Abstract
dispositivi microfluidici sono capaci di creare una precisa e controllabile cellulare microambiente di pH, temperatura, concentrazione salina, e altri stimoli fisici o chimici. Essi sono stati comunemente utilizzati per studi cellulari in vitro, fornendo in vivo come i dintorni. In particolare, come le cellule di risposta a gradienti chimici, campi elettrici, e sforzi di taglio ha attirato molti interessi in quanto questi fenomeni sono importanti per comprendere le proprietà e funzioni cellulari. Questi chip microfluidici possono essere fatte di substrati di vetro, silicio, polimeri polidimetilsilossano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA), substrati o substrati di polietilentereftalato (PET). Di questi materiali, substrati PMMA sono economici e possono essere facilmente trattati con ablazione laser e la scrittura. Anche se alcuni dispositivi microfluidici sono stati progettati e fabbricati per la generazione multipla, coesistenti stimoli elettrici e chimici, nessuno di loro è stato consideratosufficientemente efficace nel ridurre le ripetizioni sperimentali, particolari a fini di screening. In questo rapporto, descriviamo la nostra progettazione e fabbricazione di due chip microfluidica PMMA-based per indagare le risposte cellulari, per la produzione di specie reattive dell'ossigeno e la migrazione, sotto chimici / stimoli di stress / shear elettrici singoli o coesistenti. Il primo chip genera cinque concentrazioni relative di 0, 1/8, 1/2, 7/8 e 1 nelle regioni di coltura, insieme con un gradiente di sforzo di taglio prodotta all'interno di ciascuna di queste aree. Il secondo chip genera le stesse concentrazioni relativi, ma con cinque diversi punti di forza del campo elettrico creato all'interno di ogni area culturale. Questi dispositivi non solo forniscono le cellule con un preciso, controllabile micro-ambiente, ma anche di aumentare notevolmente il throughput sperimentale.
Introduction
In cellule in vivo sono circondate da una varietà di biomolecole compreso matrice extracellulare (ECM), carboidrati, lipidi, e altre cellule. Essi funzionalizzare rispondendo agli stimoli micro-ambientali quali le interazioni con ECM e le risposte alle gradienti chimici di vari fattori di crescita. Tradizionalmente, studi cellulare in vitro sono condotti in piatti di coltura di cellule in cui il consumo di cellule e reagenti è grande e le cellule crescono in modo statico (non circolanti) ambiente. Recentemente, dispositivi micro-fabbricato integrati con componenti fluidici hanno fornito una piattaforma alternativa a studi su cellule in un modo più controllabile. Tali dispositivi sono in grado di creare una precisa microambiente di stimoli chimici e fisici riducendo al minimo il consumo di cellule e reagenti. Questi chip microfluidici possono essere fatte di substrati di vetro, silicio, polidimetilsilossano polimeri (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA) substrati, o polyethylenetereftalato (PET) substrati 1-3. dispositivi PDMS basati sono trasparenti, biocompatibili, e permeabile ai gas, che li rende adatti per colture cellulari a lungo termine e studi. substrati PMMA e PET sono economici e facili da lavorare con ablazione laser e la scrittura.
dispositivi microfluidici dovrebbero fornire cellule con un micro-ambiente stabile e controllabile in cui le cellule sono soggette a differenti stimoli chimici e fisici. Ad esempio, i chip microfluidici sono utilizzati per studiare chemiotassi di cellule. Invece di metodi tradizionali che impiegano camera di Boyden e capillare di 4,5 questi dispositivi fluidici miniaturizzati in grado di generare precise gradienti chimici per lo studio dei comportamenti cellule '1,6,7. Un altro esempio è quello di studiare la migrazione direzionale cellule 'in campi elettrici (EFS), un fenomeno chiamato electrotaxis. Comportamenti Electrotactic di cellule sono stati segnalati per essere collegato con la rigenerazione dei nervi 8, lo sviluppo embrionale 9,e ferita guarigione 10,11. E molti studi sono stati condotti per indagare il electrotaxis di vari tipi di cellule, tra cui le cellule tumorali 12,13, i linfociti 14,15, cellule leucemiche 11, e cellule staminali 16. Convenzionalmente, capsule di Petri e bicchieri di copertura sono utilizzati per la costruzione di camere di electrotactic per la generazione di EF 17. Tali configurazioni semplici pongono problemi di media evaporazione e EF imprecise, ma possono essere superati dai dispositivi microfluidici di canali fluidici chiuso, ben definiti 12,18,19.
Per studiare sistematicamente risposte cellulari sotto precise stimoli chimici ed elettrici controllabili,, sarebbe di grande utilità per sviluppare dispositivi microfluidici grado di fornire cellule con stimoli multipli contemporaneamente. Ad esempio, Li et al. riferito un dispositivo microfluidica PDMS-based per la creazione di una o coesistenti gradienti chimici ed EFS 20. Kao et al. devfuggì un chip microfluidica simile a modulare la chemiotassi delle cellule tumorali del polmone da EF 6. Inoltre, per aumentare la produttività, Hou et al. progettato e fabbricato un chip multicanale-dual-campo elettrico PMMA per poter fornire le cellule con 8 diversi stimoli combinati, (concentrazioni 2 punti di forza EF x 4 chimici) essendo 21. Per aumentare ulteriormente il tutto e aggiungere lo stimolo sforzo di taglio, abbiamo sviluppato due dispositivi microfluidici PMMA-based per studiare le risposte cellulari sotto chimici singola o coesistenti / stimoli di stress / taglio elettrici.
Segnalato da Lo et al. 22,23, questi dispositivi contengono cinque canali di coltura cellulare indipendenti soggetti a continuo fluido che scorre, imitando il sistema circolatorio in vivo. Nel primo chip (chip chimico-shear stress o il chip CSS), cinque concentrazioni relative di 0, 1/8, 1/2, 7/8 e 1 sono generati nelle regioni di coltura, e un gradiente di sforzo di taglio è produced all'interno di ciascuno dei cinque aree culturali. Nella seconda piastrina (chip chimico-elettrico campo o il chip CEF), utilizzando un'unica serie di elettrodi e 2 pompe a siringa, cinque resistenze EF si generano in aggiunta a cinque diverse concentrazioni chimiche all'interno di queste aree di coltura. calcoli numerici e simulazioni sono eseguite per una migliore progettazione e funzionano questi chip, e cellule tumorali coltivate all'interno di questi dispositivi sono soggetti a stimoli singoli o coesistenti per osservare le loro risposte rispetto alla produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), il tasso di migrazione, e la direzione di migrazione. Questi chip sono dimostrati di essere risparmio di tempo,-throughput elevato e dispositivi affidabili per indagare come le cellule rispondono a stimoli diversi micro-ambientali.
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Protocol
1. Chip progettazione e fabbricazione
- Disegnare i modelli da ablazione su substrati PMMA e nastri doppio lato utilizzando software commerciale 24.
- Per studiare gli effetti di concentrazioni chimiche e sforzi di taglio, disegnare un pattern "albero di Natale" con una larghezza variabile alla sua estremità in ciascuna delle cinque aree culturali (Figure 1A e 1B).
- Per studiare gli effetti delle concentrazioni chimiche e campi elettrici, disegnare un modello di "albero di Natale" con due canali fluidici più di ponti salini (Figura 2a e 2b).
- Scribe un modello individuale su un foglio di PMMA o un nastro a doppio lato caricando il file corrispondente nella incisione laser CO 2.
- Accendere il incisione laser, e controllare il suo collegamento al computer. Aprire il modello da ablated utilizzando il software commerciale.
- Mettere un foglio PMMA o un nastro biadesivo on cima alla fase della punta per tracciare. Regolare il fuoco del laser CO 2, se necessario, utilizzando la barra di calibrazione e il visibile laser He-Ne.
- Caricare il modello in scriber per l'ablazione sul foglio PMMA o il nastro.
- Sollevare il foglio di fantasia o nastro, rimuovere pezzi indesiderati, e pulire la superficie con soffiaggio di azoto.
NOTA: Lo spessore della lastra PMMA è 1 mm, e quello del nastro biadesivo è 0,07 millimetri o 0,22 mm.
2. assemblaggio di chip
- Con super colla, collegare gli adattatori acriliche (lunghezza x larghezza x altezza 10 mm x 10 mm x 5 mm, con filettature in mezzo) al livello più alto del chip allineando i filettature ei fori sulla parte superiore -La maggior parte strato. Queste schede servono come mezzo di ingressi / uscite e connettori ponte salino.
- Assemblare il chip microfluidico all'interno di una cappa a flusso laminare.
- Montare il chip microfluidica stress chimico-shear (circuito integrato CSS).
- UNttach 3 fogli di lastre in PMMA tracciatura con 2 pezzi di descritto nastro biadesivo. (Figura 1A e 1B).
- Aggiungere un altro pezzo di nastro biadesivo spessore 0,07 millimetri al fondo del chip e collegare il chip ad un diametro di 10 cm Petri.
- Mettere il chip di assemblaggio nella camera a vuoto per una notte.
- Per montare il chip campo chimico-elettrico (circuito integrato CEF), allegare il foglio di PMMA ad un nastro biadesivo di spessore = 0,22 millimetri (Figura 2A e 2B).
- Attaccare il foglio di PMMA descritto e nastro biadesivo per un diametro di 10 cm Petri utilizzando questo stesso pezzo di nastro adesivo.
- Lasciare il chip montato all'interno della cappa ed esporlo ai raggi UV per 30 minuti per la sterilizzazione.
- Collegare gli ingressi a due siringhe da 3 ml con tubi di plastica e dita i dadi. Collegare l'uscita di un tubo di scarico tramite un tubo di plastica ed un dado a bloccarlo.
NOTA: Autoclavetutti i tubi e dadi a 121 ° C per 15 min prima dell'uso. - Premere lentamente lo stantuffo della siringa per primi canali fluidici con PBS. Spingere siringhe avanti e indietro per rimuovere le bolle.
- Mettere le fiches in un incubatore notte a 37 ° C sotto 5% di CO 2.
NOTA: Questi due passaggi sono finalizzate a lavare il chip e rimuovere eventuali bolle rimanenti all'interno del chip. - Prendere il chip fuori dell'incubatore.
- Preparare ponti salini agar per la generazione di campi elettrici nel chip CEF.
- Sciogliere 3% agarosio punto basso punto di fusione in tampone fosfato 1x salina tamponata (PBS) utilizzando un forno a microonde.
- Iniettare la soluzione-phased agarosio nel canale ponte salino e inserire gli elettrodi prima soluzione si solidifica.
- Posizionare elettrodi argento / argento cloruro nei dadi tubolari.
- Collegare le siringhe alle pompe siringa, e il flusso continuo del terreno di coltura (Dulbecco Modified Eagler17; s media, DMEM) nel canale fluidica per 10 minuti a una portata di 20 microlitri / min per sostituire PBS.
3. cellulare Preparazione e apparato sperimentale
NOTA: Pre-caldo 1x PBS, terreno di coltura (DMEM più FBS), e tripsina in un bagno d'acqua C 37 ° prima dell'uso.
- Piastra 2 x 10 di cancro al polmone 5 celle CL1-5 25,26 in una capsula di Petri 10 centimetri fornito con DMEM più siero fetale bovino al 10% (FBS). Incubare le cellule all'interno di un incubatore sotto 5% di CO 2 a 37 ° C fino al 90% di confluenza.
- Aspirare il medio e lavare le cellule una volta con pre-riscaldato 1x PBS. Aggiungere 2 ml di tampone tripsina 0,05% per le cellule e attendere 2 a 3 min a 37 ° C per staccare le cellule.
- Trasferire le cellule ad un 15 ml tubo di centrifugazione sterile e aggiungere 6 ml di mezzo di coltura nel tubo. invertire delicatamente il tubo per la miscelazione ed estrarre 5 microlitri del mezzo cella contenente per contare il numero di cellule in un hemocytometer.
- Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min. Sospendere 10 6 cellule in 1 ml di mezzo di coltura e posizionare il mezzo cella contenente in una siringa da 1 ml.
- Infondere medio cella contenente nel chip microfluidico dalla presa e assicurarsi che la soluzione distribuisce attraverso tutte le cinque aree culturali. Incubare il chip all'interno di un incubatore sotto 5% di CO 2 a 37 ° C per 2 ore.
4. Setup sperimentale
- Prendere il chip fuori dell'incubatore e posizionarlo in cima ad un riscaldatore di vetro di ossido di indio e stagno trasparente (ITO).
NOTA: Il vetro ITO è collegato ad un regolatore proporzionale-integrale-derivativa (PID) per mantenere la temperatura a 37 ± 0,5 ° C tramite feedback da un accoppiatore termica fissata saldamente tra il riscaldatore ITO e il chip. - Mettere il gruppo di chip-riscaldatore sulla cima di una fase XY motorizzato di un microscopio invertito per il monitoraggio migrazione cellulare o uno stadio XY fissoun microscopio a fluorescenza invertito per misurare la produzione di ROS.
- Per generare differenti concentrazioni chimiche, riempire due siringhe con 5 ml di soluzioni chimiche di concentrazioni relative 0 e 1 (disciolti nel mezzo di coltura) e pompare nel chip a portate desiderate: nel chip CSS, ad un flusso di 0,3 ml / min per 1 ora; nel chip CEF, a una portata di 20 microlitri / min per i primi 20 min e una velocità di flusso di 20 ml / h per altri 120 minuti (tempo totale = 2 ore).
- Nel chip CEF, per il monitoraggio della migrazione delle cellule, il programma lo stadio XY del microscopio per ripetere scattare foto, tramite una reflex digitale (DSLR), di certo campo di vista (FOV) all'interno di aree culturali di ogni 15 min per 2 hr.
- Per misurare la produzione di ROS, utilizzare l'indicatore basato sulla fluorescenza 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetato (2'-7'-DCFDA).
- Preparare il brodo di 2'-7'-DCFDA a 10 mm di biologia molecolare grado disolfossido metilico (DMSO). Diluire DCFDA in DMEM senza siero solo (5 micron di DMEM). Il potenziale deacetilasi potrebbe aumentare i segnali di fondo e diminuire i segnali nelle cellule.
- Dopo 1 h di shear stimolo stress nel chip CSS o dopo 2 ore di EF stimolo chip CEF, pompare 2'-7'-DCFDA (5 pM in DMEM) nel chip ad una portata di 20 microlitri / min per il primo 20 min e una velocità di flusso di 20 ml / h per altri 20 min. Per il lavaggio, pompa DMEM nel chip ad una portata di 20 l / h per 20 min.
- Scatta foto, tramite una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD), di alcune FOV all'interno di aree culturali per analizzare le intensità fluorescenti.
5. I calcoli di concentrazioni chimiche, sforzi di taglio, e campi elettrici
- Sia il chip CSS e il chip CEF, calcolare le concentrazioni chimiche nelle cinque aree culturali. Ad esempio, iniettando H 2 O 2 di Conczioni 0 e 200 pM dalle due insenature, concentrazioni di 0, 25, 100, 175, e 200 pM vengono generati.
NOTA: partendo dal presupposto che tutti i liquidi a flusso separato senza intoppi e in modo uniforme intorno alla forcella, le concentrazioni relative nelle cinque aree culturali sono 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1 rispettivamente. - Nel circuito integrato CSS, calcolare la sollecitazione di taglio (τ) in ciascuna delle aree di coltura usando
27, in cui Q è la portata volumetrica, η è la viscosità fluidico, h è l'altezza del canale, e w è la larghezza del canale.
NOTA: Impostando Q = 0,3 ml / min a ciascun ingresso (Q = 0,12 ml / min in ciascuna area culturale), η = 0.0008 Pa · s per mezzo di coltura, h = 1 mm, w = 1 ~ 4 mm, la sollecitazione di taglio viene calcolata variare da 0,0048 Pa (regione larghezza di 4 mm) a 0,0192 Pa (regione di larghezza 1 mm). - Inil chip CEF, calcolare la forza EF entro ciascuna delle zone di coltura utilizzando E = I / (σA eff) (legge di Ohm), dove I è la corrente elettrica che scorre attraverso il canale fluidico, σ è la conducibilità elettrica del terreno di coltura, e A eff è l'area della sezione trasversale effettiva del canale.
NOTA: Utilizzando σ = 1,38 Ω -1 m -1 per mezzo di coltura e A eff = 0,22 millimetri 2 (larghezza = 1 mm ed altezza = 0,22 millimetri), la forza EF è calcolato per essere E (mV / mm) = I ( A) × 3.3 × 10 6.- Come mostrato in figura 2D, trattare il circuito equivalente di cinque circuiti a sezione a C con quattro (8 + 35 + 8) segmenti e uno (5 + 35 + 5) segmento.
NOTA: Analizzando questo circuito parallelo secondo la legge la tensione di Kirchhoff e la legge di Ohm, corrente che fluisce attraverso la cultura sono cinquecome, I 1 a I 5 dal basso verso l'alto, sono calcolati a circa 0,49 I (zona 1), 0,25 mi (zona 2), 0,13 mi (zona 3), 0,08 mi (zona 4), e 0,05 mi (area 5) rispettivamente, dove I è la totale corrente continua (cc). Con una corrente continua applicata di 0,157 mA, EF di 254, 130, 67, 41, e 26 mV / mm sono generate nei cinque aree culturali.
NOTA: Per un'analisi elettrico semplificato della rete microfluidica, tutti i segmenti fluidici sono considerate come resistori con resistenza proporzionale alla loro lunghezza.
- Come mostrato in figura 2D, trattare il circuito equivalente di cinque circuiti a sezione a C con quattro (8 + 35 + 8) segmenti e uno (5 + 35 + 5) segmento.
27, in cui Q è la portata volumetrica, η è la viscosità fluidico, h è l'altezza del canale, e w è la larghezza del canale. Analisi 6. Dati
Nota: L'analisi dei dati viene effettuata utilizzando il software ImageJ.
- Analizzare la produzione di ROS.
- Eseguire il software ImageJ. Vai su "File" → Apri per caricare un'immagine fluorescente da analizzare.
- Vai a "Immagine" → "Tipo" → "16 bit" per cambiare l'imetà per una scala di grigi.
- Disegnare un poligono per racchiudere una cella. Vai a "Analisi" → "Measure" per misurare l'intensità di fluorescenza media della cella.
- Ripetere 6.1.3 per raccogliere intensità da almeno 50 cellule di tre esperimenti indipendenti, e calcolare l'intensità media con errore standard della media (SEM).
- Ripetere 6.1.1-6.1.4 per ogni condizione sperimentale.
- Analizzare Migrazione cellulare.
- Eseguire il software ImageJ. Vai su "File" → Apri per caricare un'immagine scattata al tempo = 0 da analizzare.
- Disegnare un poligono per racchiudere una cella. Vai a "Analisi" → "Measure" per misurare il centro di massa della cella come (x 1, y 1).
- Ripetere 6.2.1- 6.2.2 per misurare il centro di massa della stessa cella (x 2, y 2) da un'altra immagine prendere al tempo = t.
- Calcolare il tasso di migrazione (in micron / ora) diquesta cella come
. - Ripetere 6.2.1-6.2.4 per raccogliere i tassi di migrazione da almeno 50 cellule di tre esperimenti indipendenti, e calcolare il tasso di migrazione media con errore standard della media (SEM).
- Da 6.2.2 e 6.2.3, calcolare la direzionalità migrazione di questa cellula come coseno θ o
, Dove θ è l'angolo tra il vettore della EF applicata (da positivo a negativo) e il vettore dall'inizio alla posizione finale della cella (Figura 2G). - Ripetere 6.2.6 per raccogliere directedness migrazione da almeno 50 cellule di tre esperimenti indipendenti, e calcolare la direzionalità di migrazione media con errore standard della media (SEM).
- Calcolare il tasso di migrazione media con SEM e la direzionalità di migrazione media con SEM per ogni condizione sperimentale.
NOTA: A directednessdi +1 indica che tutte le cellule migrano verso il catodo, e un valore -1 indica che tutte le cellule migrano verso l'anodo. La direzionalità di un gruppo di cellule in modo casuale in movimento è vicino a 0.
- Analizzare Allineamento celle.
- Eseguire il software ImageJ. Vai su "File" → "Apri" per caricare un'immagine da analizzare.
- Trattare la cella come un'ellisse e tracciare una linea per indicare l'asse longitudinale di una cella. Vai a "Analisi" → "Measure" per misurare l'angolo β tra la linea e la direzione EF orizzontale.
- Ripetere 6.3.2 per raccogliere β da almeno 50 cellule di tre esperimenti indipendenti, e calcolare il coseno media β con errore standard della media (SEM).
- Ripetere 6.3.1-6.3.3 per ogni condizione sperimentale.
NOTA: A cos β di +1 indica che tutte le celle siano allineati in parallelo alla applicata EF, e un valore 0 indica che tutte le cellule siano allineati perpendicularly al applicata EF.
. 
, Dove θ è l'angolo tra il vettore della EF applicata (da positivo a negativo) e il vettore dall'inizio alla posizione finale della cella (Figura 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il stress chimico-taglio (CSS) Chip
Il chip CSS è costituito da tre lastre in PMMA, ciascuno di 1 mm di spessore, collegati tra loro tramite due nastri biadesivi, ciascuno dello spessore 0,07 millimetri (Figura 1A e 1B). La struttura "ad albero di Natale" genera cinque concentrazioni relative di 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1 nelle cinque aree culturali. Progettando l'area cultura come un triangolo, un gradiente di sollecitazione di taglio, con una grandezza correlata al flusso volumetrico, la viscosità fluidica, e la dimensione del canale fluidico, viene creato all'interno di ciascuna delle aree. Questo chip viene poi collegato, tramite un altro 0,07 mm di spessore nastro biadesivo, ad una piastra di Petri per coltura di cellule CL1-5 cancro del polmone e la produzione di ROS è stata osservata in risposta a differenti concentrazioni chimiche e sollecitazioni di taglio. La produzione di ROS nelle cellule tumorali del polmone è fortemente legata alla lung metastasi del cancro e lo sviluppo, e alcune sostanze chimiche e sforzo di taglio sono state dimostrate essere coinvolti nella generazione di ROS 23.
Innanzitutto, per studiare l'effetto di H 2 O 2, uno stimolo chimico, sulla produzione di ROS, le cellule sono state incubate con continuo fluire di H 2 O 2 soluzioni a 0, 25, 100, 175, e 200 mM. Come mostrato nella Figura 1C, l'intensità di fluorescenza aumentato la concentrazione di H 2 O 2, aumentato, indicando che H 2 O 2 stimolato la produzione di ROS. Quindi, per studiare l'effetto della sollecitazione di taglio sulla produzione di ROS, le cellule sono state esposte a un gradiente di sollecitazione di taglio di 0,0048 Pa a 0,0192 Pa. La Figura 1D mostra che l'intensità di fluorescenza aumentato lo sforzo di taglio maggiore (le tensioni tangenziali erano i più alti e il più basso nelle zone davanti e dietro, rispettivamente), suggerisconoing che più alto shear stress indotto più di ROS produzione. Inoltre, questo chip CSS è stato utilizzato per studiare la produzione di ROS in risposta a differenti concentrazioni di α-tocoferolo, un antiossidante di una forma di vitamina E. Le cellule sono state stimolate da shear stress più α-tocoferolo di 0, 3.2, 12.5, 21.9 , e 25 ug / ml. Come mostrato nella Figura 1E, per concentrazioni di α-tocoferolo inferiore 21,9 ug / ml, l'intensità di fluorescenza diminuito la concentrazione aumentata, indicando l'effetto di α-tocoferolo nel ridurre la produzione di ROS. Tuttavia, poiché la concentrazione aumentata a 25 mcg / ml, l'intensità media è aumentato, suggerendo che questa elevata concentrazione di α-tocoferolo non eliminava molto ROS rispetto alle concentrazioni più basse.
Il settore chimico-elettrico (CEF) Chip
Il chip CEF è costituito da una PMMA spessore 1 mm e 0,22-mm nastro biadesivo con canali fluidici modellate su di esso (Figura 2A e 2B). Allo stesso modo, la struttura "ad albero di Natale" crea cinque concentrazioni relative di 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1 nelle cinque aree culturali. Inoltre, questi cinque settori paralleli sono collegati perpendicolarmente per formare un percorso fluidico analogo a un circuito elettrico. Il campo elettrico generato all'interno di un'area coltura è legata alla conducibilità del fluido, l'area della sezione trasversale del canale, e la corrente continua (cc) passando attraverso l'area. Secondo la legge la tensione di Kirchhoff e la legge di Ohm, le correnti nei cinque aree culturali sono 0,49 mi, 0,25 mi, 0,13 mi, 0,08 mi, e 0,05 mi, rispettivamente, dove I è la corrente continua applicata (Figura 2C). Questo chip è collegato, tramite la spessa 0,22 mm nastro biadesivo, ad una piastra di Petri per la coltura di cellule di cancro al polmone CL1-5 per osservare la migrazione delle cellule e la production di ROS in risposta a differenti concentrazioni chimiche e campi elettrici.
Innanzitutto, questo chip è stato utilizzato per studiare la produzione di ROS in risposta a differenti concentrazioni di honokiol, diverse concentrazioni di EF e trattamenti combinati di entrambi. Honokiol, un polifenolo piccola molecola isolata dal genere Magnolia, è stato trovato per avere antiangiogenici, anti-infiammatori, e le proprietà antitumorali in studi preclinici 28. Come mostrato in figura 2D, il ROS prodotta era quasi la stessa per EF inferiori a 67 mV / mm, ma è stata aumentata con l'aumentare EF sopra di questo valore. La figura 2E mostra che sotto trattamenti combinati di campi elettrici e honokiol, il livello di ROS rimasto quasi stesso, indicando che honokiol inibita la produzione di ROS esogena (es., ROS correlate a EF stimolo), specialmente sotto EF superiori. La migrazione delle cellule in chimica singolo o coesistenti/ stimoli elettrici è stato anche studiato utilizzando questo chip CEF. Come si vede nella figura 2F, senza aggiunta di honokiol, il tasso di migrazione aumentato come la forza EF aumentato. Dopo aver aggiunto honokiol di diverse concentrazioni, il tasso di migrazione diminuito in generale, suggerendo che honokiol ridotta migrazione cellulare possibilmente attraverso inibendo la produzione di ROS. La direzionalità migrazione è mostrato in Figura 2G. In presenza di EF solo, le cellule tumorali polmonari mostravano prominente migrazione direzionale verso l'anodo (con valori negativi). Dopo aver aggiunto honokiol di diverse concentrazioni, c'è stata una leggera diminuzione della direzionalità di migrazione per tutte le aree EF-stimolata.
Figura 1: Il Chemical-shear stress (CSS) chip utilizzato per studiare gli effetti delle sostanze chimiche e sollecitazioni di taglio su cellule polmonari Cancro 2.3
(A) Tre strati di substrati PMMA sono legati tra loro tramite due nastri a doppia faccia per formare il chip CSS. (B) Il chip CSS integrato. (C) superiore: fluorescente e le immagini in campo chiaro di CL 1-5 cellule dopo essere stati trattati con diverse concentrazioni di H 2 O 2. Barra di scala = 50 micron. In basso: intensità della fluorescenza medio con SEM tracciata a diverse concentrazioni di H 2 O 2. (D) In alto: le immagini fluorescenti di CL 1-5 cellule in diverse sollecitazioni di taglio. Barra di scala = 50 micron. In basso: intensità della fluorescenza medio con SEM tracciata a diverse sollecitazioni di taglio. (E) In alto: le immagini fluorescenti e in campo chiaro di CL 1-5 cellule dopo essere stimolati con sforzo di taglio con diverse concentrazioni di α-tocoferolo. Barra di scala = 50 micron. In basso: intensità della fluorescenza medio con SEM tracciata a diverse concentrazioni di α-tocoferolo. I dati presentati qui wcome originariamente pubblicato nel riferimento 23. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il campo chimico-elettrico (CEF) chip utilizzato per studiare gli effetti delle sostanze chimiche e dei campi elettrici su cellule polmonari Cancro 22.
(A) Uno strato di PMMA è legato su un piatto di coltura tramite un nastro biadesivo per formare il chip CEF. (B) Il modello fluidico del chip CSS. (C) Il circuito elettrico equivalente del chip microfluidico. (D) A sinistra: fluorescenti e in campo chiaro immagini di CL 1-5 cellule dopo essere stati trattati con diversi punti di forza di EF. Barra di scala = 50 micron. A destra: media fluorescenteintensità con SEM tracciata in diversi punti di forza di EF. (E) A sinistra: fluorescente e le immagini in campo chiaro di CL 1-5 cellule dopo essere stati trattati con combinato honokiol ed EFS. Barra di scala = 50 micron. A destra: media intensità fluorescente con SEM tracciata in combinato honokiol ed EFS. (F) I tassi di migrazione delle cellule CL1-5 dopo essere stati trattati con EF solo (contrassegnate come controllo) e honokiol combinato ed EFS (contrassegnati come honokiol). (G) La direzionalità migrazione delle cellule CL1-5 dopo essere stati trattati con EF solo (contrassegnate come controllo) e honokiol combinato ed EFS (contrassegnato come honokiol). I dati presentati qui è stato originariamente pubblicato in riferimento 22. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
chip PMMA-based sono fabbricati con ablazione laser e la scrittura, che sono metodi meno costosi e più facili rispetto ai chip PDMS-based che richiedono più complicato litografia soft. Dopo aver progettato un chip microfluidica, la fabbricazione e l'assemblaggio può essere fatto nel giro di 5 minuti. Ci sono alcuni passaggi critici che l'attenzione dovrebbe essere prestata alla nello svolgimento dell'esperimento. Il primo è la questione "assemblaggio". Gli adattatori devono essere incollati correttamente al livello più alto del chip. Colla potrebbe fuoriuscire nei canali fluidici se si applica troppo, e il liquido potrebbe fuoriuscire del chip se si usa troppo po 'di colla. Inoltre, nel montaggio substrati PMMA ei nastri biadesivi, è importante applicare pressione per premere il chip tutto strettamente per evitare perdite di liquido. Il secondo è il problema "bolla". Per rimuovere le bolle, 1x PBS viene continuamente fluito nel canale fluidica per 1 o 2 minuti ad una portata di 20 microlitri / min e poi il chip è pcucita all'interno di un incubatore notte sotto 5% di CO 2 a 37 ° C. Se ci sono bolle rimanenti all'interno dei canali fluidici, il flusso sarà non uniforme, causando concentrazione chimica non omogenea e la distribuzione EF. Il terzo è il problema "di carico delle cellule". Il numero di cellule caricate nelle zone di coltura deve essere ben controllata. Se il numero di cellulare è troppo basso, molte prove sperimentali dovrebbero essere condotte per raccogliere abbastanza dati a fini statistici. Se il numero di cellule è troppo alto, sarà difficile distinguere singole cellule e quantificare la loro migrazione.
Nel circuito integrato CSS, una struttura "ad albero di Natale" in combinazione con una superficie cultura triangolare genera diverse concentrazioni chimiche in cinque settori, ciascuno avente un gradiente di sollecitazione di taglio. sollecitazioni di taglio fluidiche erano noti per influenzare l'allegato, la morfologia, la migrazione e l'attività delle cellule. Le sollecitazioni di taglio di partire da 0,25-0,6 Pa potrebbe interfacciarsi adesione cellulare, Sono stati riportati i valori e ancora più elevati di stress (0,5 -10 Pa) per rimuovere le cellule aderenti 29. Sollecitazioni di taglio laminari da 0.8 a 1.5 allineamento cellulare indotta Pa nella direzione del flusso 30, e valori ancora più bassi (0,1-1 Pa) erano noti per influenzare la morfologia cellulare e permeabilità 29. Inoltre, le cellule muscolari lisce sottoposte a sforzi di taglio di 2-120 Pa subito un calo del numero di cellule 31. Lu et al. riferito la progettazione e la costruzione di dispositivi di taglio microfluidica di analisi quantitativa di adesione cellulare 27. Lo sforzo di taglio all'interno del canale fluidico è stato modificato cambiando le dimensioni del canale. Chin et al. descritto un sistema emodinamico Lab-on-a-chip per il controllo della portata del mezzo di coltura nel micro-canale per simulare il profilo di flusso del sangue nel vaso 32. Lo sforzo di taglio all'interno del canale fluidico è stato modificato cambiando la portata del fluido. NelSE due dispositivi, anche se una sollecitazione di taglio di ogni valore potrebbe essere generato, soltanto un singolo valore era disponibile all'interno di un'area cultura contemporaneamente. In confronto, il chip presente CSS ha il vantaggio di fornire un gradiente di sollecitazione di taglio in una zona triangolare, aumentando il throughput sperimentale specialmente per scopi di screening.
In il chip CEF, le aree culturali della struttura "albero di Natale" sono perpendicolarmente collegati a formare un percorso fluidico analogo a un circuito elettrico. A un applicata corrente continua, cinque resistenze EF si generano all'interno delle aree culturali con ciascuno avente un flusso di una concentrazione specifica sostanza chimica. Convenzionalmente, esperimenti electrotactic sono stati eseguiti su piastre di Petri in cui potrebbe verificarsi problemi di EF imprecise, evaporazione medie, grandi cellule / consumo di reagente, e l'aumento del riscaldamento Joule. Chiuso, dispositivi microfluidici in miniatura a superare in modo efficiente questi inconvenienti. Ad esempio, per studiare la electrotaxis of cellule T di memoria del sangue umano, Lin et al. ha riportato un dispositivo a microfluidi di plastica contenente due identici, side-by-side micro-canali, due punte per pipette modificati servito da serbatoi di media, e due elettrodi di platino per l'applicazione EF 15. Per aumentare il throughput, chip electrotactic PMMA basati sono state realizzate per fornire più forza EF in un unico dispositivo 12,33. Inoltre, dispositivi microfluidici grado di generare chimica controllabile e stimoli elettrici simultaneamente sono di grande interesse. Li et al. fabbricato un dispositivo microfluidica PDMS-based per generare chimici sfumature / EF singole o coesistenti per indagare il chemiotattica o la migrazione delle cellule T electrotactic 14. Kao et al. Impiegato un dispositivo a microfluidi simile a modulare la chemiotassi delle cellule tumorali del polmone utilizzando EF 12. In questi due dispositivi, una struttura Y-forma è stata applicata per creare un gradiente di concentrazione stabile in un'unica applicata EF. Hou et al. riportato un chip multicanale-dual-elettrico-campo per studiare l'effetto concomitante di prodotti chimici ed EFS sulle cellule del cancro del polmone 21. Questo dispositivo è stato in grado di fornire 8 combinazioni di stimoli elettrici / chimici (2 x 4 elettrica chimici) in un esperimento. Sebbene il throughput aumentato, la capacità di questo chip è stato limitato a (1) un solo forza EF (più uno zero come controllo), e (2) quattro pompe a siringa sono richiesti per pompare sostanze chimiche in quattro canali indipendenti. In confronto, il chip presente CEF ha il vantaggio di generare cinque forze EF con cinque concentrazioni chimiche con un'unica serie di elettrodi e 2 pompe a siringa.
Anche se questi chip sono facili da fabbricare, hanno alcune limitazioni. In primo luogo, solo cinque concentrazioni "specifici" e cinque punti di forza "specifici" EF possono essere generati. In secondo luogo, la larghezza del canale fluidico non può essere inferiore a 1 mm a causa della focalizzazione delCO 2 fascio laser. Tuttavia, controllando accuratamente la concentrazione chimica in entrata e la corrente elettrica che passa attraverso il canale fluidico, concentrazioni e forze EF possono essere conseguiti nelle zone di coltura. In conclusione, l'attuale CSS e patatine CEF sono in grado di fornire cellule con controllabili stimoli chimici singola o coesistenti / elettrico / shear stress. In un circuito integrato singolo CSS, cinque diverse concentrazioni chimiche in combinazione con un gradiente di sforzo di taglio possono essere generati. Inoltre, in un singolo chip CEF, possono essere creati cinque diverse concentrazioni chimiche in combinazione con cinque forze EF. Aumentando i rami della struttura "ad albero di Natale", la velocità di questi chip può essere ulteriormente aumentata. Questi chip sono dimostrati di essere un facile, risparmio di tempo, affidabile, e la piattaforma high-throughput per lo studio del comportamento cellulare in stimoli chimici / elettrico / shear stress.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
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