml av kjemiske oppløsninger av relative konsentrasjoner 0 og 1 (oppløst i kulturmedium) og pumpe dem inn i brikken ved ønskede strømningshastigheter: i CSS-brikken, ved en strømningshastighet på 0,3 ml / min i 1 time; i CEF brikken, ved en strømningshastighet på 20 ul / min for den første 20 min, og en strømningshastighet på 20 ul / time for en annen 120 minutter (total tid = 2 timer).
- I CEF chip, for sporing av cellevandring, program XY stadium av mikroskop for å gjenta å ta bilder, via en digital single-lens reflex (DSLR) kamera, av visse felt av visninger (FOVs) innen kulturområder hvert 15 min for to hr.
- For å måle produksjonen av ROS, bruker fluorescens-basert indikator 2'-7 '-dichlorodihydrofluoresce diacetat (2'-7'-DCFDA).
- Forbered lager av 2'-7 '-DCFDA på 10 mm i molekylærbiologi klasse dimetylsulfoksid (DMSO). Fortynnet DCFDA i DMEM bare uten serum (5 mikrometer i DMEM). Potensialet deacetylase kunne øke bakgrunnssignaler og redusere signalene i cellene.
- Etter 1 time av skjærspenning stimulus i CSS-chip eller etter 2 timer av EF stimulus i CEF chip, pumpe 2'-7'-DCFDA (5 uM i DMEM) i brikken ved en strømningshastighet på 20 ul / min for de første 20 min, og en strømningshastighet på 20 ul / time i ytterligere 20 min. For vasking, pumpe DMEM i brikken ved en strømningshastighet på 20 mL / t i 20 min.
- Ta bilder, via en CCD (CCD) kamera, av visse FOVs innenfor kulturområder for å analysere fluorescerende intensiteter.
5. Beregninger av kjemiske konsentrasjoner skjærspenninger og elektriske felt
- I både CSS chip og CEF chip, beregne de kjemiske konsentrasjoner i de fem dyrkningsområdene. For eksempel, ved å injisere H 2 O 2 av konsentrasjonerasjon 0 og 200 uM fra de to innløp, konsentrasjoner på 0, 25, 100, 175, og 200 uM er generert.
MERK: Ved å anta at alle væsker split-flyt jevnt og like rundt gaffelen, de relative konsentrasjoner i de fem kulturområder er 0, 1/8, 1/2, 7/8 og 1, henholdsvis. - I CSS chip, beregne skjærspenningen (τ) innenfor hver av de dyrkningsområdene ved hjelp
27, hvor Q er volumstrømningshastigheten, η er den fluid viskositet, h er høyden av kanalen, og w er bredden av kanalen.
MERK: Ved å sette Q = 0,3 ml / min i hvert innløp (Q = 0,12 ml / min i hver kultur område), η = 0,0008 Pa s for kulturmediet, h = 1 mm, og w = 1 ~ 4 mm, i skjærspenning er beregnet å være i området fra 0,0048 Pa (4 mm bred region) til 0,0192 Pa (1 mm bred region). - ICEF chip, beregne EF styrke innenfor hvert av dyrknings områder ved å bruke E = I / (σA eff) (Ohms lov), hvor I er den elektriske strømmen som flyter på tvers av fluidkanalen, σ er den elektriske ledningsevnen i kulturmediet, og A eff er det effektive tverrsnittsareal av kanalen.
MERK: Med σ = 1,38 Ω -1 m -1 for kulturmedium og A eff = 0,22 mm 2 (bredde = 1 mm og høyde = 0,22 mm), EF styrke er beregnet til E (mV / mm) = I ( A) × 3,3 × 10 6.- Som vist i figur 2D, behandle den tilsvarende krets som fem C-seksjon kretser med fire (8 + 35 + 8) segmenter og en (5 + 35 + 5) segment.
MERK: Ved å analysere dette parallell krets ifølge Kirchhoffs spenning lov og Ohms lov, strømmer som går over fem kultur ersom jeg en gjennom jeg fem fra bunn til topp, er beregnet til å være rundt 0,49 I (område 1), 0,25 I (område 2), 0,13 I (område 3), 0,08 I (område 4), og 0,05 I (område 5), respektivt, hvor i er den totale likestrøm (dC). Med et påført likestrøm av 0,157 mA, EFs av 254, 130, 67, 41, og 26 mV / mm er generert innenfor de fem dyrkningsområdene.
NB: For en forenklet elektrisk analyse av mikrofluid nettverk, er alle fluidumsforbindelser segmenter betraktes som motstander med motstands proporsjonalt med deres lengder.
- Som vist i figur 2D, behandle den tilsvarende krets som fem C-seksjon kretser med fire (8 + 35 + 8) segmenter og en (5 + 35 + 5) segment.
27, hvor Q er volumstrømningshastigheten, η er den fluid viskositet, h er høyden av kanalen, og w er bredden av kanalen. 6. Data Analysis
Merk: Data Analysen er utført ved hjelp av ImageJ programvare.
- Analyser Produksjon av ROS.
- Kjør ImageJ programvare. Gå til "File" → Åpne for å laste inn et fluorescerende bilde som skal analyseres.
- Gå til "Image" → "Type" → "16-bit" for å endre imalder til en grå skala.
- Tegn et polygon å vedlegge en celle. Går til «Analyser" → "Mål" for å måle den midlere fluorescensintensitet av cellen.
- Gjenta 6.1.3 til å samle intensiteter fra minst 50 celler fra tre uavhengige eksperimenter og beregne den midlere intensitet med standardavvik av gjennomsnittet (SEM).
- Gjenta 6.1.1-6.1.4 for hver eksperimentell tilstand.
- Analyser celle migrasjon.
- Kjør ImageJ programvare. Gå til "File" → Åpne for å laste inn et bilde tatt ved tid = 0 som skal analyseres.
- Tegn et polygon å vedlegge en celle. Gå til "Analyser" → "tiltak" for å måle sentrum av massen av cellen som (x 1, y 1).
- Gjenta 6.2.1- 6.2.2 for å måle massesenteret av den samme celle som (x 2, y 2) fra et annet bilde ta ved tid = t.
- Beregn migrasjonsrate (i mikrometer / t) avdenne cellen som
. - Gjenta 6.2.1-6.2.4 å samle migrasjonsrater fra minst 50 celler av tre uavhengige forsøk, og beregne gjennomsnittet migrasjonsrate med standard feil av gjennomsnittet (SEM).
- Fra 6.2.2 og 6.2.3, beregne migrering directedness av denne cellen som cosinus θ eller
, Hvor θ er vinkelen mellom vektoren av den anvendte EF (fra positiv til negativ) og vektoren fra start til endeposisjonen av cellen (figur 2G). - Gjenta 6.2.6 til å samle migrering directedness fra minst 50 celler fra tre uavhengige eksperimenter og beregne gjennomsnittet migreringen directedness med standardavvik av gjennomsnittet (SEM).
- Beregn middelverdien migrasjonsrate med SEM og mellom migreringen directedness med SEM for hver eksperimentell tilstand.
MERK: En directednessav 1 angir at alle celler som migrerer mot katoden, og en -1 verdi angir at alle celler som migrerer mot anoden. Den directedness av en gruppe av tilfeldig bevegelige celler som er nær 0.
- Analyser Cell Justering.
- Kjør ImageJ programvare. Gå til "File" → "Open" for å laste et bilde som skal analyseres.
- Behandle cellen som en ellipse, og trekke en linje for å indikere den lange akse i en celle. Gå til "Analyser" → "tiltak" for å måle vinkelen β mellom linjen og den horisontale EF retning.
- Gjenta 6.3.2 til å samle β fra minst 50 celler fra tre uavhengige eksperimenter, og beregne middelverdien cosinus β med standardavvik av gjennomsnittet (SEM).
- Gjenta 6.3.1-6.3.3 for hver eksperimentell tilstand.
MERK: En cos β av en indikerer at alle cellene justeres i parallell med den anvendte EF, og en 0-verdi angir at alle celler justere perpendicularly til den anvendte EF.
. 
, Hvor θ er vinkelen mellom vektoren av den anvendte EF (fra positiv til negativ) og vektoren fra start til endeposisjonen av cellen (figur 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
The Chemical-skjærspenning (CSS) Chip
CSS brikke er laget av tre PMMA-plater, hver med en tykkelse på 1 mm, festet sammen via to tosidige bånd, hvert med en tykkelse på 0,07 mm (figur 1A og 1B). Den "Christmas tree" struktur genererer fem relative konsentrasjoner på 0, 1/8, 1/2, 7/8, og en i de fem dyrkningsområdene. Ved å utforme kultur område som en trekant, en skjærspenning gradient, med en størrelse som er relatert til volumstrømningshastigheten, den fluidic viskositet, og dimensjonen av fluidkanalen, er opprettet innenfor hvert av områdene. Denne brikken blir så festet, via en 0,07 mm tykk dobbeltsidig tape, til en petriskål for dyrking av lungekreft CL1-5 celler og produksjon av ROS ble observert i respons til ulike kjemiske konsentrasjoner og skjærspenninger. Produksjonen av ROS i lungekreftceller er sterkt knyttet til lung kreft metastasering og utvikling, og enkelte kjemikalier og skjærspenninger ble vist å være involvert i ROS generasjon 23.
Først, for å studere effekten av H 2 O 2, en kjemisk stimulus, på produksjon av ROS, ble celler inkubert med kontinuerlige strømmer av H 2 O to løsninger på 0, 25, 100, 175, og 200 uM. Som vist på figur 1C, økte den fluorescerende intensitet som konsentrasjonen av H 2 O 2 økes, noe som indikerer at H 2 O 2 stimulerte produksjonen av ROS. Deretter for å undersøke effekten av skjærspenning på produksjonen av ROS, cellene ble utsatt for en skjærspenning gradient på 0,0048 Pa til 0,0192 Pa. Figur 1D viser at den fluorescerende intensitet øket når skjærspenningen økes (de skjærspenninger var den høyeste og de laveste i forsiden og baksiden områder, henholdsvis), foreslåring at høyere skjærspenning indusert mer ROS produksjon. Dessuten ble dette CSS brikken benyttet for å studere produksjonen av ROS i respons til forskjellige konsentrasjoner av α-tokoferol, ble en antioksidant av en form for vitamin E. celler stimulert av skjærspenningen plus α-tokoferol på 0, 3,2, 12,5, 21,9 , og 25 ug / ml. Som vist i figur 1E, for α-tocopherol konsentrasjoner lavere enn 21,9 ug / ml, reduserte den fluorescerende intensitet som den konsentrasjon økes, noe som indikerer effekten av α-tokoferol i å redusere produksjonen av ROS. Imidlertid, ettersom konsentrasjonen øket til 25 ug / ml, den midlere intensitet også økt, noe som tyder på at denne høye konsentrasjon av α-tokoferol ikke eliminere mye ROS sammenlignet med lavere konsentrasjoner.
The Chemical-elektrisk felt (CEF) Chip
CEF brikke er laget av en 1 mm tykk PMMA og en 0,22 mm dobbeltsidig tape med fluidkanaler mønstrede på den (figur 2A og 2B). På lignende måte danner de "Christmas tree" struktur fem relative konsentrasjoner på 0, 1/8, 1/2, 7/8, og en i de fem dyrkningsområdene. I tillegg er disse fem parallelle områder koblet perpendikulært for å danne en fluidbane som er analog med en elektrisk krets. Det elektriske feltet som genereres innenfor en kultur område er relatert til ledningsevnen til fluidet, den tverrsnittsarealet av kanalen, og den likestrøm (DC) som passerer gjennom området. Ifølge Kirchhoffs lov spenning og Ohms lov, strømmene i fem dyrkningsområder er 0,49 I 0,25 I 0,13 I, 0,08 I, og 0,05 I, henholdsvis, hvor I er den påførte likestrøm (figur 2C). Denne brikken er festet, via den 0,22 mm tykke dobbeltsidig tape, til en petriskål for dyrking av lungekreftceller CL1-5 å observere cellemigrering og blusern av ROS i respons til forskjellige kjemikaliekonsentrasjoner og elektriske felter.
Først ble denne brikken benyttet for å studere produksjonen av ROS i respons til forskjellige konsentrasjoner av honokiol, forskjellige styrker av EFs, og kombinerte behandlinger av begge. Honokiol, en små-molekyl polyfenol isolert fra slekten Magnolia, ble funnet å ha anti-angiogene, anti-inflammatorisk og antitumoregenskaper i prekliniske studier 28. Som vist i figur 2D, ROS produsert var omtrent den samme for EFs lavere enn 67 mV / mm, men ble øket med økende EFs over denne verdien. Figur 2E viser at under kombinerte behandlinger av elektriske felt og honokiol, ROS-nivå oppholdt seg nesten den samme, noe som indikerer at honokiol inhiberte produksjonen av eksogene ROS (f.eks., ROS relatert til EF stimulus), særlig ved høyere EFs. Den cellemigrasjon etter én eller kjøl kjemisk/ elektriske stimuli ble også undersøkt ved hjelp av denne CEF chip. Som vist i figur 2F, uten tilsetning av honokiol økte migrasjonsrate som EF styrke økes. Etter tilsetning av honokiol av forskjellige konsentrasjoner, nedsatt migrasjonshastigheten generelt, noe som tyder på at honokiol redusert cellemigrering eventuelt via inhibering av produksjon av ROS. Migrasjons directedness er vist i figur 2G. I nærvær av bare EF, lungekreftceller viste fremtredende retningsbestemt vandring mot anoden (med negative verdier). Etter å legge honokiol av forskjellige konsentrasjoner, var det en svak nedgang i migrasjon directedness for alle EF-stimulert områder.
Figur 1: Kjemisk-skjærspenning (CSS) Chip Brukes til å studere effekter av kjemikalier og skjærspenninger på lungekreft celler to.3
(A) Tre lag med PMMA substrater er bundet sammen via to tosidige tape for å danne CSS chip. (B) Den integrerte CSS chip. (C) Top: Fluorescent og lyse felt bilder av CL 1-5 celler etter å ha blitt behandlet med ulike konsentrasjoner av H 2 O 2. Scale bar = 50 mikrometer. Nederst: Gjennomsnittlig fluorescensintensitet med SEM plottet ved forskjellige konsentrasjoner av H 2 O 2. (D) Top: Fluorescent bilder av CL 1-5 celler under forskjellige skjærspenninger. Scale bar = 50 mikrometer. Bunn: Mean fluorescerende intensitet med SEM plottet på ulike skjærspenninger. (E) Top: Fluorescent og lyse felt bilder av CL 1-5 celler etter å ha blitt stimulert med skjærspenning med ulike konsentrasjoner av α-tokoferol. Scale bar = 50 mikrometer. Nederst: Gjennomsnittlig fluorescensintensitet med SEM plottet ved forskjellige konsentrasjoner av α-tokoferol. Data som presenteres her wsom opprinnelig publisert i referanse 23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: The Chemical-elektrisk felt (CEF) Chip brukt for å studere effekter av kjemikalier og elektriske felt på lungekreft celler 22.
(A) et lag av PMMA bundet til en kulturskål ved hjelp av en dobbeltsidig tape for å danne CEF chip. (B) Den fluid mønster av CSS chip. (C) Den ekvivalente elektriske kretsen i mikrofluid chip. (D) Venstre: Fluorescent og lyse felt bilder av CL 1-5 celler etter å ha blitt behandlet med forskjellige styrker av EFs. Scale bar = 50 mikrometer. Høyre: Gjennomsnittlig fluorescerendeintensitet med SEM plottet på forskjellige styrker av EFs. (E) Venstre: Fluoriserende og lyse felt bilder av CL 1-5 celler etter å ha blitt behandlet med kombinert honokiol og EFs. Scale bar = 50 mikrometer. Høyre: Gjennomsnittlig fluorescerende intensitet med SEM plottet på kombinert honokiol og EFs. (F) De migrasjonsrater CL1-5 celler etter å ha blitt behandlet med EFs bare (markert som kontroll) og kombinert honokiol og EFs (merket som honokiol). (G) Migrasjonen directedness av CL1-5 celler etter å ha blitt behandlet med EFs bare (markert som kontroll) og kombinert honokiol og EFs (merket som honokiol). Data presentert her ble opprinnelig publisert i referanse 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PMMA-baserte chips er fabrikkert ved hjelp av laser ablasjon og skriving som er billigere og enklere metoder i forhold til PDMS-baserte brikker som krever mer komplisert myk litografi. Etter utforme en microfluidic chip, kan fabrikasjon og montasje gjøres i løpet av bare 5 min. Det er noen viktige skritt at oppmerksomheten bør rettes mot i å utføre eksperimentet. Den første er "montering" problemet. Adapterne skal limes skikkelig til øverste laget av chip. Lim kan lekke inn i fluidkanaler hvis for mye blir brukt, og væske kan lekke ut av brikken hvis for lite lim anvendes. Også i montering av PMMA underlag og de tosidige tape, er det viktig å legge trykk på trykk hele chip tett for å forhindre væskelekkasje. Den andre er den "boble" problemet. For å fjerne bobler, blir 1 x PBS kontinuerlig strømmet inn i fluidkanalen for 1 eller 2 minutter ved en strømningshastighet på 20 mL / min, og deretter brikken er placed inne i en kuvøse natten under 5% CO 2 ved 37 ° C. Hvis det er resterende bobler innenfor fluidkanaler, vil strømningen være ikke-uniform, forårsaker ikke-homogen kjemisk konsentrasjon og EF fordeling. Den tredje er "celle loading" problemet. Antall celler som er lastet inn i dyrkningsområdene bør være godt kontrollert. Hvis cellen tall er for lavt, må mange eksperimentelle forsøk utføres for å samle nok data for statistiske formål. Hvis cellenummeret er for høyt, vil det være vanskelig å skille de enkelte celler, og kvantifisering av deres migrasjon.
I CSS chip, en "juletre" struktur i kombinasjon med et trekantet område kultur genererer forskjellige kjemiske konsentrasjoner i fem områder, som hver har en skjærspenning gradient. Fluidskjærspenninger var kjent for å påvirke feste, morfologi, migrering, og aktiviteten av cellene. Skjærspenninger på så lavt som 0,25-0,6 Pa kunne samhandle cellebindingOg enda høyere verdier av spenninger (0,5 -10 Pa) ble rapportert å fjerne adherente celler 29. Laminære skjærspenninger som strekker seg 0,8 til 1,5 Pa-indusert celle-oppstilling i strømningsretningen 30, og til og med lavere verdier (0,1-1 Pa) var kjent for å påvirke cellulær morfologi og permeabilitet 29. Videre glatte muskelceller som utsettes for skjærspenninger på 2-120 Pa opplevd en nedgang i celle nummer 31. Lu et al. rapportert design og bygging av microfluidic skjær enheter for kvantitativ analyse av celle adhesjon 27. Skjærspenningen i fluidkanalen ble modifisert ved å forandre dimensjonene på kanalen. Chin et al. beskrevet en hemodynamisk Lab-på-en-brikke system for å kontrollere strømningshastigheten av kulturmediet i mikro-kanalen for å etterligne den strømningsprofil i blodet i beholderen 32. Skjærspenningen i fluidkanalen ble modifisert ved å endre strømningshastigheten for mediet. påSE to enheter, selv om en skjærspenning av alle verdier kan genereres, bare en enkelt verdi var tilgjengelig innen en kultur på en gang. Til sammenligning har den foreliggende CSS chip fordelen av å gi en skjærspenning gradient i en trekantet område, noe som øker den eksperimentelle gjennomstrømning spesielt for en screening formål.
I CEF chip, dyrknings områder av "juletreet" struktur er perpendikulært forbundet for å danne en fluidbane som er analog med en elektrisk krets. På et påført likestrøm, blir fem EF styrker som genereres inne i dyrkningsområdene med hver har en strøm av en bestemt kjemisk konsentrasjon. Konvensjonelt electrotactic eksperimenter ble utført på petriskåler hvor problemene med upresise EFS medium fordampning, stor celle / reagens forbruk, og økt Joule oppvarming kan oppstå. Tilknyttede, miniatyr microfluidic enheter vinne effektivt disse ulempene. For eksempel, for å studere electrotaxis of humane blodminne T-celler, Lin et al. rapporterte en plast microfluidic enhet som inneholder to identiske, side-by-side mikro-kanaler, to modifiserte pipetter fungerte som mellom reservoarer, og to platinaelektroder for EF-programmet 15. For å øke gjennomstrømningen, ble PMMA-baserte electrotactic chips fabrikert for å gi flere EF styrker i en enkelt enhet 12,33. Også microfluidic enheter i stand til å generere kontrollerbar kjemisk og elektrisk stimuli samtidig er av høy interesse. Li et al. fabrikkert en PDMS-baserte mikrofluidanordning for å generere én eller coexisting kjemiske gradienter / EFs for å undersøke den kjemotaktiske eller electrotactic migrering av T-celler 14. Kao et al. Benyttet en lignende mikrofluid enhet for å modulere kjemotaksien av lungekreftceller ved hjelp av EFs 12. I disse to enheter, ble en Y-form struktur anvendt for å skape en stabil konsentrasjonsgradient i en enkelt anvendt EF. Hou et al. rapporterte en flerkanals-dual-elektrisk felt chip for å studere samtidig effekten av kjemikalier og EFs på lungekreft celler 21. Denne enheten var i stand til å gi 8 kombinasjoner av elektrisk / kjemiske stimuli (to elektriske x 4 kjemiske) i ett eksperiment. Selv om gjennomstrømningen øket, ble denne brikken kapasitet begrenset til (1) bare en EF-styrke (pluss en null som en kontroll), og (2) fire sprøytepumper er nødvendig for å pumpe kjemikalier inn i fire uavhengige kanaler. Til sammenligning har den foreliggende CEF chip fordelen av å generere fem EF styrke sammen med fem kjemiske konsentrasjoner via ett enkelt sett av elektroder og 2 sprøytepumper.
Selv om disse brikkene er lette å fremstilles, har de noen begrensninger. Først kan bare fem "spesifikke" konsentrasjoner og fem "spesifikke" EF styrker bli generert. For det andre, kan bredden av fluidkanalen ikke være mindre enn 1 mm på grunn av fokuseringen avCO to laserstråle. Imidlertid, ved nøyaktig å kontrollere den kjemiske konsentrasjonen i innløpet og den elektriske strøm som passerer gjennom fluidkanalen, eventuelle konsentrasjoner og EF styrker kan oppnås i dyrkningsområdene. I konklusjonen, nåtid CSS og CEF chips er i stand til å gi celler med kontroller singel eller kjøl kjemisk / elektrisk / skjærspenning stimuli. I en enkelt CSS brikke, kan fem forskjellige kjemiske konsentrasjoner i kombinasjon med en skjærspenning gradient bli generert. I tillegg, i en enkelt brikke CEF, fem forskjellige kjemiske konsentrasjoner i kombinasjon med fem EF styrker kan opprettes. Ved å øke grenene på "juletreet" struktur, kan gjennomstrømningen av disse brikkene økes ytterligere. Disse brikkene er vist å være en enkel, tidsbesparende, pålitelig og høy gjennomstrømming plattform for studier av cellulære oppførsel etter kjemisk / elektrisk / skjærspenning stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J.
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
