Summary
Este manuscrito descreve um procedimento para controlar a remodelação do cerebrovasculature durante amyloid acúmulo de placa in vivo utilizando microscopia de dois fótons longitudinal. Uma preparação crânio-diluídos permite a visualização de corantes fluorescentes para avaliar a progressão do dano vascular cerebral num modelo de rato da doença de Alzheimer.
Abstract
Remodelação da vasculatura cerebral é uma característica comum de patologias cerebrais. In vivo técnicas de imagem são fundamentais para detectar plasticidade vascular cerebral ou danos ocorridos horas extras e em relação à atividade neuronal ou fluxo sanguíneo. Em microscopia de dois fotões vivo permite o estudo da plasticidade estrutural e funcional de grandes unidades celulares no cérebro vivo. Em particular, a preparação janela crânio-diluídos permite a visualização de regiões corticais de interesse (ROI) sem induzir inflamação significativa cérebro. sessões de imagem repetitivas de ROI cortical são viáveis, proporcionando a caracterização das características da doença ao longo do tempo durante a progressão de muitas doenças do SNC. Esta técnica de acesso as estruturas piais a cerca de 250 uM do cérebro se baseia na detecção de sondas fluorescentes codificados pelos marcadores celulares genética e / ou corantes vitais. Este último (por exemplo, dextranos fluorescentes) são utilizados para mapear o Luminai compartimento de estruturas vasculares cerebrais. Pertinente para o protocolo aqui descrita é a utilização de um marcador in vivo dos depósitos amilóides, metoxi-O4, para avaliar a progressão da doença de Alzheimer (AD). Descrevemos também o processamento de imagem pós-aquisição usado para rastrear alterações vasculares e depoimentos amilóides. Ao focalizar presentemente em um modelo de AD, o protocolo descrito é relevante para outras perturbações do SNC onde ocorrem alterações cerebrovasculares patológicas.
Introduction
A vasculatura cerebral é uma estrutura multi-celular, que está anatomicamente e funcionalmente acoplado a neurónios. A remodelação dinâmica de vasos ocorre durante o desenvolvimento do cérebro e durante a progressão de patologias do sistema nervoso central (SNC) 1,2. É amplamente aceito que o dano vascular cerebral é uma característica de várias doenças do SNC, incluindo a epilepsia, a doença de Alzheimer (AD), lesão cerebral traumática e encefalite 3,4. Portanto, o rastreamento de alterações vasculares cerebrais in vivo se torna significativa quando modelar doenças do SNC, desde o início e em fases crônicas. Como modificações vasculares cerebrais ocorrem frequentemente concomitantemente com lesão neuronal ou plasticidade, a imagem latente da neuro-vascular representa um ponto de entrada chave para decifrar CNS doença fisiopatologia.
Este protocolo descreve um procedimento baseado no de dois fotões longitudinal para controlar a remodelação do cerebrovasculature num modelo de ratinho deAD, uma patologia progressiva marcada por defeitos cerebrovasculares em grandes e pequenos vasos de calibre devido à deposição de placas amiloidog�ico 5-7. Este procedimento permite a visualização de depósitos amilóides e seguimento da sua posição e de crescimento em relação a remodelação neurovascular ao longo do curso da doença. Corantes fluorescentes vitais são injectados antes de cada sessão de imagem para a visualização dos cerebrovasculature e placas amilóides em camundongos transgênicos AD 8. Sessões de imagem repetidas de um ROI através de uma janela crânio transcraniana diluído é não-invasivo e o método de escolha para avaliar remodelação neurovascular no cérebro do rato de estar 2,5,9,10.
O procedimento abaixo descreve o protocolo cirúrgico, aquisição e processamento de imagem. A progressão precoce de angiopatia amilóide cerebral (CAA), principalmente em geral leptomeníngea e arteríolas penetrantes é caracterizado.
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Protocol
Ratos têm acesso ad libitum a alimentos, água, e mantidos em um ciclo claro-escuro de 12 h. Todos os procedimentos envolvendo animais de laboratório conformes com as leis nacionais e europeias e foram aprovados pelo Ministério francês da Educação e Investigação Científica (CEEA-LR-00651-01). Um total de 6 transgénico 5xFAD e ratinhos de controlo da mesma ninhada de tipo selvagem 4 (WT) foram utilizadas para este procedimento.
Preparação 1. Pré-operatório
- Intraperitonealmente (IP) injectar Metoxi-X04 (10 mg / kg) 48 horas antes da cirurgia para rotular depósitos de Ap 11.
- Preparar fluido estéril artificial cerebrospinal (aCSF) (120 mM de NaCl, 26,2 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1 mM de NaH 2 PO 4, MgCl2 1,3, 10 mM de glucose; bolha com 95% de O2 / 5% de CO 2 antes adição de 2,5 mM de CaCl2).
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos (tesouras, pinças, lâmina de barbear e bit de broca), utilizando um autoclave ou esterilizador talão quente antes assépticacirurgia.
- Limpe a bancada e microscópio placa cirúrgica com 70% de etanol e cubra com um pano absorvente limpo.
- Injectar cetamina / xilazina (75 mg / kg e 10 mg / kg, respectivamente) e o cetoprofeno analgésico (2,5 mg / kg) de IP.
- Verifique o nível adequado de anestesia com a pata ou cauda beliscões.
- Aplicar pomada oftálmica estéril para os olhos e raspar a pele (nariz para os ouvidos), evitando os bigodes. Um creme depilatório pode ser utilizado, desde que ele é seguido de lavagem cuidadosa com água para evitar a irritação da pele. Raspar a pele restante com uma lâmina de barbear. Esterilizar a pele com solução anti-séptica povidona-iodo.
- Posicione o mouse sob o microscópio binocular e fazer uma incisão na pele das orelhas ao nariz. Puxar a pele lateralmente para expor o crânio. Inciso o periósteo e repetidamente lavar o crânio com aCSF estéril para parar possíveis sangramentos.
2. Vasculature Labeling e crânio afinadoPreparação janela (40 min)
- Remova a pomada com uma ponta de algodão. Aplicar uma gota de anestésico oftálmica tópica (tetracaína 1%) e suavemente pressionar a pele em torno da órbita do olho para conseguir saliência.
- Injectar isotiocianato de fluoresceina (FITC), conjugada com dextrano (70 kDa) (100 mg / kg ou 50 ul de uma solução a 50 mg / ml; agulha hipodérmica de insulina) no seio retro-orbital, seguindo o procedimento descrito por Yardeni e colegas 12. Aplicar pomada oftálmica estéril para os olhos.
- Certifique-se de que a pele é retraída e o crânio está limpa e seca ao redor da área de imagem selecionada. Aplique uma pequena quantidade de cola cianoacrílico em torno da janela da cabeça dispositivo de montagem (composto de lâminas de barbear empilhados, veja a Figura 1), e cola em torno da região do alvo aplicando uma leve pressão durante vários segundos 10.
- Puxar as extremidades da pele para a borda da janela da cabeça do dispositivo de montagem, tornando-se a área estáseco. Fixar a pele e o bordo da janela com uma pequena quantidade de cola de grau veterinária cianoacrílico e esperar até que seco (Figura 1).
- Garantir o animal na fase de utilização do dispositivo cabeça-mount. Enxágüe com aCSF estéril e garantir que o bem entre a pele eo dispositivo de cabeça de montagem está perfeitamente selado. Enrole o mouse em um cobertor de sobrevivência para manutenção da temperatura.
- Execute afinamento do crânio em solução aCSF como descrito anteriormente 10. Note-se que o couro cabeludo não é completamente removido. Regularmente mudar o aCSF para limpar detritos de osso e para evitar o sobreaquecimento do tecido. Qualquer detritos de osso remanescente pode ser removido com sopros de ar breves. A solução aCSF também atenua vibrações criadas pela perfuração.
NOTA: A espessura do crânio rato varia entre 80 a 150 um, dependendo da idade do animal e da região de interesse. - Usando uma broca de dentista (em velocidade média e uma rebarba 0,7 mm) iniciar desbaste a superfície do crânio em uma área 1.0 mm de diâmetro usando um regular movimento vertical paralelo ao crânio e remover (40 primeiro - 70 uM) a maior parte do osso esponjoso. lembre-se de substituir aCSF a cada 20-30 segundos e limitar a perfuração ininterrupto aos 3-4 seg. Observe que o osso perto de suturas é altamente vascularizado. Aplicar aCSF pr�embebidas gelfoam para parar eventual sangramento.
- Use uma lâmina de microcirurgia oftálmica descartável afiada para continuar com o afinamento do crânio, tomando cuidado para não aplicar pressão excessiva. A região final é de cerca de 0,5 mm de diâmetro e com uma espessura de 20 - 35 um.
NOTA: Devido a rebrota óssea e cicatrização, é necessário ainda mais fina da janela, em cada sessão de imagem.
3. Dois fótons Microscopia (45 min)
- Se necessário, injectar com 19 mg / kg de cetamina para manter a anestesia adequada.
- Transferir o rato (fixo para a fase Headmount) sob o microscópio de laser de dois fotões. Usando uma imersão obj 20X de águaective com uma abertura numérica de 1,0, localizar a janela craniana mais fina no centro do campo óptico usando a lâmpada de epi-fluorescência. Assegurar que o objectivo é sempre imerso em aCSF.
- Iniciar a digitalização a laser com um modo bloqueado laser pulsado (Ti-Safira 680-1040nm). Definir comprimento de onda de excitação a 750 nm para detectar a fluorescência emitida da metoxi-xO4 e FITC-dextrano nos canais de azul e verde, respectivamente.
NOTA: O microscópio tem dois divisores de feixe em 506 nm e 555 nm. A luz azul é capturada por um detector NDD equipado com um filtro de 470 nm ± 12. luz verde é capturada por um detector de GaAsP alta sensibilidade equipado com um filtro de 525 nm ± 25. A máxima potência do laser emitido do objectivo não deve exceder 10 mW para evitar danos nos tecidos induzida por laser. - Adquirir uma pilha baixa ampliação (500 mm x 500 mm, 512 x 512 pixels; 2 um passo) a um zoom numérica 0.7X para criar um mapa 3D para a relocalização precisa do ROIem pontos de tempo posteriores.
- Adquirir um mosaico de 4 imagens de alta ampliação digital com um zoom numérica 2X (200 mm x 200 mm, 512 x 512 pixels; 1 mm etapa). Utilizando o software de imagem mover a janela em 200 uM passos para capturar todas as regiões. Profundidade de pilhas é, tipicamente, de 250 um, a partir da superfície pial em cada imagem do mosaico.
- Antes de retirar o mouse do microscópio, tirar uma foto ou fazer um mapa desenhado à mão 2D da vasculatura pial para o futuro relocalização do campo de imagem.
4. Recuperação e Re-imaging
- Remova o dispositivo de cabeça de montagem através da aplicação de tração, mantendo o crânio por baixo. Se qualquer cola permanece ligado ao crânio ou pele, raspar-lo cuidadosamente com uma pinça fina. Suturar o couro cabeludo e coloque o rato em uma gaiola aquecida para monitorar a recuperação da anestesia antes de voltar para a jaula casa. Aplicar creme antibiótico tópico para o fio de sutura e injectar cetoprofeno (2,5 mg / kg) IP Os seguintes 2 dias.
- Repita os passos de 1,1-2,5 para as sessões de imagem repetidos. Se necessário, raspar o osso com uma lâmina microcirúrgica para garantir a qualidade óptima da imagem.
NOTA: afinamento adicionais com a broca dental pode ser necessária quando o intervalo entre as sessões de imagem é superior a um mês. - Colocar o rato sob o microscópio de epifluorescência usando a luz de acordo com o mapa 2D da vasculatura pial feita a partir da sessão anterior (passo 3.6).
- Iniciar a digitalização a laser de dois fótons e ajustar palco microscópio para atingir o alinhamento na escala micrométrica utilizando o mapa 3D obtida no passo 3.4. Avance para imagens detalhadas como descrito no passo 3.5.
5. Pós-aquisição tridimensional Reconstrução e Análise de Imagem
- Obter reconstruções tridimensionais da vasculatura e os depoimentos de amilóide usando a imagem de software de análise 3D, como Imaris (versão utilizada 8.0 e 7.7.2). Use o plug-in Camada Normalizar no menu de processamento de imagem e contraste submenu mudança para obter contraste ideal dos dois canais em toda a profundidade da pilha de imagem.
- Abrir as imagens com a mesma região em todos os pontos de tempo em simultâneo e sempre processá-los em paralelo, a fim de comparar os diferentes pontos de tempo.
- vasos de rastreio utilizando o módulo rastreador filamento.
- Clique no ícone de filamentos para criar um novo filamento, ignorar o marcador automático e escolha o método de auto-path.
- Certifique-se o canal selecionado corresponde à imagem vascular e usando a função de seleção do ponteiro, clique em uma bifurcação do vaso que é conservada entre as sessões de imagem, mantendo as teclas Shift + controle para determinar um ponto de partida. Use a função de selecção do ponteiro e clique mantendo a tecla shift para selecionar os pontos finais dos filamentos.
NOTA: Comparação da obtiesqueletos NED vai mostrar as mudanças estruturais da vasculatura.
- Execute avião por análise de avião para rastrear novas placas. Aplicar módulo de superfície para o canal de azul para acompanhar o crescimento das placas de Ap. Clique no ícone da superfície para criar uma nova superfície e prosseguir com a criação de superfície automatizado. Usar o método de limiar para definir e subtrair o sinal de fundo. O menu de estatísticas fornece dados relativamente à superfície de depósitos amilóides individuais.
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Representative Results
Este protocolo descreve um método para a visualização do cerebrovasculature e depósitos amilóides de horas extras. Corantes fluorescentes foram injectados para rotular deposição amilóide (metoxi-xO4 11) e para encher o lúmen vascular cerebral (FITC-dextrano) 1. módulos de software de análise de imagem em 3D foram usadas para criar imagens em 3D de um campo constante de vista capturado em pontos de tempo consecutivos. Imagens representativas obtidas no córtex somatossensorial de 5XFAD ratos 5 (modelo genético de AD) mostram que os depósitos mais de Ap aparecem entre 3 e 4 meses de idade, crescendo no parênquima (Figura 2) e os vasos em torno de penetrantes (Figura 3). Deposição de placas ocorre simultaneamente com uma remodelação significativa e oclusão ocasional do cerebrovasculature vizinha (Figura 2). Apenas foram observados casos raros de redução do tamanho da placa, o que indica que este é um processo de uma chapa ccumulation. As Figuras 2 e 3 ilustram que a carga amiloidogénico na parênquima e em torno de vasos está associada à angiogénese e oclusão vascular no córtex somatossensorial. A relação entre placas amilóides vasculares e oclusão do vaso permanece incerto, uma vez que as placas mais vasculares acumulada em grandes artérias penetrantes, enquanto oclusão ocorreu principalmente em vasos de pequeno calibre.
Figura 1. Configuração Experimental. Configuração (A) Head; Stage é personalizado feito. Dispositivo de cabeça de montagem consiste de lâminas de barbear empilhados construídos como descrito anteriormente 10. (B) Vista do rato bloqueado na cabeça dispositivo de montagem. (C) vista do dispositivo e a pele colado ao crânio. As bordas são centrada na região de destino.s / ftp_upload / 54796 / 54796fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Comparação de duas imagens reconstruídas da microcirculação e amilóide Depoimentos em um tapete 5xFAD em 4 e 5 meses de idade. placas amilóides são indicados com um asterisco branco, novas placas que aparecem em 5 meses são indicadas por asteriscos amarelos. Um raro exemplo de redução da placa é indicada com um asterisco laranja microvasos recém-formados são indicados com uma seta amarela, enquanto oclusão vascular é indicado com uma seta vermelha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. grandes e de pequeno calibre Vessels no córtex somatossensorial em 3, 4 e 5 meses de idade. (A) O crescimento dos depósitos amilóides vasculares em vasos de grande calibre (asteriscos brancos). Placas (B) amilóides também pode ser observado em vasos de pequeno calibre (asteriscos amarelos). As setas vermelhas indicam vasos obstruídos. Branco asteriscos indicam crescimento placas amilóides. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A técnica de crânio aberto para in vivo de microscopia de dois fótons oferece a vantagem de sessões de imagem ilimitadas de grandes campos de imagem 13,14. No entanto, esta técnica também produz uma inflamação na região de interesse 14, muitas vezes incompatíveis ou impactando neuro-vasculares leitura saídas 15. Pelo contrário, a técnica crânio transcraniana diluído não resulta em neuro-inflamação, permitindo imagem fiável das estruturas vasculares cerebrais e a acumulação de placa 10,14. Uma segunda vantagem apresentada por esta técnica é que a taxa de sucesso da janela diluído-crânio pode chegar a até 80% a 90% para um manipulador experiente. Um grande revés para o sucesso é a falta de apreciação da espessura do osso, levando ao afinamento excessivo e fratura final; experiência e excelente óptica do microscópio binocular irá limitar este problema. Uma série de limitações afetam esta técnica entanto. Em primeiro lugar, a profundidade da imagem é co limitadampared aos procedimentos de crânio aberto. Em segundo lugar, ao longo do tempo, o tecido cicatricial que se sobrepõe ao osso podem diminuir a qualidade da imagem transcraniana. Em terceiro lugar, é difícil proceder a mais de 4 sessões de imagem, dado que o crânio tem de ser diluído um pouco mais em cada sessão. Por conseguinte, é importante para determinar o número de sessões de imagem no início de uma experiência, de modo a optimizar o incremento entre sessões de desbaste. Alternativamente, uma janela transcraniana crónica que consiste em uma preparação crânio-diluídos coladas com uma lamela foi anteriormente descrito para limitar o crescimento de tecido ósseo ao longo do tempo 16. Embora eficiente, descobrimos que esta técnica só atrasou rebrota óssea por várias semanas, eventualmente, interferir com a qualidade, profundidade e resolução subcelular de imagens quando re-imaging após longos períodos de tempo (Margarita, Arango-Lievano e Freddy Jeanneteau, dados não publicados). Apesar de suas limitações, de dois fótons microsc transcranianaopy preparações através do crânio desbastados repetidos é um método de escolha para rastrear marcadores fluorescentes em modelos de doenças crónicas em que ocorrem alterações neuro-vasculares e inflamação.
Uma diluição óptima do crânio representa um passo importante técnica, como a pressão aplicada ao osso devem ser minimizados a fim de evitar o sangramento e para assegurar uma janela crânio plana. Sangramento e uma janela crânio irregular pode facilitar a cicatrização e o novo crescimento irregular do osso. adelgaçamento excessivo durante a primeira sessão de imagens, após a perfuração sobreaquecimento excessivo, danos ou a laser também pode comprometer a clareza do sinal através da janela do crânio. Estes últimos problemas podem ser controlados fazendo variar periodicamente a forma aCSF durante a perfuração, o arrefecimento da preparação, a perfuração de forma intermitente, e usando ferramentas afiadas limpas quando o polimento do osso. passos críticos adicionais incluem a (i) fixação do crânio para o suporte de cabeças placa para reduzir o movimento associada com a respiração, (ii) reto-orbital injeção e visibilidade confiável de todos os navios, (iii) o mapeamento da região de interesse para relocalização futuro, e (iv) o pré, per e pós-operatório entre as sessões de imagem.
A metodologia aqui resumido permite estudos para avaliar a eficácia e segurança de medicamentos para o SNC de segmentação de estruturas neuro-vasculares, por exemplo, moléculas de reduzir ou prevenir a deposição de amiloide no parênquima cerebral e nas embarcações. Além disso, a microscopia de dois fotões longitudinal do cérebro vivo permite o acompanhamento da amiloidogese e o seu impacto no neurovasculature nas fases iniciais da AD, antes do início da deterioração cognitiva. Falta de apuramento de grandes placas amilóides pode ter efeitos deletérios sobre a vasculatura cerebral, agravando doenças fisiopatologia 17. O advento de novos corantes vitais fluorescentes para rotular corpos de Lewy, synucleopathy, agregados prião, agregados huntingtina, apoiar futuro attainability de neurovasculature REMODeling estudos durante a progressão de outros distúrbios neurodegenerativos 18. Esta técnica é uma adaptação de várias estirpes de ratinho que combinam corantes (SR101, metoxi-X04, dextranos, lectinas) e marcadores genéticos (thy1YFP, CX3CR1-GFP, NG2-DsRed) para investigar interacções celulares in vivo e em modelos em que a estrutura e função experimentais do neurovasculature desvia da fisiologia normal.
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Disclosures
Autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o Ligue Française contre l'épilepsie (a MA-L), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Grant AVENIR R12087FS (a FJ), conceder pela Universidade de Montpellier (a FJ) e Grant da Federação pour la Recherche sur le Cerveau (NM). Nós reconhecemos a assistência técnica do Chrystel Lafont no IPAM na instalação de plataforma central imagem in vivo de Montpellier. Agradecemos também a Mary Vernov (Weill Cornell Medical College) pela revisão do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxy-X04 | tocris | 4920 | use 10 mg/kg |
| FITC-Dextran 70 Kda | sigma | 46945 | use 100 mg/kg |
| gelfoam/Bloxang | Bausch and Lomb | ||
| micorsurgical blade | surgistar | 6900 | must be sharp and not dented |
| povidone-iodine | betadine | antisceptic solution | |
| binocular stereomicroscope | olympus | SX10 | optimal image contrast is crucial for this procedure |
| 2-photon microscope | zeiss | Zeiss LSM 710mp | |
| fine scissors-toughcut | Fine science tools | 14058-09 | this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue |
References
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