Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

Published: November 29, 2016 doi: 10.3791/54863
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل من الفلورسنت فحوصات التنقل التحول الكهربي (fEMSA) باستخدام النقاء SOX-2 البروتينات مع الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت المسمى صبغ تحقيقات الحمض النووي كدراسة حالة لمعالجة مسألة البيولوجي المهم.

Abstract

الكهربي فحوصات التنقل العالي (EMSA) هي أداة مفيدة لتوصيف التفاعلات بين البروتينات وتسلسل الحمض النووي المستهدفة. وكان النشاط الإشعاعي الطريقة السائدة لوضع العلامات الحمض النووي في EMSAs. ومع ذلك، فقد دفعت التطورات الحديثة في مجال الأصباغ الفلورية وطرق مسح استخدام العلامات الفلورية من الحمض النووي كبديل للنشاط الإشعاعي للمزايا سهولة التعامل، وتوفير الوقت وتقليل التكاليف، وتحسين السلامة. وقد استخدمنا مؤخرا EMSA فلوري (fEMSA) لمعالجة مسألة البيولوجي المهم بنجاح. يوفر تحليل fEMSA لدينا البصيرة الميكانيكية في تأثير طفرة مغلطة، G73E، في الحفظ جدا HMG عامل النسخ SOX-2 على حاسة الشم تنويع نوع الخلايا العصبية. وجدنا أن متحولة SOX-2 البروتين G73E يغير النشاط ملزم DNA محددة، وبالتالي التسبب في حاسة الشم التحول هوية الخلايا العصبية. هنا، نقدم على الوجه الأمثل، وفعالة من حيث التكلفة خطوة بخطوة بروتوكوللfEMSA باستخدام الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ يحتوي على LIM-4 / SOX-2 المجاورة المواقع المستهدفة والنقاء SOX-2 البروتينات (WT ومتحولة SOX-2 البروتينات G73E) كمثال البيولوجي.

Introduction

تستخدم EMSAs لتحليل التفاعلات بين الحمض النووي والبروتينات باستخدام الأصلي إس دي إس بايج (PAGE) لحل خليط من البروتين من الفائدة وتحقيق الحمض النووي المسمى تحتوي على المواقع المستهدفة المحتملة من البروتين 1. مسبار الحمض النووي ملزمة مع البروتين سوف يهاجرون أبطأ مقارنة مع التحقيق الذي تجريه الحمض النووي الحرة، وبالتالي فهو متخلف في الهجرة من خلال مصفوفة بولي أكريلاميد. وقد Radiolabeling من الحمض النووي بنسبة 32 P الطريقة السائدة للكشف في EMSAs. على الرغم من أن تطبيق radiolabeling في بحوث الكيمياء الحيوية كان مفيدا، يتم استخدام طرق وضع العلامات الحمض النووي بديل مع حساسية مقارنة نظرا لمخاطر الصحة والسلامة المرتبطة التعامل مع النشاط الإشعاعي. وتشمل هذه الطرق البديلة الاقتران من الحمض النووي مع البيوتين 2 أو digoxigenin (DIG) 3 (وكلاهما ثم يتم الكشف عنها بواسطة أنظمة chemiluminescent)، SYBR تلطيخ الأخضر من المواد الهلامية PAGE 4،أو الكشف المباشر لتقارن صبغ الحمض النووي الفلورسنت عن طريق مسح 5،6 هلام.

تتطلب المواد الهلامية حلها من EMSAs باستخدام اختبار الحمض النووي DNA المسمى بالإشعاع معالجة postrun من خلال أفلام تصوير الإشعاع الذاتي أو نظام phosphorimager للكشف عن الإشارات المشعة 1،7. المواد الهلامية من EMSAs باستخدام biotin- 2 أو DIG مترافق تحقيقات 3 الحمض النووي يجب أن تتم معالجة ونقل على غشاء مناسبة ومن ثم الكشف عن طريق التوهج 6. SYBR تلطيخ الأخضر من هلام يتطلب postrun تلطيخ جل وماسح ضوئي الفلورسنت 4. منذ مطلوبة خطوات المعالجة هلام postrun لEMSAs باستخدام تقنيات وضع العلامات الحمض النووي هذه، وهلام حل يمكن يعاير مرة واحدة فقط. في المقابل، تحقيقات الحمض النووي المسمى مع fluorophores يمكن الكشف مباشرة في هلام داخل ألواح الزجاج عن طريق الماسح الضوئي. ولذلك، فإن تفاعلات الحمض النووي والبروتينات يمكن رصدها ويعاير عدة مرات في نقاط زمنية مختلفة خلال الفترة السابقة، والتييقلل كثيرا من الوقت والتكلفة. تقارن صبغ الحمض النووي الفلورسنت التي استخدمت لEMSAs تشمل و Cy3 6،8، 6،8 Cy5، فلوريسئين 9، والأصباغ الفلورية الأشعة تحت الحمراء 4-6.

يتطلب تنظيم النسخي تفاعلات البروتين الحمض النووي من عوامل النسخ والجينات المستهدفة. التنسيق بين هذه التفاعلات يولد أنواع الخلايا المتنوعة من سلف مشترك خلال تطوير الحيوانية. حددت شاشة الوراثية إلى الأمام مشاركات طفرة مغلطة، G73E، في مجال الحمض النووي ملزم HMG الحفظ جدا من انواع معينة عامل ايليجانس النسخ SOX-2. نتائج طفرة في التحول هوية خلية من الخلايا العصبية الشمية AWB في الائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية الشمية عند مستويات الجزيئية، الصرفية، والوظيفية 5،10. SOX-2 ينظم بشكل مختلف تمايز محطة من AWB والائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية من خلال التفاعل مع العوامل شريك النسخ التي تعتمد على السياق وخاص بهالمواقع المستهدفة الحمض النووي 5،10. SOX-2 شركاء مع LIM-4 (LHX) في محطة AWB تمايز الخلايا العصبية، في حين أن وتظهر فحوصات مراسل وسيفيراز SOX-2 شركاء مع CEH-36 (OTX / OTD) في محطة الائتلاف المناهض للحرب تمايز الخلايا العصبية التي SOX-2 و SOX-2 متحولة البروتينات G73E لها تفاعلات تعاونية مع العوامل المساعدة النسخي LIM-4 و CEH-36 لتنشيط المروج أعرب في البنك الوطني المصري والائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية. ومع ذلك، SOX-2 ومتحولة SOX-2 G73E عرض خصائص تفعيل التفاضلية من المروج. للتحقيق في الأساس الجزيئي للأنشطة الحمض النووي التفاضلية ملزمة من SOX-2 و SOX-2 G73E، أجريت fEMSAs مع هذه البروتينات والمواقع المستهدفة المحتملة.

أولا، اتخذ نهجا المعلوماتية الحيوية لتحديد الحمض النووي بيولوجيا تسلسل ملزمة داخل منطقة المروج 1 كيلوبايت المستخدمة في فحص وسيفيراز. وبما أن العديد من SOX-2 مواقع الربط المحتملة الحالية في جميع أنحاء المروج، ركزناعلى مواقع SOX-2 تنبأ ملزمة المتاخمة للالمفترض CEH-36 أو LIM-4 مواقع الربط والحفاظ تطويريا بين الأنواع الخيطية المختلفة. تم حذف هذه المتتاليات أو تحور، واختبار في وقت لاحق في الجسم الحي لنشاطهم في التعبير عن الجينات المحورة مراسل GFP في AWB أو AWC الخلايا العصبية. من خلال هذا النهج، حددنا المحتملة LIM-4 / SOX-2 و CEH-36-2 SOX المجاورة المواقع المستهدفة / المطلوبة على وجه التحديد للتعبير عن GFP في البنك الوطني المصري والائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية، على التوالي 5. نحن التحقيق في الاختلافات المحتملة في الحمض النووي ملزم من SOX-2 و SOX-2 G73E باستخدام fEMSA مع تحديد LIM-4 / SOX-2 و CEH-36 / SOX-2 المواقع المستهدفة المجاورة. وأظهر تحليل EMSA في أن SOX-2 G73E لا يلزم التحقيق الحمض النووي الذي يحتوي على المتاخمة المواقع المستهدفة LIM-4 / SOX-2 (مطلوب للتعبير الجينات في AWB) بكفاءة كما WT SOX-2 فعلت. وكان مع ذلك، SOX-2 و SOX-2 G73E لا فرق في ربط التحقيق الحمض النووي الذي يحتوي على CEH-36 / SOX-2 (أ)djacent الموقع المستهدف (مطلوب للتعبير الجينات في الائتلاف المناهض للحرب) 5،10. يحلل لنا fEMSA تقديم رؤية الميكانيكية في طبيعة G73E طفرة SOX-2 في التأثير على نشاط محدد ملزم الحمض النووي لهوية الخلية تحول النمط الظاهري AWB إلى الائتلاف المناهض للحرب. هنا، نحن تصف بروتوكول الأمثل من fEMSA باستخدام 6xHis-SOX-2 النقاء أو 6xHis-SOX-2 G73E جنبا إلى جنب مع الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء تحقيقات الحمض النووي المسمى صبغ يحتوي على المتاخمة المواقع المستهدفة LIM-4 / SOX-2 كدراسة حالة لمعالجة سؤال البيولوجي المهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: EMSAs باستخدام اختبار الحمض النووي DNA fluorescently المسمى أو غيرها من الحمض النووي المسمى أشكال تقاسم نفس البروتوكولات للبروتين أو استخراج الخلايا إعداد، رد فعل البروتين الحمض النووي ملزم، وإعداد جيل PAGE وتشغيل (الشكل 1A). الفروق الرئيسية هي الإجراءات DNA وضع العلامات، وبعد التشغيل خطوات المعالجة هلام، وطرق الكشف.

1. إعداد جل

  1. إعداد 5٪ هلام بولي أكريلاميد الأصلية التي تحتوي على TBE 0.5X (45 ملي تريس، بورات، 1 ملم EDTA) و 2.5٪ الجلسرين، وذلك باستخدام نظام هلام بروتين صغير (8.3 سم عرض × 7.3 سم طول × 0.75 مم سمك).
    1. لإعداد 30 مل من محلول هلام لمدة 4 المواد الهلامية، وخلط 5 مل من 30٪ مادة الأكريلاميد / مكرر (37.5: 1)، 3 مل من 5X TBE (0.45 M تريس، بورات، 10 ملي EDTA)، و 1.5 مل من 50٪ الجلسرين، 300 ميكرولتر من 10٪ الأمونيوم بيرسلفات، 15 ميكرولتر من TEMED، و 20.2 مل من ده 2 O تماما.
      ملاحظة: الأكريلاميد هو ضار وسام، والتعامل مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    2. يلقي حل الجل فورا. بعد البلمرة، والتفاف المواد الهلامية في التفاف واضح من البلاستيك قبل مبلل مع TBE 0.5X وتخزينها في 4 درجات مئوية.

    2. إعداد تحقيقات المسمى صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

    ملاحظة: حافظ على أليغنوكليوتيد] وصفت صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء بعيدا عن الضوء قدر الإمكان أثناء التحضير والتخزين، والتجارب.

    1. تصميم والنظام أليغنوكليوتيد].
      1. تصميم النوكليوتيد طويلة ل~ 51 السائدة.
        ملاحظة: تسلسل قليل النوكليوتيد طويلة من LIM-4 / SOX-2 التحقيق هو TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. [أليغنوكليوتيد طويلة لا تتطلب PAGE أو تنقية HPLC.
      2. تصميم [أليغنوكليوتيد قصيرة التكميلية لل~ 14 السائدة مع الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء تعديل صبغ في 'محطة 5 (5'Dye) ودرجة حرارة انصهار فوق 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: تسلسل قليل النوكليوتيد قصيرة من LIM-4 / SOX-2 التحقيق هو 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. الحد الأدنى للنطاق توليف [أليغنوكليوتيد قصيرة وصفت 5'Dye هو 100 نانومتر. ولذلك، فإن أليغنوكليوتيد تتطلب تنقية HPLC.
    2. [أليغنوكليوتيد resuspend في المخزن 1X تريس، EDTA (TE: 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) لتركيز النهائي من 100 ميكرومتر.
    3. يصلب القصيرة (5'Dye) وأليغنوكليوتيد] طويلة.
      1. مزيج 0.6 ميكرولتر من 5'Dye القصير بنسبة ضئيلة (100 ميكرون)، 1.2 ميكرولتر من بنسبة ضئيلة طويلة (100 ميكرومتر)، و 28.2 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم، تريس، EDTA عازلة (STE: 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) في أنبوب 1.5 مل.
      2. وضع أنبوب في الماء المغلي لمدة 5 دقائق. إيقاف مصدر الحرارة ويترك الماء مع oligos صلب بارد O / N في الظلام.
    4. ملء يتدلى 5 'من صلب 5'Dye القصير / oligos طويلة مع البلمرة Klenow الحمض النووي لجعل مزدوجة تحقيقات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل.
      1. إعداد رد فعل عن طريق خلط30 ميكرولتر من oligos صلب قصيرة / طويلة مع العلامة 5'Dye، 8.5 ميكرولتر من 10X Klenow العازلة، 1.7 ميكرولتر من 10 ملي dNTPs، 1.7 ميكرولتر من Klenow (3 '-> 5' exo-) (5 ش / ميكرولتر)، و 43.1 ميكرولتر من ده 2 O في 0.2 مل أنبوب PCR.
      2. احتضان 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جهاز PCR.
      3. إضافة 3.4 ميكرولتر 0.5 M EDTA لوقف التفاعل وتعطيل الحرارة عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في جهاز PCR.
    5. تمييع شغل في المسابير (0.7 ميكرومتر) في STE لتركيز النهائي من 0.1 ميكرومتر.
    6. متجر oligos في -20 درجة مئوية في الظلام حتى جاهزة للاستخدام. قد يتم تخزين Oligos لمدة تصل إلى سنة في هذه الحالة.
      ملاحظة: لتوليد تحقيقات الحمض النووي مع مواقع متحولة ملزمة، وصلب الإصدارات متحولة من أليغنوكليوتيد] طويلة مع [أليغنوكليوتيد قصيرة وصفت 5'Dye، تليها التعبئة في ل5 يتدلى "مع Klenow. وقد تبين أن التحقيق مع واحدة حبلا المسمى مع فلوري الأشعة تحت الحمراءصبغ لديها فقط 30٪ كثافة من التحقيق مع كل من خيوط المسمى مع الصبغة. إذا احتاج كثافة إشارة إلى تعزيز، وصفت oligos طويلة من كل من خيوط مع الأصباغ الفلورية الأشعة تحت الحمراء في 5 "ترميني وصلب لجعل الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء تحقيقات المسمى صبغ.

    3. إعداد ليس لها علامة / الباردة تحقيقات (المنافسين)

    ملاحظة: تم صلب [أليغنوكليوتيد طويلة من تسلسل التكميلية (لونغ وLongR) لجعل تحقيقات غير المسماة لتحليل المنافسة مع الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء تحقيقات المسمى صبغ.

    1. مزيج 20 ميكرولتر من 100 ميكرومتر لونغ، 20 ميكرولتر من 100 ميكرومتر LongR أليغنوكليوتيد]، و 60 ميكرولتر من STE في أنبوب 1.5 مل.
    2. وضع أنبوب في الماء المغلي لمدة 5 دقائق، إيقاف مصدر الحرارة ويترك الماء مع oligos صلب بارد بين عشية وضحاها.

    4. رد الفعل ملزم والكهربائي

    1. إعداد 1 مل من العازلة ملزمة 5X عن طريق خلط 50 ميكرولتر60، 1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5. 10 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم. 200 ميكرولتر من 1 M بوكل، 5 ميكرولتر من 1 M MgCl 2، 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8.0. 5 ميكرولتر من 1 M DTT. 25 ميكرولتر من 10 ملغ / مل جيش صرب البوسنة، و 695 ميكرولتر من ده 2 O.
      ملاحظة: 5X الاحتياطي ملزم يمكن aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية. وثمة نقطة أخرى للنظر هو أن عوامل النسخ المختلفة سيكون تعديلات مختلفة لالعازلة ملزمة.
    2. الحق قبل إعداد ردود الفعل ملزم، قبل تشغيل هلام بولي أكريلاميد الأصلي 5٪ في 0.5X TBE + 2.5٪ الجلسرين لإزالة كل آثار فوق كبريتات الأمونيوم في 80 V ل30 - 60 دقيقة، أو حتى التيار لم يعد يختلف مع الوقت.
    3. إعداد رد فعل ملزم في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
      1. خلط 4 ميكرولتر من العازلة ملزمة 5X، 80-200 نانوغرام المنقى البروتين (50٪ الجلسرين، أي SOX-2)، 1 ميكرولتر من 0.1 ميكرومتر التحقيق صبغ مترافق (اضرب النهائيentration: 5 نانومتر)، وده 2 O.
      2. اختياري: عندما يطلب من المنافسين التحقيق البارد، إضافة تركيزات مختلفة (2X، 10X، 25X، 50X، 100X، وما إلى ذلك) من تحقيقات الباردة.
      3. اختياري: عندما يكون التفاعل بين البروتينات ألف وباء (أي، SOX-2 وLIM-4) يتم اختبار، إضافة 80-200 نانوغرام المنقى البروتين ب (50٪ الجلسرين، أي LIM-4).
      4. اختياري: عند استخدام استخراج النووي إعداد وملزمة محددة من البروتين ويمكن التحقق من صحة، إضافة الأجسام المضادة المحددة للبروتين و(أي معاداة 6xHis، ومكافحة FLAG، وما إلى ذلك).
      5. في احتضان R / T في الظلام لمدة 15 دقيقة.
    4. تحميل كل من رد فعل ملزم على جل وتشغيل هلام في 10 فولت / سم إلى المسافة المطلوبة.

    5. التصوير

    ملاحظة: تم مسحها الجل مباشرة في لوحات الزجاج مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء المتقدمة. ولذلك، فإن جل يمكن زيادة حل ومسحها بشكل متكرر (أرقام 1C و

    1. تنظيف السرير من الماسح الضوئي مع ده 2 O وتجف جيدا قبل المسح. جففي لوحات الزجاج من هلام ووضع لوحات تحتوي على هلام على السرير الماسح الضوئي.
    2. فتح برامج التصوير بالأشعة تحت الحمراء، وانتقل إلى علامة التبويب "اكتساب" ل. عندما يتم وضع لوحة أرق (1 ملم) على السرير الماسح الضوئي، استخدام الإعدادات من القناة: 700، كثافة: السيارات، والقرار: 169 ميكرون، الجودة: متوسطة، والتركيز تعوض: 1.5 مم. عندما يتم وضع لوحة سمكا (3 مم) على السرير الماسح الضوئي، استخدام الإعدادات من القناة: 700، كثافة: السيارات، والقرار: 84 ميكرون، الجودة: متوسطة، والتركيز تعوض: 3.5 مم. التركيز تعويض يعتمد علىسمك لوحة من الزجاج.
    3. تحديد المنطقة التي تحتل جل على الماسح الضوئي. انقر على "ابدأ" لبدء المسح الضوئي.
    4. كرر الكهربائي والمسح الضوئي بالإضافة إلى ذلك الضرورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البرتقال G صبغ تحميل (6X: 0.12 غرام البرتقال G في 100 مل من 30٪ الجلسرين) ويمكن أن يضاف إلى رد فعل ملزم قبل التحميل لتصور سير الكهربائي. سوف يتم الكشف عن الأصباغ التحميل الأخرى بما في ذلك برموفينول الأزرق خلال المسح الضوئي وبالتالي تتداخل مع تحليل الصور (الشكل 1B).

في بعض الحالات من EMSAs، خاصة إذا تم استخدام مستخلص النووي الإعداد، يتم تضمين بولي deoxyinosinic-deoxycytidylic (DI-تيار مستمر) في رد فعل ملزم لخفض غير محددة وملزمة من البروتينات الحمض النووي (11). ومع ذلك، 50 ميكروغرام / مل من ثنائي تيار مستمر ألغت ربط 6xHis-SOX-2 النقاء مع تحقيقات 5'Dye الحمض النووي (الشكل 1B).

لإظهار خصوصية ملزمة من الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت تحقيقات الحمض النووي المسمى صبغ، كنا WT أو تحقيقات الباردة متحولة كمنافسين ( G73E (الشكل 1C، الممرات 3-6 مقابل 7-10). ومع ذلك، فإن فعالية مسابقة LIM-4 / SOX-2 (M) التحقيق البارد تحور في الموقع SOX-2 ملزم أقل بكثير من وزن LIM-4 / SOX-2 المسبار البارد للربط إلى 6xHis-SOX-2 G73E (الشكل 1C، الممرات 13-16 مقابل. 17-20).

خصوصية ملزمة من البروتينات يمكن تحديده من خلال إجراء فحوصات supershift للتفاعل البروتين الحمض النووي باستخدام الأجسام المضادة المحددة للبروتينات أو العلامات، وخصوصا عندما يستخدم إعداد مستخلص النووية للمقايسة 1. كانت المعلمة SOX-2 مع 6xHis والحواتم FLAG. إضافة 1 ميكروغرام المضادة لل6xHis أو 2.5 ميكروغرام مكافحة FLAG M2 antibo وفاة أدى إلى supershifted الفرقة SOX-2-الحمض النووي (الشكل 2).

شكل 1
الشكل 1. fEMSA باستخدام [أليغنوكليوتيد المسمى صبغ الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت. (A) مخطط تدفق fEMSA. (ب) أثر برموفينول صبغ الأزرق والبرتقالي G، وDI-تيار مستمر (1 ميكروغرام) على fEMSA. وقد استخدم 5 نانومتر من 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 التحقيق. (C) fEMSA تظهر خصوصية ملزمة من 6xHis-SOX-2 G73E إلى موقع الهدف SOX-2 من العنصر LIM-4 / SOX-2. وقد استخدم 5 نانومتر من 5'Dye-LIM-4 / SOX-2 التحقيق. LIM-4 / SOX-2 (M)، المواقع المستهدفة متحولة. تم مسحها المواد الهلامية في 20 و 40 دقيقة بعد الكهربائي. الصورة الممسوحة ضوئيا التي تم الحصول عليها في 40 دقيقة بعد أن تم استخدامها الكهربائي لقياس شدة الموجات الفلورسنت، الذي تطبيع من شدة الممر دون أي تحقيق البارد. الاتحاد الافريقي، وحدة تعسفية.ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
تم وضع علامة الشكل 2. التحليلات Supershift مجمع SOX-2-الحمض النووي باستخدام fEMSA والأجسام المضادة. SOX-2 مع كل 6xHis والحواتم FLAG. تسببت إضافة معاداة 6xHis أو الأجسام المضادة ضد العلم وsupershift من مجمع SOX-2-DNA. LIM-4 5'Dye استخدمت / SOX-2 التحقيق. وتقسم الصور هلام بين الممرات 2 و 3 لاستبعاد الممرات غير ذات صلة. تم تفحص هلام في 40، 60، و 90 دقيقة بعد الكهربائي. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

fEMSAs تشكل أداة فعالة للتحقيق في التفاعلات البروتينية الحمض النووي، وتكون بديلا لوسم المشعة من الحمض النووي. والأصباغ الفلورية مثل الأصباغ الحمراء المتاحة تجاريا، وتوفير وسيلة أكثر أمانا وصديقة للبيئة مقارنة مع وضع العلامات الحمض النووي المشع. EMSAs باستخدام الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ لا تتطلب خطوات المعالجة هلام postrun، وبالتالي توفير الوقت والتكلفة مقارنة تقنيات الحمض النووي العلامات الأخرى. الوقت للكشف عن عصابات باستخدام EMSAs المشعة يمكن أن تتراوح من 30 دقيقة إلى عدة أيام، اعتمادا على النشاط الإشعاعي وتركيز تحقيقات الحمض النووي اختبار 1. في المقابل، مسح المواد الهلامية fEMSA يأخذ في المتوسط ​​25 دقيقة، مما يقلل كثيرا من الوقت البروتوكول. fEMSAs أيضا توفر ميزة كبيرة على وضع العلامات المشعة، كما لا يملك جل لشطبها من لوحات الزجاج لتحليلها. وهذا يسمح للهلام لإعادة فحص إذا كان وقت التشغيل الأولي لا يكفيلحل المجمعات البروتين الحمض النووي. خيار تمديد الكهربائي غير متوفر باستخدام النظائر المشعة أو البيوتين / streptavidin. الأهم من ذلك، التعامل مع المواد المشعة يشكل خطرا على السلامة للعاملين في المختبر، في حين وضع العلامات الفلورية تحقيقات الحمض النووي ليست خطرة، ويمكن التخلص من بسهولة. يتطلب استخدام streptavidin أيضا فترة أطول حتى الكشف (حوالي 3 ساعات) 12. البروتوكول والنتائج المقدمة هنا تثبت أن fEMSA هو أداة فعالة ومريحة للبحوث الطبية الحيوية. وقد استخدمنا بنجاح fEMSA تقديم رؤية الآلية إلى تأثير SOX-2 G73E طفرة في نشاط معين الحمض النووي ملزمة أن يؤدي إلى الخلايا العصبية الشمية التحول هوية 5،10.

في حالة عدم وجود أو إشارة ضعيفة يتم الكشف عند تحليل وهلام، وتركيز التحقيق الحمض النووي يمكن زيادة. وقد وصفت تحقيقات الحمض النووي المستخدمة في التجارب لدينا مع صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء علىضفيرة واحدة. وعلى الرغم من نجاح هذه الطريقة بنجاح لتحقيقات اختبرناها، تم الإبلاغ عن أن وضع العلامات الفلورية من ضفيرة واحدة لديها 30٪ كثافة من تحقيقات التي وصفت على كل فروع. إذا كثافة يبرهن على أن تكون منخفضة للغاية، فمن المستحسن أن يعلم كل من خيوط التحقيق الحمض النووي مع صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء. إذا لم يتم الالتزام عصابات تحول، قد يكون بروتين معقد الحمض النووي غير مستقر. الجلسرين هو أمر حاسم في هذا البروتوكول إلى استقرار التفاعلات البروتينية الحمض النووي. يتم تضمين الجلسرين في المواد الهلامية مسبوكة من رد فعل ملزم، والمخزن المؤقت قيد التشغيل. نقطة أخرى من الاعتبار هو اختيار صبغ عندما تتبع تطور عينات من خلال هلام خلال الفترة السابقة. البرتقال G مثالية لهذا الغرض عن أنواع أخرى من الأصباغ تحميل مثل برموفينول الأزرق يمكن أن تتداخل مع المسح الضوئي من هلام. Prerunning هلام مهم أيضا لضمان إزالة فوق كبريتات الأمونيوم من هلام مسبق لعينات التحميل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام بولي دي-DC تتداخل مع المربوطةغرام من البروتين في المصالح مع التحقيق الحمض النووي في fEMSAs. الطهارة من البروتين من الفائدة والهدف سلامة الحمض النووي هي مهمة لتفاعلها أيضا. ومن المهم أيضا لضمان ضبط المسح الصحيحة عند استخدام برامج التصوير. التركيز المناسب تعويض ويتم اختيار المعلمات كثافة وفقا لسمك من لوحات جل وحدة تحقيقات الحمض النووي.

وقد وصفت البروتوكولات السابقة لأداء EMSAs الفلورسنت 13،14. ومع ذلك، قد تطلب هذه البروتوكولات استخدام DI-تيار مستمر، و / أو مضخات تستخدم لتعميم الماء للحفاظ على درجة حرارة معينة. بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة أكثر تفصيلا، ولا يتطلب استخدام أي المضخات.

وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول المقايسات المنافسة الرصد في الوقت الحقيقي. تحقيقات fluorescently المسمى توفر لنا هذه الرؤية إضافية، والمواد الهلامية يمكن مسحها عدة مرات في مختلف بوين الوقت الكهربائيالخبر. وبالإضافة إلى ذلك، اختبار الحمض النووي DNA من الفائدة ومنافس تحقيقات يمكن أن توصف مع مختلف الأصباغ الفلورية الأشعة تحت الحمراء، مما يسمح للتصوير اللونين. كما هو الحال مع جميع التقنيات، وهناك قيود على استخدام EMSAs الفلورسنت. وهناك حاجة إلى تركيزات أعلى من البروتين بالمقارنة مع EMSAs التقليدية نظرا لحساسية أقل نسبيا. الحد الآخر هو اشتراط وجود نظام التصوير محدد مع ارتفاع القرار للكشف عن صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء. على الرغم من أن التكلفة الأولية مرتفعة لشراء الماسح الضوئي، استخدام على المدى الطويل من الأشعة تحت الحمراء العلامات صبغة الفلورسنت هو فعالة من حيث التكلفة. وعلى الرغم من هذه القيود، وتوفير EMSAs الفلورسنت وسيلة هامة لمعالجة المسائل الحيوية الهامة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1  Bio-Rad 1610158 Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) ThermoFisher MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody  Sigma-Aldrich F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade New England Biolabs B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos Integrated DNA Technologies Custom DNA oligo These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-) New England Biolabs M0212S
LightShif Poly (dI-dC) ThermoFisher 20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell  Bio-Rad 1658000FC  This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System LI-COR Biotechnology Odyssey CLx Infrared Imagng System This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System  LI-COR Biotechnology Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0) LI-COR Biotechnology Image Studio software  This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. 
Orange G Sigma-Aldrich O3756-25G
6x Orange loading dye 0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
  3. Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
  4. Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
  5. Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
  6. Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
  7. Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
  8. Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
  9. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  10. Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
  11. Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
  12. Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
  13. Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
  14. Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 117، نيون EMSA، الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت، ونظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء،
بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang,… More

Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (117), e54863, doi:10.3791/54863 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter