Introduction
현재 HIV-1 치료의 한계는 만성적 질환의 진행을 방지하기 위해 투여되어야한다는 것이다. HIV-1에 강한 T 림프구 또는 조혈 줄기 세포 이식, 약물 치료 -1,2-의 부재 HIV-1 복제의 장기간 제어를 제공하는 가능성을 가지며 또한 HIV-1 치료를 달성하기위한 효과적인 방법이 될 수있다 3. HIV-1 복제에 대해 내성 세포를 렌더링하기위한 한 가지 방법은자가 이식 동안 4 감염된 개인의 세포에 항 HIV-1 RNA를 또는 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 삽입하는 것이다. 여러 후보 항 HIV-1 유전자는 단일 유전자에 HIV-1의 저항 현상을 방지하기 위해, 두 개 또는 세 개의 5 (6)의 조합에 일부 진입하여 임상 시험을 고안 하였다.
항 HIV-1 RNA를 인해 면역 반응을 유도하는 그들의 낮은 전위로하고 있기 때문에 결합 유전자 치료에 대한 상위 후보자들이다매우 짧은 유전자 서열로부터 전사된다. 일부 항 HIV-1 RNA를이 바이러스 항목 및 통합을 목표로 설계되었습니다. 그러나, 대부분의 항 HIV-1 RNA를는 바이러스 라이프 사이클 후 통합 단계 (도 1)을 대상. 후 통합 억제제는 리보 자임 (7), shRNA를 8 U1i RNA를 9로는 HIV-1 조절 단백질 문신 또는 계 1, 및 안티센스 기반의 RNA를 대상으로 HIV-1 RNA에 다른 사이트를 대상으로, 미끼 RNA를 포함. 항 HIV-1 RNA를의 효능을 비교하기 위해 사용 된 방법은 유전자 후보 RNA를 코딩하는 바이러스 성 일시적 후보의 RNA를 발현하는 플라스미드로 형질 감염된 세포에서 생산 및 HIV-1 발현 플라스미드를 측정 형질 세포에서 바이러스 복제를 모니터링 포함 10 -13. 우리는 이전에 새로운 리보 자임 대상 사이트 13 ~ 15에 대한 HIV-1 RNA를 선별하는 HIV-1 생산 분석을 사용했다. 이러한 방법은 RNA 인 이후의 포맷을 최적화하기 위해 정제 된간섭은 분자의 shRNA로 플라스미드 DNA로부터 발현 또는 합성 siRNA를 16로 전달. 상기 분석은 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포로부터 성숙 바이러스의 생산을 측정하고 (도 1) HIV-1 복제 사이클 후 통합 단계를 타겟팅 억제제의 효과를 비교하기 위해 사용될 수있다. 사전 통합 단계를 타겟팅 억제제를 들면, TZM-BL 세포 감염 분석 (17)와 같은 다른 분석은 항 바이러스 효능을 평가하기 위해 필요하다.
병원에서 항 HIV-1 RNA를의 전달을위한 주요 안전 문제는 인간의 RNA 또는 단백질과 선천성 면역 센서의 작동에 잠재적 인 오프 대상 효과를 포함한다. 항 HIV-1 siRNA의 독성을 평가하기 위해 다른 세포주 16 세포 생존력 분석을 이용했다. 우리는 또한 이중 가닥 RNA 면역 센서의 활성화를 측정 RNA 활성화 단백질 키나제 R (PKR) 및 수용체 3 (TLR3) 등 수신자뿐 아니라 전인터페론의 Pression의 유전자, ADAR1의 P150을 자극. 이러한 분석은 항 HIV-1 RNA를 효능은 세포 생존 또는 면역 센서의 활성화에 대한 간접적 인 효과에 기인 아니라는 것을 확인하는데 사용될 수있다. 또한 발전에서 잠재적 인 독성과 후보 RNA를 제외 유용하다.
다음 프로토콜에서, 절차는 새로운 치료의 RNA를 확인하고, 기존의 형식을 설명하는 최적화. 방법은 HIV-1 복제의 심사 RNA 기반 후 통합 억제제에 유용과 같은 바이러스 성 RNA 18 CRISPR의 레브 매개 수출을 대상으로 작은 분자와 같은 다른 후 통합 억제제를 화면에 적용 할 수 / 설계 카스 시스템은 통합 대상으로 HIV-1 DNA 19.
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Protocol
1. 세포와 형질
- 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 배양 HEK 293T 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. 세포 배양 배지에서 2 × 105 세포 / ㎖ 현탁액을 준비한다. 의 각 웰에 세포 현탁액의 500, 100 및 1,000 μl를 추가, 24도, 96도, 12 웰 플레이트, 바이러스 생산, 세포 생존 및 면역 활성 분석, 각각 (그림 2A)합니다.
- 부드럽게 플레이트 소용돌이와 5 % CO 2와 37 ° C에서 / O N 그들을 품어. 50~70%의 포화 상태로 세포를 성장.
- 형질 전환 계획에 따르면, 1.5 ml의 마이크로 튜브 (예, 그림 2B)에 테스트 RNA를 자신의 컨트롤의 희석을 준비합니다.
- 바이러스 생산 분석를 들어, HIV-1 발현 플라스미드의 10 NG / μL 희석을 준비하고 각 튜브에 10 μl를 추가합니다. 다음 5 μM 시험의 RNA 희석하여 음성 대조군 RN 준비A. 25 또는 100 nM의 최종 농도에 해당하는 튜브에 각 시험 RNA 및 음성 대조군 희석 2.5 또는 10 μl를 추가합니다.
- C : 세포 생존력 분석을 위해 5 μM 시험의 RNA 희석하고 양성 대조군 RNA, 저 분자량 폴리 I의 10 ㎎ / ㎖의 희석을 준비한다. 각각 100 nm의 또는 200 μg의 / ml의 최종 농도에 해당하는 튜브에 테스트 RNA 또는 양성 대조군 RNA 희석 2 μl를 추가합니다.
- 면역 활성 시험의 경우, 시험 RNA 또는 단계 1.3.2에서 제조 한 양성 대조군 RNA 희석 20 μl를 추가합니다. 각각 100 nm의 또는 200 μg의 / ml의 최종 농도에 해당하는 튜브에.
단계 1.3.1에 대한 ng를 25, 100의 최종 금액을주고, 테스트 RNA 발현 플라스미드를 들어 시험의 RNA의 5 μM 희석 대신에 10 NG / μL 희석을 준비 :합니다. 및 (100)는 단계 1.3.2에 대한 ng를. 및 1.3.3.
- 바이러스 성 자극에 대한 각각의 형질 튜브에 DMEM 50, 25 또는 75 μl를 추가각각 uction, 세포 생존 및 면역 활성 분석. 바이러스 생산 분석법 다음 단계 전에 생물학적 안전 수준 3 (BSL3) 실험실 세포 형질 제조 튜브를 가져온다.
- 트랜 튜브에 형질 전환 시약 순차적으로 2 μl를 추가하고 복합체 형성 할 수 있도록 15 ~ 20 분을 품어. 특정 형질 전환 시약 재료의 표를 참조하는 데 사용합니다.
- 적가 세포 배양 플레이트의 상응하는 위치에 각각의 마이크로 튜브에서 전체 형질 전환 혼합물을 추가한다. 부드럽게 소용돌이와 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 접시를 품어.
- 세포 배양 판 (그림 2C)에서 HIV-1 생산 (섹션 2), 세포 생존 능력 (섹션 3) 및 면역 활성화 (섹션 4)를 측정한다.
2. 바이러스 생산 분석
- 배양기에서 24 웰 세포 배양 플레이트를 제거하고 BSL3 세포 배양 플레이트의 내부 소용돌이 부드럽게후드. A는 HIV-1 생산을 정량화하는 데 사용됩니다 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 잘 대응하는 각 우물에서 뜨는 150 μl를 전송합니다.
주 : 일반 바이러스 정량 분석은 효소 면역 분석법 (ELISA) (20), 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) (21)에 의한 바이러스 RNA를 정량하여 HIV-1 캡시드 단백질 (P24)의 발현을 측정하여 활성을 측정 포함 에이즈-1 RT 효소. 2.2 2.5은 HIV-1 RT 활동 13,15,16를 정량화하는 방법을 설명하는 단계를 반복합니다. - 전송 중단 바이러스 칵테일 15 (표 1) 25 μl를 함유하는 96 웰 플레이트에 웰 대응하는 상등액 5 μL. RT에서 5 분 혼합물을 품어하고 방사능 워크 스테이션에 접시를 전송합니다.
참고 : 2.2 단계. 방사능 워크 스테이션이 BSL3 실험실에서 사용할 수없는 경우에만 필요합니다. 플레이트로부터 제거 할 필요가없는 경우BSL3 실험실, 2.3 단계로 진행합니다. 방사성 칵테일의 25 μL 대신 바이러스 / 방사성 붕괴 칵테일 (표 1) 50 μl를 추가합니다. - 방사성 칵테일 (15) (표 1)를 준비하고, 바이러스 뜨는 및 중단 칵테일의 각 웰에 25 μl를 추가합니다. 2 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- 스팟 5 유리 섬유 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) filtermat 용지에 해당하는 사각형 상 반응 혼합물의 μL 및 관광 명소가 10 분 동안 건조 할 수 있습니다. 두 개의 샘플들이 직접 서로 보더 없도록 다른 모든 사각형 반응 혼합물 스팟. 이 단계 2.6 분 (CPM) 당 수를 결정할 때 샘플 사이의 크로스 오버를 방지하는 데 도움이됩니다.
- 종이 95 % 에탄올이 1 분간 세척 한 다음 염수 배 구연산 나트륨 (SSC) 버퍼 (표 1)을 5 분 동안 5 배 씻는다. 종이 건조 및 샘플 가방을 봉인 할 수 있습니다.
- 클립 샘플 가방 공동카세트에 filtermat 용지를 ntaining 및 마이크로 플레이트 섬광 계수기에 카세트를 삽입합니다. 실험에 사용 [32 P] dTTP를의 일괄 제공 기준 날짜 (32) P에 대한 CPM을 읽고 카운터를 설정합니다. 플레이트지도를 이용하여 판독하고 카운터를 시작하는 샘플을 선택한다.
- 모든 바이러스의 정량 방법, 인접 음성 대조군으로 각각 테스트 RNA에 대해 얻어진 값을 나누어 테스트 RNA를 각 복제에 대한 HIV-1 생산의 억제 백분율을 얻기 위해 (100)에 의해이 값을 곱한다. 다른 농도에서 다른 테스트 RNA를 비교 결과의 일례는도 3에 제공된다.
3. 세포 생존 분석
- / ml의 MTT (3- [4.5 디메틸 -2- 티아 졸릴] -2,5- 디 하이드로 -2H- 테트라 졸륨 브로마이드) 둘 베코 인산염 완충 식염수에 희석 (인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거하고 5 mg의 20 μL를 추가 각 웰에 DPBS). F 번호판을 품어또는 37 ℃에서 3 시간.
- 세제 (1 % NP-40, 이소프로판올 4 mM의 염산)도 각으로 산성화 이소프로판올 150 μl를 추가하고 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어.
- 마이크로 플레이트 분광 광도계에서 570 nm에서 흡광도를 결정합니다.
- 인접 형질 전환 제어에 의해 각각의 샘플에 대해 얻어진 값을 나누어 각각 양성 대조군 및 테스트 RNA에 대한 상대 MTT 대사를 계산한다. 다른 테스트의 RNA와 양성 대조군을 비교 한 결과의 일례는도 4에 제공된다.
4. 면역 활성화 분석
- 인큐베이터에서 12 웰 플레이트를 제거하고 문화 매체를 대기음. 부드럽게 DPBS로 두 번 세포를 씻어 아니라 각 (프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제, 표 1 포함) 차가운 용해 버퍼 (22)의 70 μl를 추가합니다. 얼음에 10 분 동안 접시를 품어.
- 마이크로 튜브에 세포 용 해물을 전송하고 빠른 침지하여 그들을 동결액체 질소에서 튜브. 샘플은 해동 3의 총이 더 동결 해동 사이클을 반복 할 수 있습니다.
- 세포 파편을 펠렛, 4 ° C, 15,700 XG에서 15 분 동안 해물을 원심 분리기. 새로운 마이크로 튜브에 뜨는을 전송하고 쿠마 블루 (브래드 포드) 메소드 (23, 24)를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
- 10 % 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에서 각 샘플로부터의 단백질 75 μg의 해결 이전 25,26 바와 같은 니트로 셀룰로오스 막에 옮긴다.
- 막에 전기 및 전송 후, 증류수에 세척 한 다음 1 분 동안 폰소 s (표 1)에서 막을 배양하여 단백질 밴드를 보여준다. 80, 55 kDa의에서 막을 잘라 가이드로 밴드와 단백질 사다리를 사용합니다.
주의 : 단계 4.4 샘플 16 × 18cm 34 kDa의 아래로 2 겔을 실행할 수 있으며,이 지정된 위치에 막을 잘라 통해 절단되지 쉽다 있도록관심의 밴드. 대안 적으로, 몇몇 겔 막을 절단 피하기 위해 동일한 샘플을 실행할 수있다. - 0.05 % 트윈 20 (TBST, 표 1)를 포함하는 TBS 버퍼로 폰소 s 염색을 세척 할 것. 완전히 막 다루 5 % 무 지방 우유로 TBST를 추가합니다. 1 시간 동안 교반하면서 RT에서 막을 인큐베이션.
- 막 부화 O / N ADAR1 (110 및 150 kDa의) 포스 PKR (62 kDa 이상) 및 포스 IRF3 (47 kDa의)에 대하여 1000 년 1로 희석하고 3 % 소 혈청 알부민 TBST (BSA)과 항체에있어서, 각각 멤브레인의, 상단 중앙과 하단 부분에 대해.
- 멤브레인은 TBST 5 분 동안 5 배 1 시간 동안 (5000 년 1로 희석) 5 % 무 지방 우유와 퍼 옥시 다제 표지 염소 항 - 토끼 보조 항체와 TBST에 품어 씻으십시오.
- TBST 5 분 동안 막 배를 세척하고 제조업체의 지침에 따라 영화에 밴드를 시각화하는 전기 화학 발광 (ECL) 솔루션을 적용 할 수 있습니다.
- 필름의 단백질 밴드를 가시화 한 결과, 항체 박리 용액으로 10 분 동안 멤브레인의 중간 및 하단 부분을 세척한다. 및 IRF3 (500 1) 총 PKR에 대해 3 % BSA와 TBST에서 세포막 O / N 및 항체를 품어 (1,000에서 1에서) 각각 중앙과 하단 부분에 대해. 반복 4.8 단계를 반복합니다. 4.9. PKR 막 (중간)에 대한 항 - 토끼 이차 항체 대신에 퍼 옥시 다제 표지 된 염소 항 - 마우스를 사용.
- TBST 5 분 동안 막 5 배의 바닥 부분을 세척하고 (5000 년 1로 희석) 굴지에 대한 항체와 1 시간 동안 3 % BSA와 TBST에서 막을 품어. 반복 4.8 단계를 반복합니다. 4.9. 항 - 토끼 이차 항체 대신에 퍼 옥시 다제 표지 된 염소 항 - 마우스를 사용. 다른 테스트의 RNA와 양성 대조군을 비교 한 결과의 일례는도 5에 제공된다. 사용되는 특정 항체 물질의 표를 참조.
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Representative Results
절차의 일반적인 개략도 세 시험 RNA를도 2b에 제공되는 제어 RNA위한 예시 형질 계획도 2에 도시되어있다. 바이러스 생산 및 세포 생존 분석을 위해 각 테스트 구조에 대한 판독은 음성 대조군으로 정규화된다. 각 시험 RNA가 인접 대조군에 정상화되도록 복제가 세트로 형질 감염된다. 이것은 예를 들어, 음성 대조군 모두 제 형질, 경우 발생할 수 착화 및 형질 전환 사이의 시간과 관련된 부정확 한 데이터를 피하기 위해 수행된다. HIV-1 면역 반응 27,28 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 생존 및 면역 활성화 검정법은 HIV-1 발현 플라스미드의 첨가없이 수행된다.
HIV-1 RNA의 보존 위치 (위치 1498년에서 1415년까지 타겟팅 간섭 RNA 분자의 최적의 길이를 식별하는HIV-1 균주 NL4-3) (13) (19)는 siRNA의 세트는 (도 3a) 설계되었다. HIV-1 생산 분석을 이용하여, 긴 Dicer에 기판 넌센스 siRNA를 형질 감염된 세포에 비해 RT 활성의 퍼센트 (죄) 발현 플라스미드 100 ng의 함께 공동 형질 상이한 양의 각 테스트 siRNA를 형질 감염된 세포에 대해 계산 된 HIV-1 균주 NL4-3 (그림 3B).
세포 생존력 분석을 이용하여, MTT의 비율 대사는도 3b에서 식별 된 가장 효과적인 siRNA를 형질 세포에 대해 결정 하였다. 데이터는 혼자 형질 전환 시약 (그림 4)로 처리 된 세포에 MTT 신진 대사를 정상화했다. 긴 이중 가닥 RNA (폴리 I : C)는 세포 생존 능력을 감소; 그러나, 그 효과를 평가 높은 투여 량 만 유의 하였다. 세포 생존율의 유의 한 감소는 1498 SI 타겟팅 siRNA가 관찰되지 않았다 에 관계없이 길이의 HIV-1 RNA에 테. 면역 활성 분석을 사용하여 RNA를 동일한 세트의 잠재적 인 면역 반응 (도 5)를 트리거하기 위해 평가 하였다. 폴리 조건 I : C는 ADAR1의 P150의 발현 및 PKR IRF3의 유도 인산화 활성, 면역 활성화 마커에 유의 한 효과가 시험 중의 RNA에 대해 관찰되지 않았다.
에이즈-1 복제주기에서 사전 및 사후 통합 단계의 그림 1. 도식. 사전 통합 (1-3) 및 사후 통합 (4-7)에 HIV-1 복제주기의 단계는 설명 상자에 표시됩니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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바이러스 생산, 세포 생존 및 면역 활성 분석 그림 2. 도식. (A) 플레이트 부착 세포와 24 시간 동안 문화. 세포는 500, 100, 12 웰 플레이트 및 바이러스 생산 세포 생존 및 면역 활성 분석을위한 세포 배양 배지 1,000 ㎕를 각각 24과 96으로 도금된다. (B) 48 시간 동안 형질 튜브, 트랜 세포와 문화를 준비합니다. 세 가지 테스트의 RNA (RNA1-3)의 세트에 대한 예시적인 형질 계획은 적절한 컨트롤을 나타낸다. 형질 전환 방법도 예시된다. (C)는 읽기 아웃. 바이러스 생산, 세포 생존 및 면역 활성화 분석에 대한 판독은 기록 및 섹션 2, 3, 4에 자세히 설명되어 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </ P>
HIV-1 생산에 시험 된 siRNA의 그림 3. 효과. 다른 길이와 대칭으로 된 siRNA의 (A) 디자인. HIV-1 RNA (1498 표적 부위)에 보존 된 시퀀스는 상이한 길이 (17 내지 29 뉴클레오티드의 센스 가닥) 대칭 및 비대칭 된 siRNA (si1498-)를 설계 하였다. 예상되는 의미 (위, 검정) 및 안티센스는 (바닥, 적색) 가닥이 표시됩니다. si1498 길이 변이에 의한 HIV-1 생산 (B) 억제. 대칭 또는 비대칭 si1498 길이 변이체로 형질 HEK293T 세포의 상등액에서 HIV-1 RT 활성의 백분율 (%) 억제 긴 Dicer에 기판 넌센스의 siRNA (죄)에 대해 도시된다. 각 테스트 RNA는이 3 개의 복제 적어도 두 개의 독립적 인 형질 서로 다른 용량의 죄에 비교 하였다. 데이터는 EXPR 있습니다표준 오류 수단 담당자 (SEM) ±로 평균 값을 ESSID와. 이 수치가 16에서 수정 된, 미생물학에 대한 저작권 미국 사회는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
si1498 길이의 그림 4. 효과는 세포 생존에 변형 HEK293T 세포 폴리 I로 형질했다 :. 100 nm에서 si1498의 50 및 200 ㎍ / ㎖의에서 C (PIC50 및 PIC200) 서로 다른 길이와 형식을 지원합니다. MTT의 % 대사는이 3 개의 복제와 3 개의 독립적 인 형질에 혼자 형질 전환 시약 (모의, M)로 처리 된 세포를 기준으로 결정 하였다. 데이터는 평균값 ± SEM과 같이 표현된다. 짝이 학생 t-테스트는 다른 형질의 significantl 여부를 확인하는 데 사용되었다Y (* P <0.05) 모의 형질 세포 감소 세포 생존 능력의 상대적인 위치를 설정합니다. 이 수치가 16에서 수정 된, 미생물학에 대한 저작권 미국 사회는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
si1498 길이의 그림 5. 효과 선천성 면역 반응을에 변형. HEK293T 세포 PIC50, PIC200 다른 길이와 100 nm에서 si1498의 형식으로 형질 감염시켰다. PKR 및 TLR3의 활성화는 각각 인산화 PKR 및 IRF3을 측정함으로써 평가 하였다. 인터페론 자극 유전자 (ISG)의 표현은 구성 적으로 발현 변형 ADAR1의 P110에 상대적인 ISG ADAR1 P150의 농도를 측정함으로써 평가 하였다. 액틴의 발현은 로딩 대조군으로 사용 하였다. 이 figur전자가 16 일부터 수정 된, 미생물학에 대한 저작권 미국 사회는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 / 시약의 이름 | 구성 |
| 바이러스 성 장애 칵테일 | 60 mM의 트리스 -HCl, 75 mM의 KCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 1.04 mM의 EDTA, 1 % NP-40 (1 M 트리스 -HCl, pH를 7.8에서). |
| 방사성 칵테일 | 60 mM의 트리스 -HCl, 75 mM의 KCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 1.04 mM의 EDTA, 10 μg의 / ㎖의 폴리 (A), 0.33 μg의 / ㎖ 올리고 DT (1 M 트리스 -HCl, pH를 7.8에서). 사용하기 전에 즉시 추가 : 8 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) 5 μL [32 P] dTTP를 (3,000 CI / 밀리몰) 칵테일 각 500 μL합니다. |
| 방사성 / 바이러스 중단 칵테일 | 60 mM의 트리스 -HCl, 75 mM의 KCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 1.04 mM의 EDTA, 0.1 % NP-40, 5 μg의 / ㎖의 폴리 (A), 0.16 μg의 / ml의 올리고 (1 M 트리스 -HCl, pH를 7.8에서) DT. 사용하기 전에 즉시 추가 : 8 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) 칵테일 각각 1 ml의 5 μL [32 P] dTTP를 (3000 CI / mmol)을 첨가 하였다. |
| 배 SSC | 17.53 g의 NaCl 및 8.82 g 구연산 나트륨 - 2H 2 O 1 LH 2 O.에서 |
| 용해 완충액 | 50 mM 트리스 - 염산, 150 mM의 NaCl을, 5 mM의 EDTA (1 M 트리스 - 염산, pH 7.4의에서), 10 % v / V를 글리세롤, 1 % v / V를 (0.5 M, pH가 8.0에서) NP-40. |
| 폰소 s | 500㎖의 H 2 O 2.5 g 폰소 s, 5 ml의 아세트산 |
| TBST 6.05 g 트리스, 8.76 g의 NaCl 및 1 ㎖의 트윈 20 일 LH 2 O.에서 |
표 1 :. 비상업적 버퍼 및 시약의 구성 요소가 아닌 모든 상업 버퍼 및 시약에 대한 조리법이 제공됩니다.
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Discussion
기재된 HIV-1 생산 분석법 HEK293T 셀들 (도 2)를 이용하여 수행하고, 효과적인 리보 자임 (13) shRNA를 10,29, siRNA를 30 및 U1i RNA 11,31 표적 부위를 HIV-1 RNA를 선별하는 데 사용되는 분석 비슷 하였다. HIV-1 생성을 정량화하기 위해 다양한 방법을 사용하여, 대부분의 연구는 후보의 RNA와 HIV-1 발현 플라스미드의 공동 형질 감염 후 바이러스 생산을 48 시간으로 측정했다. HIV-1의 제조 이후, 미성숙 비리 새로운 세포를 감염시킬 성숙한 비리,되기 위해 HIV-1 프로테아제하여 polyproteins의 단백질 분해 절단을 겪는다. 단계 2.2에 기재된 HIV-1 RT 효소 활성 분석 용. 역전사 효소 성숙 비리 만 활성화되어 있기 때문에 2.5., 생산과 성숙의 단계를 모두 평가된다. 반대로, 캡시드 단백질 및 바이러스 RNA 모두 성숙 및 미성숙 비리에 존재할 수있다. 따라서, P24 ELISA 또는 RT-PCR m에 의해 HIV-1 생산을 정량화AY, HIV-1 비리 온 (32) 및 HIV-1 단백질 발현 (13)에 더하여 개그 처리를 억제하는 안티센스 기반 분자 지역화 같은 리보 자임과 같은 HIV-1 복제주기의 성숙 단계에 작용하는 치료제의 RNA의 효과를 놓치지 31. 바이러스 생산의 분석 한계는 사용되는 세포는 HIV-1 항목에 해당 수용체를 발현하지 않으며, HIV-1 항목 또는 RNA를 통합에 대한 치료 효과를 평가하기 위해 사용될 수 없다는 것이다.
전체 복제 사이클 항 HIV-1 RNA를 효과를 평가하기 위하여, 다양한 HIV-1 감염 모델은 서로 다른 T 림프구 세포주 또는 일차 혈액 세포 5,33에 사용되어왔다. 이들 세포주는 형질 곤란하기 때문에, 이러한 렌티 바이러스 벡터의 유전자 삽입 또는 앱 타머 / 펩티드 결합으로서 더욱 노동 집약적 인 방법은 HIV-1 복제에 대한 효과를 관찰하는 항 HIV-1 RNA를 충분한 양을 제공하는 것이 필요하다. 이 제한은 디한다급속 특히 항 HIV-1 RNA의 변형의 구조 - 활성 관계를 비교 또는 항 HIV-1 RNA는 새로운 클래스의 최적 목표 부위를 식별하기 위해 대규모 스크리닝을 수행 할 fficult. 바이러스 생산 분석법은 TZM-BL 세포로서 HIV-1 복제를 지원 쉽게 형질 감염된 세포주의 새로운 항 HIV-1 RNA 분자, 다른 세포 모델을 식별하기위한 유용한되었지만, 스크리닝에 유용 할 것이다 항 HIV-1 이러한 항목 및 통합으로 복제주기의 다른 단계를 대상으로 RNA를.
항 HIV-1 RNA의 종류에 따라 여러 가지 잠재적 독성 메커니즘 설명되었다. 예를 들어, 안티센스 RNA를 기반은 HIV-1 RNA의 의도 된 표적 부위는 동일하거나 유사한 서열을 포함하는 RNA를 세포에 오프 - 타겟 효과를 가질 수있다. 마찬가지로, RNA 앱 타머의은 트랜스 - 활성화 반응 요소 (TAR) 계 또는 반응 요소 (RRE) 본뜬 세포 (PR)의 기능에 영향을 미칠 수있는예 TAR RNA 결합 단백질 (TRBP) 34 oteins. shRNA를 및 siRNA를 36 복잡 U1 작은 핵 RNA 단백질의 단백질을 침적하여 세포의 RNA의 스 플라이 싱 처리에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 침적의 RNAi 단백질 35 일부 U1i 분자하여 RNA 간섭 경로에 영향을 미칠 수있는 부가 가능성이있다. 이러한 효과의 일부는 조심 디자인을 최소화 할 수 있지만, 새로운 항 HIV-1 RNA 분자에 대한 스크린에서 세포 독성의 측정은 발전에서 잠재적 인 오프 대상 효과와 분자를 제외하고 유용하다. 또한, 오프 - 타겟 효과를 간접적으로 HIV-1 생산의 화면에서 확인 된 새로운 항 HIV-1 분자의 효능 검증에 세포 독성을 중요한 측정을, HIV-1 생성을 억제 할 수있다.
생존율 분석은 단계 3.1에서 기술. 3.4. 다양한 바이러스 분자를 선별하는 데 사용 된 표준 분석의 변형입니다 37이야. 상기 분석은 포르 마잔 그 불용성 퍼플 형태에 MTT 시약을 감소 (P) H-NAD 의존성 세포 효소의 활성을 측정한다. 이 프로토콜은 이전에 발행 된 방법 (38)에서 적응하고 여러 키트는 MTT 또는 다른 밀접하게 관련된 시약을 사용하여 사용할 수 있습니다. 이 항 HIV-1 RNA를 선별에 사용되는 세포주에서 세포 생존 능력을 분석하는 것이 중요하지만, 다른 세포주는 RNA 유도 된 독성에 대한 그들의 감도 변화 있음에 유의해야한다. 예를 들어, 레이놀즈 등 알. Dicer에 기판 된 siRNA는 MCF7, DU145 및 된 HeLa S3 세포 (39)에는 HEK293T 세포에서 세포 생존에 대한 효과가 있지만, 크게 감소 된 세포 생존 없었다는 것을 보여 주었다. 본원에 기재된 분석을 위해, HEK293T 세포는 예를 들어 (도 4)로서 사용된다; 그러나, 동일한 분석은 또한 작은 RNA 유도 독성 (16)에 더 민감 세포주 잠재적 독성을 평가 MCF7 세포에서 수행되었다.
항 HIV-1 RNA는 이후 e_content는 "> 처리 및 항 HIV-1 단백질 또는 펩티드에 비하여 이들은 덜 면역 원성이 고려 적응 면역 시스템에 제공 할 수 없다. 그러나, 그들의 서열 또는 구조에 따라, 그들은 선천적 유도 할 면역 반응, 그리고 여러 면역 센서 및 신호 전달 경로가 여기에 설명 된 면역 활성 분석에서. (40에서 검토) 작은 RNA를에 응답 할 수 확인 된, 인산화 PKR과 IRF3의 수준은 작은 RNA를 형질 세포에서 비교 하였다 PKR 또는 TLR3 활성화의 표시, 각각. 두 RNA 센서 세포주의 넓은 범위에서 존재하고 그 활성화 PKR, 번역 셧 다운의 경우, 타입 1 인터페론의 생성을 유도하고있다.보고자 항 HIV-1 RNA를위한 전위 경로는 다른 타입 1 인터페론의 생성을 활성화, 인터페론 자극 유전자 ADAR1 (P150)의 레벨은 또한 형질 세포에서 비교 하였다항 HIV-1 RNA를. 긴 dsRNA를 양성 대조군의 효과에 의해 입증 된 바와 같이, 폴리 I : C, 이러한 모든 응답 (그림 5) HEK293T 세포에서 활성화되었던 유사한 효과를 MCF7 세포 (16)에서 관찰되었다. 이러한 반응은 세포 생존에 영향이없는 HIV-1 생성을 억제 할 수 있기 때문에, 면역 활성 분석은 새로운 항 HIV-1 RNA를의 효능에 대한 추가 검증을 제공합니다. 이 평가에 첨가 될 수있는 또 측정은 염증성 사이토 카인의 생산을 측정하고, 세포 배양 상등액 1 인터페론을 입력보다 인터페론 자극 유전자 발현을 측정하는 것을 포함한다. 예컨대 CD4 + T 세포 및 대 식세포와 같은 HIV 표적 세포는 선천성 면역 센서의 상이한 레벨을 표현할 수 있으므로,이 프로토콜에 기재된 분석에서 확인 된 후보 이러한 세포 유형의 잠재적 면역 자극에 대해 평가한다.분석법의 모든 기술에 대한D는 재현하고 정확한 결과를 얻기위한 중요한 단계는 DNA 또는 RNA 형질 튜브의 제조 방법이다 (130 단계).. 농도를 정확하게 측정하여 플라스미드 DNA 또는 RNA 고순도이어야한다. 또한, 적절한 컨트롤을 포함하는 것이 중요하다. 바이러스 생산 분석에서 새로운 테스트 RNA의 발현 플라스미드를 평가하기위한 적절한 대조군 빈 발현 플라스미드이다. 안티센스 RNA를 기반 들어, 비 표적 RNA 발현 추가적인 대조군 플라스미드를 또한 포함한다. HIV의 생산에 영향을 미치지 않는 비 - 타겟팅 리보 자임 서열의 shRNA 및 13에 제공된다. 테스트 siRNA를 들어, 사용할 수있는 유일한 음성 대조군은 비 표적 RNA 및도 16에서 제공되는 바이러스 생산을 분석하기위한 적절한 비 - 타겟팅 된 siRNA 서열이다. 세포 생존율과 활성 면역 분석법, 음성 대조군은 세포 단독으로 형질 감염 시약으로 처리하고는 c되어야C 세포가 RNA에 의한 독성 또는 면역 활성화에 응답임을 확인 포함되어 폴리 나는 같은 양의 제어가 있음을 ritical. RNA의 발현 플라스미드를 들어, 빈 플라스미드는 벡터 자체가 세포 독성을 갖지 않는 것을 보장하기 위해 포함되어야한다.
전반적으로, 여기에 기술 된 분석은 HIV-1 유전자 또는 약물 치료에 사용하기에 안전하고 효과적인 RNA 치료의 식별을 향해 좋은 첫 번째 단계를 나타냅니다. HIV-1 RNA를 표적 분자를 들면, 이전 15 게시 된 시퀀스 보전을 계산하는 HIV-1 균주 순환 상세한 방법에서의 목표 부위의 보전을 고려하는 것도 중요하다. 임상 시험에 앞으로 분자를 이동하려면 장기 독성과 효능 연구가 확인 된 후보자 안전하고 병원에서 효과가있을 것입니다 확인하는 기본 인간 세포 및 동물 모델에서 수행해야합니다.
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Acknowledgments
여기에 제시된 작품은 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다 (DCB-120266, PPP-133377와 AG에 HBF-348967을 부여).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
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