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Medicine

Longitudinal Published: December 6, 2016 doi: 10.3791/54796
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Inserm, U1191, Institute of Functional Genomics, 2CNRS, UMR-5203, 3Université de Montpellier

Summary

Este manuscrito describe un procedimiento para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral durante la acumulación de placa amiloide in vivo usando longitudinal microscopía de dos fotones. Una preparación-cráneo adelgazada permite la visualización de los tintes fluorescentes para evaluar la progresión del daño cerebrovascular en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer.

Abstract

Remodelación de la vasculatura del cerebro es un rasgo común de las patologías cerebrales. In vivo técnicas de imagen son fundamentales para detectar la plasticidad cerebrovascular o daños que se produzcan las horas extraordinarias y en relación con la actividad neuronal o el flujo sanguíneo. In vivo microscopía de dos fotones permite el estudio de la plasticidad estructural y funcional de las grandes unidades celulares en el cerebro vivo. En particular, la preparación de ventana cráneo adelgazada permite la visualización de regiones corticales de interés (ROI) sin inducir inflamación significativa en el cerebro. sesiones de formación de imágenes repetitivas de ROI cortical son factibles, proporcionando la caracterización de características distintivas de la enfermedad con el tiempo durante la progresión de numerosas enfermedades del SNC. Esta técnica acceder a las estructuras pial dentro de 250 micras del cerebro se basa en la detección de sondas fluorescentes codificadas por marcadores celulares genéticos y / o colorantes vitales. Este último (por ejemplo, dextranos fluorescentes) se utilizan para mapear la Luminal compartimiento de las estructuras cerebrovasculares. Germane con el protocolo descrito en el presente documento es el uso de un marcador in vivo de depósitos de amiloide, metoxi-O4, para evaluar la enfermedad de Alzheimer progresión (AD). También se describe el tratamiento de la imagen posterior a la adquisición utilizado para realizar un seguimiento de los cambios vasculares y los depósitos amiloides. Aunque se centra actualmente en un modelo de AD, el protocolo descrito es relevante para otros trastornos del sistema nervioso central donde se producen cambios patológicos cerebrovasculares.

Introduction

La vasculatura del cerebro es una estructura multicelular, que está anatómicamente y funcionalmente acoplado a las neuronas. Una remodelación dinámica de los vasos se produce en todo el desarrollo del cerebro y durante la progresión de patologías del sistema nervioso central (CNS) 1,2. Es ampliamente aceptado que el daño cerebrovascular es una característica de varias enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo la epilepsia, la enfermedad de Alzheimer (EA), lesión cerebral traumática y la encefalitis de 3,4. Por lo tanto, el seguimiento de los cambios cerebrovasculares en vivo se vuelve significativo cuando se modela enfermedades del SNC, desde el inicio y en fases crónicas. Como modificaciones cerebrovasculares ocurren a menudo en forma concomitante con el daño neuronal o plasticidad, la imagen de la neuro-vascular representa un punto de partida clave para descifrar SNC fisiopatología de la enfermedad.

Este protocolo describe un procedimiento basado en dos fotones longitudinal para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral en un modelo de ratón deAD, una patología progresiva caracterizada por defectos en los vasos cerebrovasculares calibre grandes y pequeñas, debido a la deposición de placas amiloidogénica 5-7. Este procedimiento permite la visualización de los depósitos de amiloide y el seguimiento de su posición y el crecimiento con respecto a la remodelación neurovascular durante todo el curso de la enfermedad. Colorantes fluorescentes vitales se inyectan antes de cada sesión de formación de imágenes para la visualización de las placas de amiloide y vasculatura cerebral en ratones transgénicos AD 8. Sesiones de formación de imágenes repetidas de un retorno de la inversión a través de una ventana cráneo transcraneal adelgazada es no invasivo y el método de elección para evaluar la remodelación neurovascular en el cerebro de ratón de estar 2,5,9,10.

En el procedimiento siguiente se describe el protocolo quirúrgico, adquisición y procesamiento de imágenes. La progresión temprana de la angiopatía amiloide cerebral (CAA) en su mayoría en general leptomeníngeo y arteriolas penetrantes se caracteriza.

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Protocol

Los ratones se les permite el acceso ad libitum a la comida, el agua, y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Todos los procedimientos con animales de laboratorio se ajustaban a las leyes nacionales y europeas y fueron aprobados por el Ministerio Francés de Educación e Investigación Científica (CEEA-LR-00651-01). Un total de 6 transgénico 5xFAD y ratones de control 4 camada de tipo salvaje (WT) se utilizaron para este procedimiento.

Preparación 1. Pre-operatorio

  1. Por vía intraperitoneal (IP) inyectar metoxi-X04 (10 mg / kg) 48 horas antes de la cirugía para etiquetar depósitos Aß 11.
  2. Preparar fluido estéril cefalorraquídeo artificial (LCRa) (NaCl 120 mM, 26,2 mM NaHCO 3, KCl 2,5 mM, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mM MgCl 2, glucosa 10 mM; burbuja con 95% O2 / 5% de CO 2 antes la adición de 2,5 mM CaCl 2).
  3. Esterilizar instrumentos quirúrgicos (tijeras, pinzas, cuchillas de afeitar y la broca), utilizando un autoclave o esterilizador de cuentas caliente antes asépticacirugía.
  4. Limpiar el banco y la placa de microscopio quirúrgico con 70% de etanol y cubierta con un paño absorbente limpio.
  5. Inyectar ketamina / xilazina (75 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente) y el ketoprofeno analgésico (2,5 mg / kg) IP.
  6. Comprobar el nivel apropiado de la anestesia con la pata o la cola pellizcos.
  7. Aplique una pomada oftálmica estéril para los ojos y afeitar el pelo (nariz para los oídos), evitando los bigotes. Una crema depilatoria se puede utilizar siempre que es seguido de un enjuague con agua cuidadosamente para evitar la irritación de la piel. Afeitarse el pelo sobrante con una cuchilla de afeitar. Esterilizar la piel con una solución antiséptica de povidona yodada.
  8. Coloque el ratón bajo el microscopio binocular y hacer una incisión en la piel de las orejas a la nariz. Tire de la piel hacia los lados para exponer el cráneo. Incisión en el periostio y enjuagar varias veces el cráneo con ACSF estéril para detener el sangrado sea posible.

2. El etiquetado y la vasculatura del cráneo DiluidoPreparación de la ventana (40 min)

  1. Retire el ungüento oftálmico con una punta de algodón. Aplicar una gota de anestésico tópico oftálmico (tetracaína al 1%) y presionar suavemente la piel alrededor de la cuenca del ojo para lograr la protrusión.
  2. Inyectar isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con dextrano (70 kDa) (100 mg / kg o 50 l de una solución 50 mg / ml; insulina aguja hipodérmica) en el seno retro-orbital siguiendo el procedimiento descrito por Yardeni y colegas 12. Aplique una pomada oftálmica estéril para los ojos.
  3. Asegúrese de que la piel se retrae y el cráneo esté limpio y seco en todo el área de imagen seleccionada. Aplicar una pequeña cantidad de pegamento cianoacrılico alrededor de la ventana de la cabeza dispositivo de montaje (que consiste en hojas de afeitar apilados, véase la figura 1), y el pegamento alrededor de la región de destino aplicando una presión suave durante varios segundos 10.
  4. Tire de los extremos de la piel hasta el borde de la ventana de la cabeza dispositivo de montaje, asegurándose de que la zona estáseco. Asegure la piel y el borde de la ventana con una pequeña cantidad de pegamento veterinaria cianoacrılico grado y esperar hasta que se seque (Figura 1).
  5. Asegure el animal en la etapa de utilizar el dispositivo de montaje en la cabeza. Enjuague con ACSF estéril y asegurar que el pozo entre la piel y el dispositivo de la cabeza de montaje está perfectamente sellados. Envolver el ratón en una manta de supervivencia para mantener la normotermia.
  6. Realizar adelgazamiento del cráneo en solución LCRa como se describió anteriormente 10. Tenga en cuenta que el cuero cabelludo no se elimina completamente. Cambiar regularmente las ACSF para limpiar restos de hueso y tejido para evitar el sobrecalentamiento. Cualquier restos de hueso restante se puede quitar con soplos de aire breves. La solución LCRa también atenúa las vibraciones creadas por la perforación.
    NOTA: El espesor del cráneo del ratón varía entre 80 a 150 micras dependiendo de la edad del animal y la región de interés.
  7. Usando un taladro dental (a velocidad media y 0,7 mm rebabas) inicia el adelgazamiento de la superficie del cráneo en una zona 1.0 mm de diámetro utilizando un movimiento regular vertical paralelo al cráneo y eliminar la mayoría del hueso esponjoso (primero 40 - 70 micras). recuerde que debe sustituir a ACSF cada 20-30 segundos y limitar la perforación ininterrumpido a 3-4 seg. Tenga en cuenta que el hueso cerca de suturas es altamente vascularizado. Aplicar LCRa remojado previamente espuma de gel para detener un eventual sangrado.
  8. Utilice una hoja de microcirugía oftálmica desechable afilado para continuar con el adelgazamiento del cráneo, teniendo cuidado de no aplicar demasiada presión. La región final es de alrededor de 0,5 mm de diámetro y con un espesor de 20 - 35 micras.
    NOTA: Debido a la regeneración del hueso y la cicatrización, es necesario más delgada la ventana en cada sesión de imágenes.

3. microscopía de dos fotones (45 min)

  1. Si es necesario, inyectar con 19 mg de ketamina / kg para mantener la anestesia adecuada.
  2. Transferir el ratón (fijo a la etapa headmount) bajo el microscopio de láser de dos fotones. El uso de un obj inmersión 20X aguareflexivo con una apertura numérica de 1,0, ubicar la ventana craneal adelgazada en el centro del campo óptico usando la lámpara de epi-fluorescencia. Asegúrese de que el objetivo siempre está inmerso en ACSF.
  3. Iniciar el escaneado láser con un láser pulsado modo bloqueado (Ti-zafiro 680-1040nm). Ajuste de longitud de onda de excitación a 750 nm para detectar la fluorescencia emitida de la metoxi-xO4 y FITC-dextrano en los canales azul y verde, respectivamente.
    NOTA: El microscopio tiene dos divisores de haz en 506 nm y 555 nm. La luz azul es capturado por un detector de NDD equipado con un filtro de 470 ± 12 nm. La luz verde es capturado por un detector de alta sensibilidad GaAsP equipado con un filtro de 525 ± 25 nm. La potencia del láser máxima emitida por el objetivo no debe ser superior a 10 mW para evitar el daño tisular inducido por láser.
  4. Adquirir una pila bajo aumento (500 m x 500 m, 512 x 512 píxeles; 2 micras paso) a la de zoom numérico 0.7X para crear un mapa en 3D para la relocalización precisa del retorno de la inversiónen puntos de tiempo posteriores.
  5. Adquirir un mosaico de 4 imágenes de alta amplificación digital con un zoom de 2X numérica (200 m x 200 m, 512 x 512 píxeles; 1 micra paso). Usando el software de imágenes mover la ventana en 200 micras pasos para capturar todas las regiones. Profundidad de pilas es típicamente 250 m, a partir de la superficie pial en cada imagen del mosaico.
  6. Antes de retirar el ratón del microscopio, tomar una foto o hacer un mapa 2D dibujado a mano de la vasculatura pial para la futura relocalización del campo de la imagen.

4. Recuperación y reconstrucción de imagen

  1. Retire el dispositivo de la cabeza de montaje aplicando tracción mientras sostiene el cráneo debajo. Si el pegamento permanece unida al cráneo o de la piel, raspar cuidadosamente con unas pinzas finas. Suturar el cuero cabelludo y colocar el ratón en una jaula calienta a seguimiento de la recuperación de la anestesia antes de devolverlo a la jaula de alojamiento. Aplicar crema antibiótica tópica a la sutura e inyectar ketoprofeno (/ kg 2,5 mg) IP los siguientes 2 días.
  2. Repita los pasos 1,1 a 2,5 para las sesiones de formación de imágenes repetidas. Si es necesario, afeitar el hueso con una cuchilla microquirúrgica para asegurar una calidad óptima de la imagen.
    NOTA: adelgazamiento adicional con el taladro dental puede ser necesaria cuando el intervalo entre las sesiones de formación de imágenes es más de un mes.
  3. Coloque el ratón debajo del microscopio de epifluorescencia usando luz de acuerdo con el mapa en 2D de la vasculatura pial tomada de la sesión anterior (paso 3.6).
  4. Iniciar el escaneo láser de dos fotones y ajustar platina del microscopio para lograr la alineación en la escala del micrómetro usando el mapa 3D obtenida en el paso 3.4. Proceder a la imagen detallada como se describe en el paso 3.5.

5. posteriores a la adquisición de tres dimensiones-Reconstrucción y Análisis de Imágenes

  1. Obtener reconstrucciones tridimensionales de la vasculatura y las deposiciones de amiloide utilizando el software de análisis de imágenes 3D como Imaris (versión 8.0 y utiliza 7.7.2). Utilizar el plugin de capa Normalizar en el menú de procesamiento de imágenes y el submenú cambiar el contraste para obtener el contraste ideal de los dos canales en toda la profundidad de la pila de imágenes.
  2. Abrir las imágenes de la misma región en todos los puntos de forma simultánea y siempre les procesar en paralelo con el fin de comparar los diferentes puntos de tiempo.
  3. vasos traza utilizando el módulo de trazador de filamento.
    1. Haga clic en el icono de filamentos para crear un nuevo filamento, omita el trazador automático y elegir el método de auto-ruta.
    2. Asegúrese de que el canal seleccionado se corresponde con la imagen vascular y el uso de la función de selección del puntero, haga clic en una bifurcación buque que se conserva a través de las sesiones de formación de imágenes, mientras que la celebración de las teclas shift + control para determinar un punto de partida. Utilice la función de selección del puntero y haga clic mientras mantiene pulsada la tecla de mayúsculas para seleccionar los puntos extremos de los filamentos.
      NOTA: La comparación de la obteesqueletos nidas mostrarán los cambios estructurales de la vasculatura.
  4. Realizar plano por análisis de avión para realizar un seguimiento de nuevas placas. Aplicar módulo de superficie para el canal azul para el seguimiento del crecimiento de las placas de Aß. Haga clic en el icono de la superficie para crear una nueva superficie y proceder a la creación de superficies automatizado. Utilice el método de umbral para establecer y restar la señal de fondo. El menú de estadísticas proporciona datos respecto a la superficie de los depósitos de amiloide individuales.

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Representative Results

Este protocolo describe un método para la visualización de la vasculatura cerebral y los depósitos de amiloide horas extras. Se inyectaron tintes fluorescentes para etiquetar las deposiciones de amiloide (metoxi-xO4) 11 y para llenar el lumen cerebrovasculares (FITC-dextrano) 1. módulos de software de análisis de imágenes 3D se utilizan para crear imágenes en 3D de un campo constante de vista capturado en los puntos de tiempo consecutivos. Imágenes representativas obtenidas en la corteza somatosensorial de los ratones 5XFAD 5 (modelo genético de AD) muestran que los depósitos de más de Aß aparecen entre 3 y 4 meses de edad, creciendo en el parénquima (Figura 2) y los vasos alrededor penetrantes (Figura 3). Deposición de la placa se produce simultáneamente con la remodelación significativa y oclusión ocasional de la vasculatura cerebral vecino (Figura 2). Sólo se observaron casos raros de la reducción de tamaño de la placa, lo que indica que este es un proceso de placa una ccumulation. Las figuras 2 y 3 ilustran que la carga amiloidogénico en el parénquima y alrededor de los vasos se asocia con la angiogénesis y la oclusión vascular en la corteza somatosensorial. La relación entre las placas amiloides vasculares y la oclusión del vaso no está claro, dado que las placas más grandes vasculares acumulan en las arterias penetrantes, mientras que la oclusión se produjo principalmente en los vasos de pequeño calibre.

Figura 1
Figura 1. Configuración experimental. Configuración (A) Cabeza; Etapa está hecho a medida. Dispositivo principal de montaje se compone de hojas de afeitar apilados construidas como se ha descrito previamente 10. (B) Vista del ratón encerrado en la cabeza dispositivo de montaje. (C) Vista del dispositivo y la piel pegada al cráneo. Los bordes se centraron en la región objetivo.s / ftp_upload / 54796 / 54796fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Comparación de dos imágenes reconstruidas de la microvasculatura y deposiciones de amiloide en un ratón 5xFAD a los 4 y 5 meses de edad. Las placas amiloides se indican con un asterisco blanco, nuevas placas que aparecen a los 5 meses se indican mediante asteriscos amarillos. Un caso raro de reducción de placa se indica con un asterisco naranja microvasos recién formadas están indicados con una flecha amarilla, mientras que la oclusión vascular se indica con una flecha roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 Figura 3. Los buques grandes y pequeños calibre en la corteza somatosensorial a los 3, 4 y 5 meses de edad. (A) El crecimiento de los depósitos amiloides vasculares en vasos de gran calibre (asteriscos blancos). Placas (B) amiloides se puede observar también en los pequeños vasos de calibre (asteriscos amarillos). Las flechas rojas indican vasos ocluidos. asteriscos indican blancas que crecen las placas amiloides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La técnica y el cráneo abierto para microscopía in vivo de dos fotones ofrece la ventaja de las sesiones de formación de imágenes ilimitadas de grandes campos de imagen 13,14. Sin embargo, esta técnica también produce inflamación en la región de interés 14, a menudo incompatibles o impactar neuro-vascular 15 salidas lectura. Por el contrario, la técnica de cráneo transcraneal adelgazada no resulta en neuro-inflamación, lo que permite de imagen fiable de las estructuras cerebrovasculares y la acumulación de placa 10,14. Una segunda ventaja que presenta esta técnica es que la tasa de éxito ventana adelgazada-cráneo puede alcanzar hasta 80% a 90% para un manipulador con experiencia. Un revés importante para el éxito es la falta de apreciación de la densidad ósea que conduce a un adelgazamiento excesivo y la fractura definitiva; experiencia y excelente óptica del microscopio binocular limitarán este problema. Una serie de limitaciones no afectarán a esta técnica sin embargo. En primer lugar, la profundidad de formación de imágenes es co limitadompared a los procedimientos cráneo abierto. En segundo lugar, con el tiempo, el tejido cicatricial que recubre el hueso puede disminuir la calidad de la formación de imágenes transcraneal. En tercer lugar, es difícil proceder a más de 4 sesiones de formación de imágenes, dado que el cráneo tiene que ser adelgazado un poco más en cada sesión. En consecuencia, es importante para determinar el número de sesiones de formación de imágenes en el inicio de un experimento, a fin de optimizar el incremento adelgazamiento entre sesiones. Alternativamente, una ventana transcraneal crónica que consiste en una preparación de cráneo adelgazado pegado con un cubreobjetos se ha descrito anteriormente para limitar el nuevo crecimiento del tejido óseo en el tiempo 16. Aunque eficiente, hemos encontrado que esta técnica sólo retrasó el recrecimiento del hueso durante varias semanas, finalmente interferir con la calidad, la profundidad y la resolución subcelular de las imágenes cuando se re-proyección de imagen después de períodos más largos de tiempo (Margarita, Arango-Lievano y Freddy Jeanneteau, datos no publicados). A pesar de sus limitaciones, de dos fotones microsc transcranealopiar través de preparaciones cráneo adelgazadas repetidas es un método de elección para realizar un seguimiento de los marcadores fluorescentes en modelos de enfermedades crónicas si se produjeran cambios neuro-vascular y la inflamación.

Un adelgazamiento óptima del cráneo representa un paso técnico importante, como la presión aplicada al hueso debe reducirse al mínimo para evitar el sangrado y para asegurar una ventana cráneo plano. El sangrado y una ventana de cráneo desigual puede facilitar la cicatrización y la regeneración desigual del hueso. adelgazamiento excesivo durante la primera sesión de imágenes, el recalentamiento después de la perforación excesiva, o daños de láser también puede poner en peligro la claridad de la señal a través de la ventana del cráneo. Los últimos problemas pueden controlarse cambiando periódicamente el medio LCRa durante la perforación, el enfriamiento de la preparación, la perforación de forma intermitente, y el uso de herramientas cortantes limpios cuando el pulido del hueso. pasos críticos adicionales incluyen la (i) la fijación del cráneo hasta la cabeza placa de montaje para reducir el movimiento asociado con la respiración, (ii) retro-orbital de la inyección y la visibilidad fiable de todos los buques, (iii) la cartografía de la región de interés para la futura reubicación, y (iv) la pre-, persona y el cuidado post-operatorio entre las sesiones de formación de imágenes.

La metodología que aquí se resume permite estudios para evaluar la eficacia y seguridad de los fármacos del SNC destinadas a las estructuras neurovasculares, por ejemplo, moléculas de reducir o prevenir los depósitos de amiloide en el parénquima cerebral y en los buques. Además, longitudinal microscopía de dos fotones del cerebro vivo permite el seguimiento de la amiloidosis y su impacto en la neurovasculatura en las primeras etapas de la EA, antes de la aparición de deterioro cognitivo. La falta de limpieza de grandes placas de amiloide puede tener efectos deletéreos sobre los vasos del cerebro, lo que agrava fisiopatología de la enfermedad 17. La llegada de nuevos colorantes vitales fluorescentes para etiquetar los cuerpos de Lewy, synucleopathy, agregados de priones, los agregados de huntingtina, el apoyo futuro posibilidad de alcanzar neurovasculatura remodeling estudios durante la progresión de otros trastornos neurodegenerativos 18. Esta técnica se adapta a varias cepas de ratón que combinan colorantes (SR101, metoxi-X04, dextranos, lectinas) y marcadores genéticos (thy1YFP, CX3CR1-GFP, NG2-DsRed) para investigar las interacciones celulares in vivo y en modelos en los que la estructura y función experimentales de la neurovasculatura se desvía de la fisiología normal.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer la Liga Francesa contra l'épilepsie (MA-L), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale de Grant AVENIR R12087FS (FJ), beca de la Universidad de Montpellier (FJ) y la subvención de la Federación para la Investigación sobre Le Cerveau (a NM). Reconocemos la asistencia técnica de Chrystel Lafont en el IPAM instalación de plataforma de núcleo formador de imágenes in vivo de Montpellier, en. Agradecemos también a María Vernov (Weill Cornell Medical College) para la corrección del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methoxy-X04 tocris 4920 use 10 mg/kg
FITC-Dextran 70 Kda sigma 46945 use 100 mg/kg
gelfoam/Bloxang Bausch and Lomb
micorsurgical blade surgistar 6900 must be sharp and not dented
povidone-iodine betadine antisceptic solution
binocular stereomicroscope olympus SX10 optimal image contrast is crucial for this procedure
2-photon microscope zeiss Zeiss LSM 710mp
fine scissors-toughcut Fine science tools 14058-09 this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue

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References

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