Summary
我们在这里描述使用纯化SOX-2蛋白与红外荧光染料标记的DNA探针作为案例研究解决的重要生物学问题一起荧光电泳迁移实验（FEMSA）的优化方案。
Abstract
电泳迁移率变动分析（EMSA）为表征的蛋白质和它们的靶DNA序列之间的相互作用的仪器工具。放射性已经在EMSAs DNA标记的主要方法。然而，最近在荧光染料和扫描方法的进步促使使用的DNA的荧光标记的作为替代的放射性为容易处理的优点，节省时间，降低成本，并提高安全性。我们最近使用的荧光EMSA（FEMSA）成功地解决一个重要的生物学问题。我们FEMSA分析提供机械洞察的错义突变，G73E的效果，在高度保守的HMG转录因子SOX-2上嗅神经元类型多样化。我们发现，突变的SOX-2蛋白G73E具体改变DNA结合活性，从而导致嗅觉神经元的身份转换。这里，我们提出一种优化和成本效益的一步一步协议使用FEMSA含有作为生物例如LIM-4 / SOX-2的相邻目标站点和纯化的SOX-2蛋白（WT和突变体SOX-2 G73E蛋白）红外荧光染料标记的寡核苷酸。
Introduction
EMSAs用于通过使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），以解决感兴趣的蛋白和含有该蛋白1的潜在目标位点的标记的DNA探针的混合物，以分析DNA和蛋白质之间的相互作用。与蛋白结合的DNA探针将与自由DNA探针下迁移较慢进行比较，因此在通过聚丙烯酰胺基质其迁移延迟。通过32 p的DNA的放射性标记已经用于检测EMSAs的主要方法。虽然放射性标记的生化研究中的应用一直是有益的，可替代DNA标记的具有可比性的灵敏度方法正在使用由于与处理放射性有关的健康和安全风险。这些替代方法包括用生物素2或洋地黄毒苷（DIG）3（两者都然后通过化学发光系统检测）的DNA的共轭，所述PAGE凝胶4的SYBR绿染色，或通过扫描凝胶5,6直接检测DNA的荧光染料结合物。
用放射性标记的DNA探针EMSAs的解决凝胶需要通过放射自显影胶片或磷光系统检测到的放射性信号1,7后运行处理。使用生物素2或地高辛共轭3 DNA探针EMSAs的凝胶还必须处理并转移到合适的膜，然后通过化学发光6检测。凝胶的SYBR绿染色需要后运行凝胶染色和荧光扫描器4。因为需要使用这些DNA标记技术EMSAs后运行凝胶处理步骤，解析的凝胶可仅一次测定。与此相反，标有荧光团的DNA探针，可以直接在由扫描仪的玻璃板内的凝胶进行检测。因此，DNA-蛋白相互作用可被监测和运行期间检测在不同时间点几次，这显著降低时间和成本。已用于EMSAs的DNA的荧光染料缀合物包括Cy3的6,8-，Cy5的6,8，荧光素9，和红外荧光染料4-6。
转录调控需要的转录因子和它们的靶基因蛋白-DNA相互作用。这些相互作用的协调从动物发育过程中的共同祖产生多样的细胞类型。无偏向前遗传筛选中鉴定的错义突变，G73E，在秀丽隐杆线虫的转录因子SOX-2的高度保守的HMG DNA结合结构域。基因突变导致AWB嗅觉神经元到AWC嗅觉神经元的细胞身份转换的分子，形态和功能水平5,10。 SOX-2通过与上下文相关的伙伴转录因子和各自相互作用差异调节AWB和AWC神经元的终末分化DNA的目标网站5,10。 SOX-2在终端AWB神经元分化合作伙伴LIM-4（LHX），而SOX-2在终端AWC神经元分化合作伙伴CEH-36（OTX / OTD）。荧光素酶报告基因分析显示，SOX-2和突变SOX-2 G73E蛋白质具有与转录辅因子的LIM-4和CEH-36协同相互作用以激活AWB和AWC神经元中表达的启动子。然而，SOX-2和突变SOX-2 G73E显示启动子的微分活化性质。调查的SOX-2和SOX-2 G73E差的DNA结合活性的分子基础，fEMSAs用这些蛋白质以及它们的潜在靶位点进行。
首先，生物信息学方法被识别生物相关的DNA的荧光素酶分析中使用的1 kb的启动子区域内的结合序列。由于多个潜在SOX-2结合位点在整个子在场，我们的重点在邻近推定CEH-36或LIM-4结合位点和各种线虫物种之间进化上保守的预测SOX-2结合位点。这些序列被删除或突变，并且随后在体内测试其活性表达中AWB或AWC神经元GFP报告转基因。通过这种方法，我们鉴定了特别需要的GFP的AWB和AWC的神经元，分别为5的表达潜力LIM-4 / SOX-2和CEH-36 / SOX-2的相邻目标位点。我们研究中的DNA中的电势差SOX-2和SOX-2使用FEMSA与所识别的LIM-4 / SOX-2和CEH-36 / SOX-2的相邻目标站点G73E的结合。我们EMSA分析表明，SOX-2 G73E不结合含LIM-4 / SOX-2相邻的靶位点（在AWB基因表达必需的）DNA探针尽可能高效率WT SOX-2一样。然而，SOX-2和SOX-2 G73E曾在结合含DNA探针没有区别CEH-36 / SOX-2djacent目标网站5,10（在AWC基因的表达需要）。我们FEMSA分析提供在影响为AWB到AWC小区标识转化表型特异的DNA结合活性的机械洞察SOX-2 G73E突变的性质。在这里，我们描述FEMSA的一个优化的协议使用纯化的6xHis-SOX-2或纯化6xHis-SOX-2含LIM-4 / SOX-2相邻的靶位点作为一个案例研究，以解决红外荧光染料标记的DNA探针G73E在一起一个重要的生物学问题。
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Protocol
注：使用荧光标记的DNA探针或其它形式的标记的DNA的EMSAs分担蛋白或细胞提取物制备，蛋白质-DNA结合反应，和PAGE凝胶制备和运行（ 图1A）相同的协议。关键的区别是DNA标记程序，运行后的凝胶处理步骤和检测方法。
1.凝胶制备
- 制备含有0.5×TBE（45毫摩尔Tris-硼酸，1mM EDTA中）和2.5％甘油5％非变性聚丙烯酰胺凝胶，使用微型蛋白凝胶系统（8.3厘米宽×7.3厘米长×0.75毫米厚）。
- 制备30毫升凝胶溶液4凝胶，混合5毫升30％丙烯酰胺/双（37.5：1），3 5×TBE（0.45M的Tris-硼酸，10mM EDTA的），1.5毫升50％甘油的溶液， 300微升10％过硫酸铵，TEMED 15μL，20.2毫升DDH 2 O的彻底。
注：丙烯酰胺是有毒有害，配备适当的个人防护设备处理。 - 立即施放凝胶溶液。聚合后，敷在凝胶的透明塑料包装预先润湿0.5X TBE，并将它们存储在4℃。
2.红外线荧光染料标记的探针的制备
注：在制备，储存和实验保持红外荧光色素标记寡核苷酸从光尽可能远。
- 设计和秩序的寡核苷酸。
- 设计长寡核苷酸〜51聚体。
注：LIM-4 / SOX-2探头的长链寡核苷酸序列是TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC。长寡核苷酸不需要PAGE或HPLC纯化。 - 设计的互补短寡核苷酸〜14聚体用在5'末端（5'Dye）和熔化温度高于37℃，红外荧光染料修饰。
注：的短寡核苷酸序列LIM-4 / SOX-2探头是5'Dye-GGGAGAAGATTTTG。 5'Dye标记短寡核苷酸的最小合成规模为100纳米。因此，寡核苷酸需要HPLC纯化。
- 设计长寡核苷酸〜51聚体。
- 重悬的寡核苷酸在1×的Tris-EDTA缓冲液（TE：10mM的Tris-盐酸，pH为8.0; 1mM EDTA）中，以100μM的最终浓度。
- 退火短（5'Dye）和长寡核苷酸。
- 混合0.6 5'Dye-短寡（100μM）的100μL，长寡（100μM）的1.2微升，和钠28.2微升氯化物的Tris-EDTA缓冲液（STE：100mM NaCl的10毫摩尔Tris盐酸，pH值8.0; 1mM EDTA）中在1.5mL管。
- 放置管中5分钟沸水。关闭热源，让水与退火的寡聚体在黑暗中冷却O / N。
- 用Klenow DNA聚合酶退火5'Dye-短/长寡核苷酸的5'突出端补以使双链DNA探针。
- 通过混合准备反应退火长/短寡核苷酸与5'Dye标签的30微升，8.5微升10X缓冲克列诺，1.7微升10毫米的dNTP，1.7克列诺的μL（3' - > 5'外切）（5U /μL）和在0.2毫升PCR管DDH 2 O的43.1微升。
- 孵育在37℃下60分钟在PCR机器。
- 添加3.4微升的0.5M EDTA终止在75℃下在PCR机器进行反应和热灭活20分钟。
- 稀释STE填写的探头（0.7μM）为0.1μm的终浓度。
- 在-20℃储存的寡核苷酸在黑暗中待用。寡核苷酸可以存储最多在此条件下一年。
注意：为了产生突变体的结合位点的DNA探针，长寡核苷酸的突变版本被退火以5'Dye标记短的寡核苷酸，随后的5'用Klenow悬填充项。已经表明，与一条链的探针标记用红外荧光染料仅具有30％的用标记与染料两条链的探针的强度。如果信号强度需要加强，两条链长的寡核苷酸在5'末端标记有红外荧光染料和退火以使红外荧光染料标记的探针。
3.未标记/冷探针的制备（竞争对手）
注意：互补序列（长和LongR）的长寡核苷酸退火到用于与红外荧光染料标记的探针竞争分析作出的未标记探针。
- 混合20微升100μM的长，100微米LongR寡核苷酸的20微升，并且STE 60微升的1.5毫升管中。
- 把试管煮沸5分钟的水，关火源，让水与退火的寡聚体冷却过夜。
4.结合反应和电泳
- 通过混合50微升制备1毫升5×结合缓冲液60;的1M Tris-HCl中，pH值7.5; 5M的NaCl10μL的;的1M氯化钾，1M的5微升的 MgCl 2 200微升，10微升的0.5M的EDTA，pH值8.0; 5微升1 M DTT的;的DDH 2 O 695 10毫克/毫升BSA的25微升，并微升
注：5×结合缓冲液可以被等分并储存在-20℃。另一点要考虑的是，不同的转录因子将具有不同的修改到结合缓冲液。 - 右设置结合反应之前，预运行在0.5×TBE + 2.5％甘油5％的非变性聚丙烯酰胺凝胶在80伏以除去过硫酸铵的所有痕迹30 - 60分钟，或直到当前不再随时间变化。
- 设置在20微升最终体积的结合反应。
- 拌4 5×结合缓冲液100μL，80 - 200纳克纯化的蛋白A（在50％甘油， 即 ，SOX-2），0.1μM染料缀合的探针的1微升（终浓度entration：5纳米），和的DDH 2 O
- 可选：当需要低温探针的竞争对手，添加各种浓度的冷探头（2倍，10倍，25倍，50倍，100倍， 等等 ）。
- 可选的：当蛋白质A和B之间的相互作用（ 即 ，SOX-2和LIM-4）被测试，加入80 - 200纳克纯化的蛋白B（在50％甘油， 即 ，LIM-4）。
- 可选：当使用核提取物制剂和特异性结合蛋白A的要被验证，添加特定蛋白A（ 即，抗的6xHis，抗FLAG 等 ）的抗体。
- 孵育R / T在黑暗15分钟。
- 加载所有的结合反应的凝胶上，并在10伏/厘米至所需的距离运行凝胶。
5.成像
注：将凝胶直接扫描的玻璃板用先进的红外成像系统。因此，凝胶可进一步解析和多次扫描（ 图1C和
- 清洁扫描仪的床的DDH 2 O和扫描前枯井。擦拭干凝胶的玻璃板上放置装有扫描器床凝胶板。
- 打开红外成像软件，并进入“捕获”选项卡。当薄钢板（1毫米）被放置在扫描仪床上，用通道的设置：700，亮度：自动，分辨率：169微米，质量：中等，聚焦偏移1.5毫米。当厚板（3毫米）被放置在扫描仪床上，用通道的设置：700，亮度：自动，分辨率：84微米，质量：中等，聚焦偏移：3.5毫米。聚焦偏置依赖于玻璃板的厚度。
- 选择该凝胶扫描仪上占据的面积。点击“开始”开始扫描。
- 重复电泳和另外必要时进行扫描。
- 制备30毫升凝胶溶液4凝胶，混合5毫升30％丙烯酰胺/双（37.5：1），3 5×TBE（0.45M的Tris-硼酸，10mM EDTA的），1.5毫升50％甘油的溶液， 300微升10％过硫酸铵，TEMED 15μL，20.2毫升DDH 2 O的彻底。
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Representative Results
橙G样染料（6×0.12橙G在100毫升30％甘油）可被加入到结合反应装载前形象化电泳的进度。其它加载染料包括溴酚蓝将在扫描过程中检测到的，因此，用图像分析（ 图1B）产生干扰。
在EMSAs的一些情况下，尤其是当使用核提取物制剂，聚deoxyinosinic-脱氧胞苷（DI-DC）被包括在结合反应以降低蛋白质的非特异性结合的DNA 11。然而，二-DC的50微克/毫升废除纯化的6xHis-SOX-2 5'Dye DNA探针（ 图1B）的结合。
以显示红外荧光染料标记的DNA探针的结合特异性，我们用野生型或突变冷探针作为竞争对手（
蛋白质的结合特异性可以通过利用特异于蛋白质或标记的抗体的蛋白-DNA相互作用的超迁移测定法，特别是当核提取物制剂用于测定1来确定。 SOX-2标有6x组氨酸和FLAG表位。 1微克抗的6xHis或2.5微克抗FLAG M2 antibo的加成模具导致了supershifted SOX-2-DNA的带（ 图2）。
图1. FEMSA的FEMSA使用红外荧光染料标记的寡核苷酸（A）的流程图。 （B）的溴酚蓝染料的作用，橙G，和上FEMSA DI-DC（1微克）。采用5纳米5'Dye-LIM-4 / SOX-2探头。 （℃）FEMSA表示的6xHis-SOX-2 G73E的结合特异性的LIM-4 / SOX-2元件的SOX-2目标部位。采用5纳米5'Dye-LIM-4 / SOX-2探头。 LIM-4 / SOX-2（M），突变靶位点。将凝胶在电泳后20和40分钟进行扫描。在40分钟电泳来定量荧光条带强度，这是由该车道的强度归一化而没有任何冷探针后扫描的图像获得。 AU，任意单位。ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
使用FEMSA和抗体的SOX-2-DNA复合物的图2超迁移分析。SOX-2被标记与两个的6xHis和FLAG表位。抗的6xHis或抗FLAG抗体的加成造成了SOX-2-DNA复合物的超迁移。 - - 5'Dye LIM 4使用/ SOX-2探测。凝胶图像泳道2和3，以排除无关的车道之间拼接。凝胶在40，60被扫描，电泳后90分钟。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
fEMSAs是调查蛋白-DNA相互作用的有效工具，并且是对DNA的放射性标记的替代方案。荧光染料诸如红外染料可商购的，并与放射性DNA标记提供更安全和更环境友好的方法。使用红外荧光染料标记的寡核苷酸EMSAs不需要后运行凝胶处理步骤，因此，节省时间和成本相对于其它DNA标记技术。的时间来检测使用放射性EMSAs频带的范围可以从30分钟至数天，这取决于测试1的DNA探针的放射性和浓度。与此相反，FEMSA凝胶扫描平均需要25分钟，从而显著减少协议的时间。 fEMSAs还提供一个显著优于放射性标记，作为凝胶不必从用于分析玻璃板除去。这使得凝胶重新扫描，如果在初始运行时间是不充分解决蛋白质-DNA复合物。延长电泳的选项，使用放射性同位素或生物素/链不可用。最重要的是，处理放射性物质造成了安全风险实验室人员，而DNA探针的荧光标记是不危险的，并且可以容易地处置。使用链霉亲和的也需要较长的时间，直到检测（约3小时）12。该协议这里提出的结果表明，FEMSA是生物医学研究的有效和方便的工具。我们已经成功地使用FEMSA提供机械洞察SOX-2突变G73E具体的DNA结合活性，导致嗅觉神经元的身份转换5,10的效果。
在该分析凝胶时没有检测到或弱信号的情况下，DNA探针的浓度可以增加。在我们的试验中所用的DNA探针已被被标记上一个红外荧光染料单链。虽然这种方法已为我们已经测试探针成功地工作，它已经报道，一个单链的荧光标记有已标记的两条链的探针的30％的强度。如果强度证明是太低，建议用红外荧光染料来标记DNA探针的两条链。如果未观察到移位条带，所述蛋白质-DNA复合物可能是不稳定的。甘油是在这个协议的关键，以稳定蛋白-DNA相互作用。甘油包括在浇铸凝胶，结合反应，并且在运行缓冲液。考虑的另一点是染料的选择，在运行过程中通过凝胶跟踪样本的进展时。橙G是理想的用于此目的的其它类型的装载染料如溴酚蓝可与凝胶的扫描干涉。 Prerunning凝胶也很重要，以确保过硫酸铵从之前装载样品凝胶中移除。此外，使用聚二的dC可以用结合蛋白干扰克与fEMSAs DNA探针目的蛋白质。的兴趣和目标DNA完整性的蛋白的纯度也对它们的相互作用很重要。同样重要的是使用成像软件时，以确保正确的扫描设置。适当的聚焦偏移和强度参数根据凝胶板和DNA探针的强度的厚度选定。
以前的协议已被描述来执行荧光EMSAs 13,14。然而，这些协议已经需要使用的dI-DC的，和/或使用的泵循环水，以保持特定的温度。这里所描述的协议提供了一个更详细的方法，并且不需要使用任何泵。
此协议的未来应用包括实时监控的竞争测定。荧光标记探针我们提供这些额外的观点，因为凝胶可以在不同的电泳时间POIN扫描多次TS。此外，感兴趣和竞争对手的探针DNA探针可与不同的红外荧光染料进行标记，允许两色影像。如同所有的技术，有使用荧光EMSAs限制。相比，由于相对较低的灵敏度传统EMSAs需要蛋白质的浓度较高。另一个限制是具有高分辨率，以检测红外荧光染料的特定成像系统的要求。虽然初始成本高购买扫描器，长期使用红外荧光染料标记的是成本有效的。尽管有这些限制，荧光EMSAs提供解决显著生物学问题的重要方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA |
References
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