Introduction
Een beperking van de huidige HIV-1 behandelingen is dat ze chronisch moeten worden toegediend aan progressie van de ziekte te voorkomen. Transplantatie van HIV-1 resistent T-lymfocyt of hematopoietische stamcellen, heeft het potentieel om lange termijn controle van HIV-1 replicatie verschaffen bij afwezigheid van de therapie 1,2 en kan ook een effectieve aanpak van een HIV-1 behandeling te bereiken 3. Een manier om cellen resistent tegen HIV-1 replicatie render dient een of meer genen die coderen voor anti-HIV-1 RNA of peptiden in cellen van een geïnfecteerd individu plaatst tijdens een autologe transplantatie 4. Sommige kandidaat anti-HIV-1-genen zijn ontworpen met een aantal invoeren klinische proeven in combinaties van twee of 5 drie 6, de ontwikkeling van HIV-1 resistentie voorkomen dat een enkel gen.
Anti-HIV-1 RNA tot de top kandidaten voor combinatie gentherapie vanwege hun lage potentie tot immuunreacties en omdatgetranscribeerd vanaf zeer korte gensequenties. Sommige anti-HIV-1 RNA's zijn ontworpen om virale binnenkomst en integratie targeten. De meeste anti-HIV-1 RNA doelwit na integratiestappen in de virale levenscyclus (figuur 1). Na integratie remmers omvatten helper-RNA's, gericht op de HIV-1 regulerende eiwitten Tat of Rev 1, en antisense-RNA gebaseerde, gericht is op verschillende plaatsen in HIV-1 RNA, zoals ribozymen 7, shRNAs 8 en 9 U1i RNAs. Werkwijzen die zijn gebruikt om de effectiviteit van anti-HIV-1 RNA te vergelijken onder controle virale replicatie in cellen getransduceerd met genen coderend voor kandidaat RNA's en het meten van virusproductie in cellen tijdelijk getransfecteerd met plasmiden die kandidaat RNA en HIV-1 expressieplasmide 10 -13. We hebben voorheen een HIV-1-productie-assay voor het screenen van HIV-1 RNA naar nieuwe ribozyme doelplaatsen 13-15. Deze methoden zijn inmiddels verfijnd om het formaat van een RNA te optimalisereninterferentie molecuul tot expressie gebracht uit plasmide-DNA als een shRNA of geleverd als synthetische siRNA 16. De test meet de productie van rijpe virussen uit humane embryonale nier (HEK) 293T cellen, en kan worden gebruikt om de effecten van remmers die post-integratiestappen in de HIV-1 replicatie cyclus targeten (figuur 1) te vergelijken. Voor remmers die pre-integratiestappen targeten, worden alternatieve assays zoals TZM-bl infectiviteit cell assay 17 nodig antivirale werkzaamheid te evalueren.
Belangrijke veiligheidsproblemen voor de afgifte van anti-HIV-1 RNA in de kliniek onder potentiële off-target effecten op de RNA of eiwitten, en activering van aangeboren immuunsysteem sensoren. Om de toxiciteit van anti-HIV-1 siRNA evalueren, hebben wij een cellevensvatbaarheid assay verschillende cellijnen 16 gebruikt. Ook gemeten activatie van het dubbelstrengs RNA immune sensoren, RNA geactiveerd proteïne kinase R (PKR) en toll-like receptor 3 (TLR3), alsmede expression van de interferon-geïnduceerde gen, ADAR1 P150. Deze testen kunnen worden gebruikt om te bevestigen dat de werkzaamheid van anti-HIV-1 RNA's niet door indirecte effecten op cellevensvatbaarheid of immuun activering sensor. Ze zijn ook bruikbaar bij het uitsluiten van kandidaat RNA met potentiële toxiciteiten verdere ontwikkeling.
In de volgende protocollen, procedures nieuwe therapeutische RNAs identificeren en optimaliseren van de vorm van bestaande beschreven. De werkwijzen zijn bruikbaar voor het screenen op RNA gebaseerde na integratie remmers van HIV-1 replicatie en kunnen worden aangepast aan andere post-integratie remmers, zoals kleine moleculen gericht op Rev gemedieerde uitvoer van viraal RNA 18 of CRISPR scherm / Cas systemen die gericht geïntegreerd HIV-1-DNA 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellen en transfecties
- Cultuur HEK 293T cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Bereid een 2 x 10 5 cellen / ml suspensie in het celkweekmedium. Voeg 500, 100 en 1000 ul van de celsuspensie aan elk putje van 24-well, 96-well en 12-well platen voor virusproductie cellevensvatbaarheid en immuun activatie assays, respectievelijk (Figuur 2A).
- Zwenk de platen en incubeer ze O / N bij 37 ° C met 5% CO 2. Kweek cellen 50-70% confluentie.
- Volgens een transfectie plan, bereiden verdunningen van de test RNA's en hun controles in 1,5 ml micro-buizen (voorbeeld, Figuur 2B).
- Voor de virusproductie assay Bereid een 10 ng / ul verdunning van een HIV-1 expressieplasmide en voeg 10 ul aan elk buisje. Volgende bereiden 5 uM verdunningen van de test RNA's en een negatieve controle RNA. Voeg 2,5 of 10 pl van elke test RNA en negatieve controle verdunning tot de overeenkomstige buizen van 25 of 100 nM eindconcentraties.
- Voor de cellevensvatbaarheid test bereiden 5 uM verdunningen van de test RNA en een 10 mg / ml verdunning van de positieve controle RNA laagmoleculaire poly I: C. Voeg 2 ul test RNA of positieve controle RNA verdunningen aan de overeenkomstige buizen voor 100 nM of 200 ug / ml eindconcentraties respectievelijk.
- Voor de activering van het immuunsysteem assay, voeg 20 ul test RNA of positieve controle RNA verdunningen bereid in stap 1.3.2. de overeenkomstige buizen voor 100 nM of 200 ug / ml eindconcentraties respectievelijk.
Opmerking: Voor het testen RNA expressieplasmiden bereiden 10 ng / pl verdunningen in plaats van de 5 uM verdunningen test RNA, waardoor uiteindelijke hoeveelheden 25 en 100 ng van stap 1.3.1. en 100 ng voor de stappen 1.3.2. en 1.3.3.
- Voeg 50, 25 of 75 gl DMEM aan elke transfectie buis virale production cellevensvatbaarheid en immuun activatie assays, respectievelijk. Voor virale productie assays, brengen cellen en bereid transfectie buizen naar een bio-safety level 3 (BSL3) laboratorium voor de volgende stap.
- Voeg 2 ul van het transfectiereagens achtereenvolgens de transfectie buizen en incubeer 15-20 minuten om complexen te vormen. Zie de Tabel Materialen voor de specifieke transfectie reagens te gebruiken.
- Voeg de gehele transfectiemengsel van elke microbuis druppelsgewijs aan de overeenkomstige posities in de celcultuur platen. Zwenk en incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Meet HIV-1-productie (deel 2), levensvatbaarheid van de cellen (deel 3) en activering van het immuunsysteem (deel 4) in de celkweek platen (figuur 2C).
2. virusproductie Assay
- Verwijder de 24-well celkweek platen uit de incubator en zachtjes wervelen de platen in de BSL3 celkweekkap. Transfer 150 pl supernatant uit elk putje naar een overeenkomstige putje in een 96-well plaat met vlakke bodem, die zal worden gebruikt om te kwantificeren HIV-1-productie.
Opmerking: Common virale kwantificering assays omvatten het meten van de expressie van de HIV-1 capside-eiwit (p24) door enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) 20 kwantificeren viraal RNA door reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) 21 en meten van de activiteit van de HIV-1 RT enzym. Stappen 2,2-2,5 methoden uit te leggen aan HIV-1 RT-activiteit 13,15,16 kwantificeren. - Overdracht 5 pi supernatant overeenkomstige putjes in een 96-well plaat met 25 ul van een virale verstoring cocktail 15 (tabel 1). Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en breng de plaat radioactiviteit werkstation.
Opmerking: Stap 2.2. is alleen nodig als een radioactiviteit werkstation is niet beschikbaar in de BSL3 laboratorium. Indien de platen niet hoeft uit de te verwijderenBSL3 laboratorium, ga dan naar stap 2.3. en voeg 50 ul van radioactieve / virale verstoring cocktail (Tabel 1) in plaats van de 25 pi radioactief cocktail. - Bereid een radioactieve cocktail 15 (Tabel 1) en voeg 25 ul aan elk putje van virale supernatant en verstoring cocktail. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Spot 5 ui van het reactiemengsel op overeenkomstige velden in een glasvezel Di Ethyl aminoethyl (DEAE) filtermat papier en laat de vlekken drogen 10 min. Spot het reactiemengsel in elke vierkante zodat er geen twee monsters direct elkaar grens. Dit helpt om cross-over tussen de monsters te voorkomen dat bij het bepalen van tellingen per minuut (cpm) in stap 2.6.
- Was de papieren 5x gedurende 5 min met 2x saline natriumcitraat (SSC) buffer (Tabel 1), gevolgd door twee 1 min wassen met 95% ethanol. Laat de kranten te drogen en te verzegelen in zakken.
- Clip monster zakken containing de filtermat papier in een cassette en plaats de cassette in een microplaat scintillatieteller. Stel de teller cpm lezen voor 32 P met de peildatum voorzien voor de partij van [32 P] dTTP gebruikt in het experiment. Selecteer welke monsters te lezen met behulp van de kaart plaat en start de teller.
- Voor elke virale kwantificeermethode, verdelen de waarden verkregen voor elke test RNA de daarnaast negatieve controle en vermenigvuldig deze waarde door 100 om het percentage remming van HIV-1-productie te verkrijgen voor elke herhaling van de test RNA. Een voorbeeld van de resultaten vergelijken verschillende monsters RNA bij verschillende concentraties wordt in figuur 3.
3. levensvatbaarheid van de cellen Assay
- Verwijder de 96-wells platen uit de incubator en voeg 20 ul van 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-difenyl-2H-tetrazolium bromide) verdund in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing ( DPBS) aan elk putje. Incubeer de platen fof 3 uur bij 37 ° C.
- Voeg 150 gl isopropanol aangezuurd met detergent (1% NP-40, 4 mM HCI in isopropanol) aan elk putje en incubeer de platen gedurende 2 uur bij KT.
- Bepaal de absorptie bij 570 nm in een microplaat spectrofotometer.
- Bereken het relatieve MTT stofwisseling voor elke positieve controle en test RNA door de verkregen voor elk monster door de aangrenzende transfectie controle waarde te delen. Een voorbeeld van de resultaten vergelijken verschillende monsters RNA en een positieve controle wordt verschaft in figuur 4.
4. Immune Activation Assay
- Verwijder de 12-wells platen uit de incubator en zuig het kweekmedium. Voorzichtig te wassen de cellen tweemaal met DPBS en voeg 70 ul koude lysisbuffer 22 (inclusief protease en fosfataseremmers, tabel 1) aan elk putje. Incubeer de platen gedurende 10 minuten op ijs.
- Transfer cellysaten aan micro tubes en snelle vries ze door onderdompeling van debuizen in vloeibare stikstof. Laat de monsters ontdooien en herhaal voor 2 vries dooi cycli in totaal 3.
- Centrifugeer de lysaten gedurende 15 minuten bij 4 ° C, 15.700 xg om celresten te pelleteren. Breng de bovenstaande nieuwe microbuisjes en bepaal de eiwitconcentratie volgens de methode 23,24 Coomassie blue (Bradford).
- Resolve 75 ug eiwit uit elk monster in een 10% denaturerende polyacrylamidegel en overbrengen naar een nitrocellulosemembraan zoals eerder beschreven 25,26.
- Na elektroforese en overdracht naar een membraan, onthullen eiwitbanden door incubatie van het membraan Ponceau S (Tabel 1) gedurende 1 minuut, gevolgd door wassen in dubbel gedistilleerd water. Gebruik de bands en eiwit ladder als een leidraad voor het membraan te snijden op 80 en 55 kDa.
Opmerking: In stap kan 4,4 samples worden uitgevoerd op 16 x 18 cm 2 gels naar 34 kDa, zodat het gemakkelijk is om het membraan te snijden op de aangegeven posities en niet dwars door debanden van belang. Als alternatief kunnen meerdere gels worden uitgevoerd met dezelfde monsters om te voorkomen dat het snijden van de membraan. - Spoel de Ponceau S kleuring met Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,05% Tween 20 (TBST, tabel 1). TBST toevoegen 5% magere melk aan de membranen volledig omsluit. Incubeer de membranen bij kamertemperatuur onder schudden gedurende 1 uur.
- Incubeer de membranen O / N in TBST met 3% runderserumalbumine (BSA) en antilichamen verdund tot 1 in 1000 tegen ADAR1 (110 en 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa) en fosfo-IRF3 (47 kDa), de bovenste, middelste en onderste delen van het membraan, respectievelijk.
- Was de membranen 5x gedurende 5 min met TBST en incuberen in TBST met 5% vetvrije melk en met peroxidase gemerkt geit-anti-konijn secundaire antilichamen (verdund tot 1 in 5000) gedurende 1 uur.
- Was de membranen 5x gedurende 5 min met TBST en toepassen oplossing elektrochemiluminescentie (ECL) de banden zichtbaar op folies volgens instructies van de fabrikant.
- Na het visualiseren van de eiwitbanden op films, was de middelste en onderste delen van het membraan gedurende 10 minuten met een antilichaam stripoplossing. Incubeer de membranen O / N in TBST met 3% BSA en antilichamen tegen totale PKR (bij 1 in 500) en IRF3 (1 in 1000), de middelste en onderste delen respectievelijk. Herhaal stap 4.8. en 4,9. met behulp van peroxidase gemerkt geit-anti-muis in plaats van het anti-konijn secundair antilichaam voor de PKR membraan (midden).
- Was het onderste stuk van het membraan 5x gedurende 5 min met TBST en incubeer het membraan in TBST met 3% BSA gedurende 1 uur met een antilichaam tegen actine (verdund tot 1 in 5000). Herhaal stap 4.8. en 4,9. met behulp van peroxidase gemerkt geit-anti-muis in plaats van het anti-konijn secundair antilichaam. Een voorbeeld van de resultaten vergelijken verschillende monsters RNA en een positieve controle wordt verschaft in Figuur 5. Zie de Tabel Materialen voor de specifieke antilichamen te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een algemeen schema van de procedure is weergegeven in figuur 2 een voorbeeld transfectie plan voor drie proeven RNA en een RNA controle verschaft in Figuur 2B. Voor virusproductie en cellevensvatbaarheidsassays, de aflezing voor elke test construct is genormaliseerd op een negatieve controle. Replicaten worden getransfecteerd in sets, zodat elke test RNA wordt genormaliseerd naar de aangrenzende negatieve controle. Dit wordt gedaan om onjuiste gegevens betreffende de tijd tussen complexerende en transfectie die kunnen ontstaan als, bijvoorbeeld, alle negatieve controles worden eerst getransfecteerd voorkomen. Omdat HIV-1 kan beïnvloeden immuunresponsen 27,28, de levensvatbaarheid van de cellen en immuun activatie assays worden gedaan zonder de toevoeging van een HIV-1 expressie plasmide.
Om de optimale lengte van RNA interferentie moleculen identificeren gericht op een geconserveerde plaats in HIV-1 RNA (positie 1498-141519 in HIV-1-stam NL4-3) 13, een set van siRNA's werden ontworpen (Figuur 3A). Met het HIV-1-productie-assay, het percentage van de RT-activiteit in vergelijking met cellen die met een lange Dicer substraat nonsense siRNA (zonden) werd berekend voor cellen die met elke proef siRNA op verschillende hoeveelheden co-transfectie met 100 ng van een plasmide dat HIV-1-stam NL4-3 (Figuur 3B).
Met de cellevensvatbaarheid test het percentage metabolisme van MTT werd bepaald voor cellen die met de meest effectieve siRNAs die in figuur 3B. Gegevens werden genormaliseerd MTT metabolisme in cellen behandeld met het transfectiereagens alleen (Figuur 4). Een lange dubbelstrengs RNA (Poly I: C) verminderde levensvatbaarheid van de cellen; Het effect was slechts significant bij de hoogste dosis geëvalueerd. Geen significante vermindering van levensvatbaarheid van de cellen werd waargenomen voor siRNA gericht op de si 1498 te in HIV-1 RNA, ongeacht hun lengte. Met het immuunsysteem activering assay dezelfde verzameling RNA's werden geëvalueerd op hun vermogen om immune responsen (Figuur 5) te starten. Onder omstandigheden waarin Poly I: C activeren de expressie van P150 ADAR1 en geïnduceerde fosforylatie van PKR en IRF3 kon geen significant effect op het immuunsysteem activatiemarkers geobserveerd op de proef RNAs.
Figuur 1. Schematische voorstelling van pre- en post-integratiestappen in de HIV-1 replicatie cyclus. Pre-integratie (1-3) en post-integratie (4-7) stappen in het HIV-1 replicatie cyclus wordt in geschetst dozen . klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2 "src =" / files / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg "/>
Figuur 2. Schema van virusproductie cellevensvatbaarheid en immuun activatie assays. (A) Plaat hechtende cellen en kweek gedurende 24 uur. Cellen worden uitgeplaat in 24-, 96- respectievelijk 12- putjesplaten in 500, 100 en 1000 ul van celkweekmedia voor virusproductie cellevensvatbaarheid en immuun activatie assays. (B) Bereid transfectie buizen, transfecteren cellen, en cultuur voor 48 uur. Een voorbeeld transfectie plan voor een set van drie-test RNA's (RNA1-3) wordt getoond met de nodige controles. De transfectie procedure wordt ook geïllustreerd. (C) Read-out. De uitlezing voor de virale productie, levensvatbaarheid van de cellen en de activering van het immuunsysteem testen worden geschreven en in detail uitgelegd in de paragrafen 2, 3 en 4, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. </ P>
Figuur 3. Effect van de test siRNA's over HIV-1-productie. (A) Het ontwerpen van siRNA met verschillende lengtes en symmetrieën. Een geconserveerde sequentie van HIV-1 RNA (1498 doelplaats) gebruikt voor symmetrische en asymmetrische siRNAs (si1498-) met verschillende lengtes (17-29 nucleotiden sense strengen) te ontwerpen. De verwachte sense (bovenste, zwart) en antisense (onderste, rood) strengen aangegeven. (B) Remming van HIV-1-productie door si1498 lengtevarianten. Het percentage (%) remming van HIV-1 RT-activiteit in het supernatant van HEK293T-cellen die met symmetrische of asymmetrische si1498 lengtevarianten wordt getoond ten opzichte van een lange Dicer substraat nonsense siRNA (zonden). Elke test RNA werd vergeleken zonden verschillende doses in ten minste twee onafhankelijke transfecties met 2-3 replicaten. De gegevens zijn exprgineel als gemiddelde waarden ± standaard fout middelen (SEM). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 16, auteursrecht American Society for Microbiology. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Effect van si1498 lengtevarianten op cellevensvatbaarheid HEK293T-cellen werden getransfecteerd met poly I:. C 50 en 200 ug / ml (pIC50 en PIC200) en verschillende lengtes en formaten si1498 bij 100 nM. Het% metabolisme van MTT werd bepaald ten opzichte van cellen behandeld met het transfectiereagens alleen (Mock, M) in drie onafhankelijke transfecties met 2-3 replicaten. De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Ongepaarde student t-testen werden gebruikt om te bepalen of de verschillende transfecties significantly (*, P <0,05) verminderde cellevensvatbaarheid ten opzichte van de schijn-getransfecteerde cellen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 16, auteursrecht American Society for Microbiology. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Effect van si1498 lengtevarianten op aangeboren immuunresponsen. HEK293T-cellen werden getransfecteerd met pIC50, PIC200 en verschillende lengtes en formaten si1498 bij 100 nM. Activatie van PKR en TLR3 werden geëvalueerd door het meten gefosforyleerde PKR en IRF3 respectievelijk. Expressie van een interferon gestimuleerde gen (ISG) werd geëvalueerd door meting van de ISG ADAR1 P150 niveaus ten opzichte van de constitutief tot expressie gebrachte variant ADAR1 p110. De expressie van actine werd gebruikt als beladingscontrole. deze figure is gewijzigd ten opzichte van 16, auteursrecht American Society for Microbiology. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van de Buffer / reagens | Samenstelling |
| Viral verstoring cocktail | 60 mM Tris-HCl (van 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 1% NP-40. |
| radioactieve cocktail | 60 mM Tris-HCl (van 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 10 ug / ml Poly (A), 0,33 ug / ml oligo dT. Onmiddellijk toegevoegd voor gebruik: 8 mm dithiothreitol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) en 5 ui [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) Per 500 pl cocktail. |
| Radioactieve / virale verstoring cocktail | 60 mM Tris-HCl (van 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1,04 mM EDTA, 0,1% NP-40, 5 ug / ml Poly (A), 0,16 ug / ml oligo dt. Onmiddellijk vóór gebruik: 8 mM dithiothreïtol (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) en 5 gl [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) per 1 ml cocktail. |
| 2x SSC | 17.53 g NaCl en 8,82 g natriumcitraat - 2H 2 O in 1 LH 2 O. |
| lysisbuffer | 50 mM Tris-HCl (van 1 M Tris-HCl, pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA (0,5 M, pH 8,0), 10% v / v glycerol, 1% v / v NP-40. |
| Ponceau S | 2,5 g Ponceau S en 5 ml azijnzuur in 500 ml H2O |
| TBST 6,05 g Tris, 8,76 g NaCl en 1 ml Tween 20 in 1 LH 2 O. |
Tabel 1:. Componenten van niet-commerciële buffers en reagentia Recepten voor alle niet-commerciële buffers en reagentia zijn aanwezig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De HIV-1-productie-assay beschreven werd uitgevoerd onder toepassing HEK293T-cellen (figuur 2) en is vergelijkbaar met assays gebruikt voor het screenen van HIV-1 RNA doeltreffende ribozym 13, 10,29 shRNA, siRNA 30 en U1i RNA 11,31 doelplaatsen. Verschillende methodes te kwantificeren HIV-1 productie, hebben de meeste studies werd virusproductie 48 uur na cotransfectie van een HIV-1 expressieplasmide met kandidaat-RNAs. Na de productie van HIV-1, onrijpe virionen ondergaan proteolytische splitsing van hun polyproteïnen door HIV-1 protease rijpe virions, kunnen infecteren nieuwe cellen. Voor de HIV-1 RT enzymactiviteitsanalyse in stap 2.2 beschreven. tot 2,5., zowel de productie en rijping stappen worden geëvalueerd, omdat de RT enzym alleen actief in volwassen virionen. Daarentegen kan het capside-eiwit en viraal RNA aanwezig in zowel volwassen en onrijpe virionen zijn. Daarom kwantificeren HIV-1-productie door p24 ELISA of RT-PCR may missen effecten van therapeutische RNAs die op het rijpingstap van de HIV-1 replicatie cyclus, zoals ribozymen die lokaliseren aan HIV-1 virions 32 en antisense gebaseerde moleculen die Gag processing naast HIV-1 eiwitexpressie 13 remmen, 31. Een beperking van virusproductie assays is dat de gebruikte cellen niet de geschikte receptoren voor HIV-1 intrede en expressie kan niet worden gebruikt om de effecten van therapeutische RNA HIV-1 entry of integratie evalueren.
Om de effecten van anti-HIV-1 RNA's op het volledige replicatiecyclus te evalueren, hebben verschillende HIV-1-infectie modellen gebruikt in verschillende T lymfocyt cellijnen of primaire bloedcellen 5,33. Aangezien deze cellijnen zijn moeilijk te transfecteren, meer arbeidsintensieve werkwijzen zoals lentivirale vector geninsertie of aptameer / peptide conjugatie noodzakelijk om voldoende anti-HIV-1 RNA effecten mbt HIV-1 replicatie te leveren. Deze beperking maakt het difficult de structuur-activiteitsrelatie tussen varianten van een bepaald anti-HIV-1 RNA snel vergelijken of uitvoeren grootschalige screening optimale doelplaats identificeren nieuwe klassen van anti-HIV-1 RNA. Terwijl virusproductie assays bruikbaar zijn voor het identificeren van nieuwe anti-HIV-1 RNA-moleculen, alternatieve cellulaire modellen eenvoudig getransfecteerde cellijnen die HIV-1 replicatie te ondersteunen, zoals TZM-bl cellen, bruikbaar voor het screenen zouden anti-HIV-1 RNA targeting andere stappen in de replicatiecyclus, zoals toegang en integratie.
Afhankelijk van de klasse van anti-HIV-1 RNA zijn verschillende mogelijke mechanismen van toxiciteit beschreven. Bijvoorbeeld kunnen antisense-RNA gebaseerde off-target effecten op cellulaire RNA's die dezelfde of een vergelijkbare sequentie van het beoogde doelplaats in HIV-1 RNA. Op dezelfde manier, RNA aptameren, gemodelleerd naar de trans-activering response-element (TAR) of Rev respons element (RRE), kunnen invloed hebben op de functie van de cellulaire proteins, zoals de TAR RNA bindend eiwit (TRBP) 34. shRNAs en siRNA's hebben de extra mogelijkheid om de RNA interferentie weg aantasten doordat sekwestreren RNAi eiwitten 35 en sommige U1i moleculen is aangetoond dat de splitsing en verwerking van cellulaire RNAs beïnvloeden door sekwestreren eiwitten U1 kleine nucleaire RNA-eiwitcomplex 36. Sommige van deze effecten kunnen worden geminimaliseerd door zorgvuldig ontwerp, metingen van cellulaire toxiciteit in schermen voor nieuwe anti-HIV-1 RNA-moleculen zijn bruikbaar bij het uitsluiten van moleculen met potentiële off-doelwit effecten van verdere ontwikkeling. Bovendien kan off-target effecten indirect remmen HIV-1 productie, waardoor cellulaire toxiciteit een belangrijke meting valideren van de werkzaamheid van nieuwe anti-HIV-1-moleculen geïdentificeerd van HIV-1 productie schermen.
De cellevensvatbaarheid-assay beschreven in stap 3.1. 3.4. is een variant van een standaard test die wordt gebruikt om diverse antiviraal molecuul screenen s 37. De test meet de activiteit van NAD (P) H-afhankelijke cellulaire enzymen om de MTT reagens reduceren tot onoplosbare purperen vorm formazan. Het protocol is een bewerking van eerder gepubliceerde werkwijzen en 38 verschillende sets verkrijgbaar via MTT of andere nauw verwante reagentia. Hoewel het belangrijk is om cellevensvatbaarheid in de cellijn gebruikt voor het screenen van anti-HIV-1 RNA testen, moet worden opgemerkt dat verschillende cellijnen variëren in hun gevoeligheid voor RNA-geïnduceerde toxiciteit. Bijvoorbeeld Reynolds et al. Aangetoond dat Dicer substraat siRNA geen effect op cellevensvatbaarheid in HEK293T-cellen, maar aanzienlijk verlaagde levensvatbaarheid van de cellen in MCF7, DU145 en HeLa S3-cellen 39 hadden. Voor de hierin beschreven test, worden HEK293T cellen als voorbeeld (figuur 4); echter, heeft dezelfde test ook uitgevoerd in MCF7 cellen potentiële toxiciteit bij een cellijn die gevoeliger is voor kleine RNA-geïnduceerde toxiciteit 16 evalueren.
e_content "> Aangezien anti-HIV-1 RNA kan niet worden verwerkt en aan het adaptieve immuunsysteem, ze als minder immunogeen in vergelijking met anti-HIV-1 proteïnen of peptiden. Afhankelijk van de sequentie of structuur kunnen aangeboren wekken immuunreacties en diverse immuun sensoren signaalbanen geïdentificeerd die kunnen reageren op kleine RNA (besproken in 40). in de immuunactivering assay beschreven, werden de niveaus van gefosforyleerd PKR en IRF3 vergeleken cellen getransfecteerd met kleine RNA als vermelding van PKR of TLR3 activatie, respectievelijk. Beide RNA sensoren zijn aanwezig in een brede verscheidenheid aan cellijnen en hun activering leidt tot de productie van type 1 interferonen en, in het geval van PKR, een shut-in translatie. evalueren de mogelijkheid van anti-HIV-1 RNA de productie van type 1 interferonen door alternatieve routes te activeren, werden niveaus van de interferon-geïnduceerde gen ADAR1 (P150) eveneens vergeleken in cellen getransfecteerd metanti-HIV-1 RNA. Zoals aangetoond door de effecten van de lange dsRNA positieve controle, Poly I: C, al deze reacties waren actief in HEK293T-cellen (Figuur 5) en soortgelijke effecten werden waargenomen in MCF7 cellen 16. Aangezien deze reacties HIV-1-productie in de afwezigheid van effecten op levensvatbaarheid van de cellen kan remmen, het immuunsysteem activering assay biedt extra controle voor de efficiëntie van nieuwe anti-HIV-1 RNA. Verdere metingen dat deze evaluatie kunnen worden toegevoegd omvatten het meten van de productie van inflammatoire cytokines en type 1 interferonen in celcultuur supernatant, en het meten van de expressie van meer-interferon gestimuleerde genen. Omdat HIV doelcellen zoals CD4 + T-cellen en macrofagen verschillende aangeboren immuunsysteem sensoren kunnen uitdrukken, moeten kandidaten die van de in dit protocol beschreven bepalingen worden beoordeeld op potentiële immune stimulatie in deze celtypen.Voor alle assays beschrijvend, de kritische stap voor het verkrijgen van reproduceerbare nauwkeurige resultaten is de bereiding van het DNA of RNA-transfectie buizen (stap 1,3.). Het plasmide DNA of RNA moet zeer zuiver zijn met concentraties nauwkeurig bepaald. Het is ook kritisch voor de juiste controles omvatten. Voor het evalueren van nieuwe test RNA-expressieplasmiden in de virale productie-test, een passende negatieve controle is het lege expressieplasmide. Voor antisense-gebaseerde RNA, een extra negatieve controle plasmide dat een niet-gericht RNA zijn mogelijk. Sequenties voor een niet-ribozym gericht en shRNA die geen invloed HIV produktie worden voorzien in 13. Bij proef siRNA, de enige negatieve controle die kan worden gebruikt is een niet-gericht RNA en een geschikte niet-gericht siRNA sequentie voor de virusproductie assay wordt in 16. Voor de cellevensvatbaarheid en immuun activatie assays dienen de negatieve controlecellen behandeld met alleen transfectie reagens en het Ciritical dat een positieve controle zoals poly I: C opgenomen om te bevestigen dat de cellen reageren op RNA-geïnduceerde toxiciteit of immuunactivatie. Voor RNA expressieplasmiden moet de lege plasmide zijn mogelijk dat de vector zelf niet met toxische effecten op de cellen.
Kortom, de hierin beschreven assays zijn een goede eerste stap het identificeren van veilige en effectieve therapieën voor RNA in HIV-1 gen of geneesmiddeltherapie. Voor moleculen tegen HIV-1 RNA, is het ook belangrijk om de instandhouding van de doelplaats in HIV-1 circulerende stammen en Methoden overwegen sequentieconservering berekenen zijn eerder gepubliceerd 15. Om een molecuul naar voren in klinische studies te verplaatsen, moet op lange termijn toxiciteit en werkzaamheid studies worden uitgevoerd in primaire menselijke cellen en in diermodellen om te bevestigen dat de geïdentificeerde kandidaten veilig en werkzaam in de kliniek zullen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De hier gepresenteerde werk werd gesteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (verleent DCB-120.266, PPP-133.377 en HBF-348.967 tot AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A.
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M.
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
