Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट रंजक लेबल oligonucleotides उपयोग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल

Published: November 29, 2016 doi: 10.3791/54863
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago

Summary

हम यहाँ फ्लोरोसेंट electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट assays (FEMSA) शुद्ध SOX -2 प्रोटीन एक साथ उपयोग कर एक मामले का अध्ययन एक महत्वपूर्ण जैविक सवाल से निपटने के लिए के रूप में अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल डीएनए जांच के साथ की एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन।

Abstract

Electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट assays (EMSA) प्रोटीन और उनके लक्ष्य डीएनए दृश्यों के बीच बातचीत को चिह्नित करने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई उपकरण हैं। रेडियोधर्मिता EMSAs में डीएनए लेबलिंग की प्रमुख विधि से किया गया है। हालांकि, फ्लोरोसेंट रंगों और स्कैनिंग तरीकों में हाल के अग्रिमों आसान से निपटने के फायदे के लिए रेडियोधर्मिता के लिए एक विकल्प के रूप में डीएनए के फ्लोरोसेंट टैगिंग के उपयोग के लिए प्रेरित किया है, समय की बचत लागत को कम करने, और सुरक्षा में सुधार। हमने हाल ही में फ्लोरोसेंट EMSA (FEMSA) का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक एक महत्वपूर्ण जैविक सवाल का पता करने के लिए। हमारे FEMSA विश्लेषण अत्यधिक संरक्षित एचएमजी प्रतिलेखन कारक SOX -2 घ्राण न्यूरॉन प्रकार के विविधीकरण पर, एक missense उत्परिवर्तन, G73E के प्रभाव में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हमने पाया है कि उत्परिवर्ती SOX -2 G73E प्रोटीन विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी गतिविधि बदल, जिससे घ्राण न्यूरॉन पहचान परिवर्तन के कारण। यहाँ, हम उपस्थित एक अनुकूलित और लागत प्रभावी कदम-दर-कदम प्रोटोकॉलFEMSA अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल लिम-4 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों और शुद्ध SOX -2 प्रोटीन (WT और उत्परिवर्ती SOX -2 G73E प्रोटीन) एक जैविक उदाहरण के रूप में युक्त ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स प्रयोग करने के लिए।

Introduction

EMSAs ब्याज की एक प्रोटीन और एक लेबल डीएनए प्रोटीन 1 के संभावित लक्ष्य साइटों युक्त जांच का एक मिश्रण को हल करने के लिए देशी जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) का उपयोग करके डीएनए और प्रोटीन के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। प्रोटीन के साथ ही एक डीएनए जांच धीमी एक मुक्त डीएनए जांच के साथ तुलना में विस्थापित हो जाएगा, और इसलिए एक polyacrylamide मैट्रिक्स के माध्यम से अपने प्रवास में मंद है। 32 पी द्वारा डीएनए के radiolabeling EMSAs में पता लगाने के लिए प्रमुख विधि से किया गया है। हालांकि जैव रासायनिक अनुसंधान में radiolabeling के आवेदन फायदेमंद रहा है, तुलनीय संवेदनशीलता के साथ वैकल्पिक डीएनए लेबलिंग के तरीकों रेडियोधर्मिता से निपटने के साथ जुड़े स्वास्थ्य और सुरक्षा जोखिम के कारण नियोजित किया जा रहा है। इन वैकल्पिक तरीकों, बायोटिन 2 या digoxigenin (डीआईजी) 3 (जो दोनों के तो chemiluminescent सिस्टम द्वारा पता लगाया जाता है) के साथ डीएनए के विकार पृष्ठ जैल 4 की SYBR हरी धुंधला शामिलया जेल 5,6 स्कैनिंग द्वारा डीएनए फ्लोरोसेंट रंजक conjugates के प्रत्यक्ष पता लगाने।

Radioactively लेबल डीएनए जांच का उपयोग EMSAs का संकल्प लिया जैल autoradiography फिल्मों के माध्यम से postrun प्रसंस्करण या रेडियोधर्मी संकेत 1,7 पता लगाने के लिए एक phosphorimager प्रणाली की आवश्यकता है। Biotin- 2 या डीआईजी संयुग्मित 3 डीएनए जांच का उपयोग EMSAs की जैल भी संसाधित किया जाना चाहिए और एक उपयुक्त झिल्ली पर स्थानांतरित किया और फिर chemiluminescence 6 से पता चला। जेल के SYBR हरी धुंधला postrun जेल धुंधला हो जाना और एक फ्लोरोसेंट स्कैनर 4 की आवश्यकता है। चूंकि postrun जेल प्रसंस्करण कदम इन डीएनए लेबलिंग तकनीक का उपयोग कर EMSAs के लिए आवश्यक हैं, हल जेल केवल एक बार यत्न किया जा सकता है। इसके विपरीत, डीएनए fluorophores के साथ लेबल जांच सीधे एक स्कैनर द्वारा गिलास प्लेट के अंदर जेल में पता लगाया जा सकता है। इसलिए, डीएनए, प्रोटीन बातचीत पर नजर रखी जा सकता है और चलाने के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर कई बार यत्न जोकाफी समय और लागत कम कर देता है। डीएनए फ्लोरोसेंट रंजक conjugates कि EMSAs के लिए इस्तेमाल किया गया है Cy3 6.8, 6.8 Cy5, fluorescein 9, और अवरक्त फ्लोरोसेंट रंगों 4-6 शामिल हैं।

Transcriptional विनियमन प्रतिलेखन कारक है और अपने लक्ष्य जीन के प्रोटीन डीएनए बातचीत की आवश्यकता है। इन मुलाकातों के समन्वय पशु विकास के दौरान एक आम पूर्वज से विविध प्रकार की कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। एक निष्पक्ष आगे आनुवंशिक स्क्रीन, एक missense उत्परिवर्तन, G73E पहचान अत्यधिक संरक्षित Caenorhabditis एलिगेंस प्रतिलेखन कारक SOX -2 के एचएमजी डीएनए बाध्यकारी डोमेन। आणविक रूपात्मक, और कार्यात्मक स्तरों पर 5,10 AWB आंगनवाडी घ्राण न्यूरॉन्स में घ्राण न्यूरॉन्स की एक सेल पहचान परिवर्तन में उत्परिवर्तन का परिणाम है। SOX -2 विभिन्न संदर्भ पर निर्भर साथी प्रतिलेखन कारक और संबंधित के साथ बातचीत से AWB और आंगनवाडी न्यूरॉन्स के टर्मिनल भेदभाव को नियंत्रित करता हैडीएनए लक्ष्य साइटों 5,10। SOX -2 टर्मिनल AWB neuronal भेदभाव में लिम-4 (LHX) के साथ भागीदारों, SOX -2 टर्मिनल आंगनवाडी neuronal भेदभाव में CEH-36 (OTX / OTD) के साथ भागीदार। Luciferase संवाददाता assays दिखाने जबकि उस SOX-2 और उत्परिवर्ती SOX -2 G73E प्रोटीन ट्रांसक्रिप्शनल सहकारकों लिम-4 और CEH-36 के साथ सहकारी बातचीत एक प्रमोटर AWB और आंगनवाडी न्यूरॉन्स में व्यक्त सक्रिय करने के लिए है। हालांकि, SOX-2 और उत्परिवर्ती SOX -2 G73E प्रमोटर के अंतर सक्रियण गुण का प्रदर्शन किया। SOX -2 और SOX -2 G73E का अंतर डीएनए बाध्यकारी गतिविधियों के आणविक आधार की जांच करने के लिए, fEMSAs इन प्रोटीन और उनके संभावित लक्ष्य साइटों के साथ प्रदर्शन किया गया।

सबसे पहले, एक जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण जैविक रूप से प्रासंगिक डीएनए 1 केबी प्रमोटर luciferase परख में इस्तेमाल किया क्षेत्र के भीतर दृश्यों बाध्यकारी की पहचान करने के लिए लिया गया था। के बाद से कई संभावित SOX -2 बाध्यकारी साइटों प्रमोटर भर में मौजूद थे, हम ध्यान केंद्रितभविष्यवाणी की SOX -2 बाध्यकारी ख्यात CEH-36 या लिम-4 बाध्यकारी साइटों से सटे और evolutionarily विभिन्न प्रजातियों के बीच निमेटोड संरक्षित साइटों पर। इन दृश्यों को हटा दिया गया है या उत्परिवर्तित, और बाद में उनकी गतिविधियों AWB या आंगनवाडी न्यूरॉन्स में GFP संवाददाता transgenes व्यक्त करने के लिए vivo में परीक्षण किया। इस दृष्टिकोण के माध्यम से, हम संभावित लिम-4 / SOX -2 और CEH-36 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों है कि विशेष रूप से AWB और आंगनवाडी न्यूरॉन्स में क्रमश: 5 में GFP की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक हैं की पहचान की। हम SOX -2 और SOX -2 G73E पहचान लिम-4 / SOX -2 और CEH-36 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों के साथ FEMSA का उपयोग कर के बंधन डीएनए में संभावित मतभेद की जांच की। हमारे EMSA विश्लेषण से पता चला है कि sox -2 G73E डीएनए लिम-4 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों (AWB में जीन की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक) युक्त जांच के लिए बाध्य नहीं किया था के रूप में कुशलता के रूप में गुम्मट SOX -2 किया था। हालांकि, SOX -2 और SOX -2 G73E डीएनए युक्त जांच बाध्यकारी में कोई अंतर नहीं था CEH-36 / SOX -2 एकdjacent लक्ष्य साइट 5,10 (आंगनवाडी में जीन की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक)। हमारे FEMSA AWB करने वाली आंगनवाडी सेल पहचान परिवर्तन phenotype के लिए विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी गतिविधि को प्रभावित करने में SOX -2 G73E उत्परिवर्तन की प्रकृति में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान विश्लेषण करती है। यहाँ, हम शुद्ध 6xHis-SOX -2 या 6xHis-SOX -2 G73E अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल डीएनए एक मामले का अध्ययन से निपटने के लिए के रूप में लिम-4 / SOX -2 आसन्न लक्ष्य साइटों युक्त जांच के साथ एक साथ प्रयोग FEMSA के एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन एक महत्वपूर्ण जैविक सवाल।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: fluorescently लेबल डीएनए जांच या लेबल डीएनए के अन्य रूपों का उपयोग कर EMSAs प्रोटीन या सेल निकालने की तैयारी, प्रोटीन डीएनए बाध्यकारी प्रतिक्रिया, और पृष्ठ जेल तैयारी और चल रहा है (चित्रा 1 ए) के लिए एक ही प्रोटोकॉल का हिस्सा है। मुख्य अंतर डीएनए लेबलिंग प्रक्रियाओं, पोस्ट रन की जेल प्रसंस्करण कदम है, और तरीकों का पता लगाने कर रहे हैं।

1. जेल तैयारी

  1. , 5% देशी polyacrylamide 0.5x TBE (45 मिमी Tris-borate, 1 मिमी EDTA) और 2.5% ग्लिसरॉल युक्त जेल तैयार एक मिनी प्रोटीन जेल प्रणाली (8.3 सेमी चौड़ाई x 7.3 सेमी लंबाई x 0.75 मिमी मोटाई) का उपयोग कर।
    1. 4 जैल के लिए जेल समाधान के 30 एमएल तैयार करने के लिए, मिश्रण 30% के 5 एमएल एक्रिलामाइड / बीआईएस (37.5: 1), 3 5x TBE (0.45 एम Tris-borate, 10 मिमी EDTA), 50% की 1.5 एमएल ग्लिसरॉल के एमएल, 10% अमोनियम persulfate के 300 μL, TEMED के 15 μL, और DDH 2 हे की 20.2 एमएल अच्छी तरह से।
      ध्यान दें: एक्रिलामाइड हानिकारक और विषैले है, उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ संभाल।
    2. जेल समाधान तुरंत डाली। polymerization के बाद, स्पष्ट प्लास्टिक की चादर 0.5x TBE के साथ पहले से गीला में जैल लपेट और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

    2. इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट रंजक लेबल जांच की तैयारी

    नोट: अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स तैयारी, भंडारण, और प्रयोगों के दौरान जितना संभव हो उतना प्रकाश से दूर रखें।

    1. डिजाइन और व्यवस्था ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स।
      1. ~ 51-mers के लिए लंबे समय oligonucleotide डिजाइन।
        नोट: लिम-4 / SOX -2 जांच की लंबी oligonucleotide अनुक्रम TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC है। लांग ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स पेज या एचपीएलसी शुद्धि की आवश्यकता नहीं है।
      2. 5 'टर्मिनस (5'Dye) और 37 डिग्री सेल्सियस के ऊपर एक पिघलने के तापमान पर अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक संशोधन के साथ ~ 14 mers के लिए पूरक लघु ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स डिजाइन।
        नोट: से कम oligonucleotide अनुक्रम लिम-4 / SOX-2 जांच 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG है। 5'Dye लेबल कम ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स की न्यूनतम संश्लेषण पैमाने 100 एनएम है। इसलिए, ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स एचपीएलसी शुद्धि की आवश्यकता होती है।
    2. 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए;: (1 मिमी EDTA 10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0 ते) 1x Tris-EDTA बफर में Resuspend ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स।
    3. पानी रखना लघु (5'Dye) और लांग ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स।
      1. 0.6 5'Dye-लघु oligo (100 माइक्रोन) के के μL, लांग oligo (100 माइक्रोन) के 1.2 μL, और सोडियम की 28.2 μL क्लोराइड-Tris-EDTA बफर (मिक्स STE: 100 मिमी NaCl, 10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA) एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में।
      2. 5 मिनट के लिए उबलते पानी में ट्यूब रखें। गर्मी स्रोत को बंद करें और annealed ओलिगोस अंधेरे में शांत हे / एन के साथ पानी दें।
    4. annealed 5'Dye-छोटे / Klenow डीएनए पोलीमरेज़ के साथ लांग ओलिगोस के 5 'overhangs में भरें डबल असहाय डीएनए जांच करने के लिए।
      1. मिश्रण से तैयार की प्रतिक्रिया5'Dye टैग के साथ annealed छोटे / लंबे ओलिगोस के 30 μL, 8.5 μL के 10x Klenow बफर, 10 मिमी dNTPs के 1.7 μL, 1.7 Klenow की μL (3 '-> 5' exo-) (5 यू / μL), और एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में DDH 2 हे की 43.1 μL।
      2. एक पीसीआर मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
      3. 3.4 μL एक पीसीआर मशीन में 20 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया और गर्मी निष्क्रिय रोकने के लिए जोड़े 0.5 एम EDTA।
    5. 0.1 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला STE में भरे हुए जांच (0.7 माइक्रोन) के।
    6. तैयार है जब तक अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ओलिगोस का उपयोग करने के लिए। ओलिगोस इस हालत में एक साल तक के लिए भंडारित किया जा सकता है।
      नोट: उत्परिवर्ती बाध्यकारी साइटों के साथ डीएनए जांच उत्पन्न करने के लिए, लंबे समय से oligonucleotides के उत्परिवर्ती संस्करणों 5'Dye लेबल कम ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स, 5 'Klenow साथ overhangs का भरण-इन द्वारा पीछा के साथ annealed हैं। यह दिखाया गया है कि एक कतरा साथ जांच एक अवरक्त फ्लोरोसेंट के साथ लेबलडाई डाई के साथ लेबल दोनों किस्में के साथ जांच का केवल 30% तीव्रता है। संकेत तीव्रता मजबूत करने की जरूरत है, दोनों किस्में की लंबी ओलिगोस 5 'Termini पर अवरक्त फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल और अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल जांच बनाने के लिए annealed हैं।

    3. बिना लेबल वाले / ठंडा जांच की तैयारी (प्रतियोगियों)

    नोट: पूरक दृश्यों (लंबी और LongR) की लंबी ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल जांच के साथ प्रतिस्पर्धा के विश्लेषण के लिए लेबल हटाया जांच बनाने के लिए annealed थे।

    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 100 माइक्रोन के लांग के 20 μL, 100 माइक्रोन के LongR ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स के 20 μL, और Ste के 60 μL मिक्स।
    2. 5 मिनट के लिए उबलते पानी में ट्यूब रखें, गर्मी स्रोत बंद कर देते हैं और annealed ओलिगोस के साथ रात भर ठंडे पानी दें।

    4. बाध्यकारी प्रतिक्रिया और वैद्युतकणसंचलन

    1. 50 μL मिश्रण से 5x बाध्यकारी बफर के 1 एमएल तैयार60, 1 एम Tris एचसीएल की, पीएच 7.5; 5 एम NaCl के 10 μL; 1 एम KCl, 1 एम के 5 μL 2 MgCl के 200 μL, 0.5 एम EDTA के 10 μL, पीएच 8.0; 1 एम डीटीटी के 5 μL; 10 मिलीग्राम / एमएल BSA के 25 μL, और 695 DDH 2 ओ की μL
      नोट: 5x बाध्यकारी बफर aliquoted और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। एक और बात पर विचार करना है कि अलग अलग प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी बफर करने के लिए विभिन्न संशोधनों होगा।
    2. सही बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं की स्थापना से पहले, 30 के लिए 80 वी में अमोनियम persulfate के सभी निशान को दूर करने के लिए 5% 0.5x TBE + 2.5% ग्लिसरॉल में देशी polyacrylamide जेल पूर्व चलाने - 60 मिनट, या जब तक मौजूदा अब कोई समय के साथ बदलता रहता है।
    3. 20 μL के अंतिम मात्रा में बाध्यकारी प्रतिक्रिया सेट करें।
      1. मिक्स 4 5x बाध्यकारी बफर के μL, 80 - 200 एनजी शुद्ध प्रोटीन ए (50% ग्लिसरॉल में, यानी, SOX -2), 0.1 माइक्रोन के डाई संयुग्मित जांच के 1 μL (अंतिम सान्द्रentration: 5 एनएम), और DDH 2 ओ
      2. वैकल्पिक: जब ठंड जांच प्रतियोगियों के लिए आवश्यक हैं, विभिन्न सांद्रता ठंड जांच के (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, आदि) जोड़ें।
      3. वैकल्पिक: जब प्रोटीन ए और बी के बीच बातचीत (यानी, sox -2 और लिम-4) का परीक्षण किया जाता है, 80 जोड़ - 200 एनजी शुद्ध प्रोटीन बी (50% ग्लिसरॉल में, यानी, लिम-4)।
      4. वैकल्पिक: जब परमाणु निकालने की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाता है और प्रोटीन एक की विशिष्ट बंधनकारी मान्य किया जा रहा है, एंटीबॉडी के एक प्रोटीन (यानी, विरोधी 6xHis, विरोधी झंडा, आदि) के लिए विशिष्ट जोड़ें।
      5. 15 मिनट के लिए अंधेरे में आर / टी पर सेते हैं।
    4. जेल पर बाध्यकारी प्रतिक्रिया के सभी लोड और 10 वी / सेमी वांछित दूरी के लिए कम से जेल चला रहे हैं।

    5. इमेजिंग

    नोट: जेल एक उन्नत अवरक्त इमेजिंग प्रणाली के साथ कांच की प्लेटों में सीधे स्कैन किया गया। इसलिए, जेल आगे सुलझाया जा सकता है और बार-बार स्कैन (आंकड़े 1 सी और

    1. DDH 2 हे के साथ स्कैनर के बिस्तर साफ और स्कैनिंग से पहले अच्छी तरह से सूखे। जेल के गिलास प्लेट सूखी पोंछे और स्कैनर बिस्तर पर जेल युक्त प्लेटें जगह है।
    2. अवरक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और 'मोल' टैब के लिए जाना। पतली प्लेट (1 मिमी) स्कैनर बिस्तर पर रखा जाता है, चैनल की सेटिंग का उपयोग करें: 700, तीव्रता: ऑटो, संकल्प: 169 माइक्रोन, गुणवत्ता: मध्यम, और फोकस ऑफसेट: 1.5 मिमी। मोटा प्लेट (3 मिमी) स्कैनर बिस्तर पर रखा जाता है, चैनल की सेटिंग का उपयोग करें: 700, तीव्रता: ऑटो, संकल्प: 84 माइक्रोन, गुणवत्ता: मध्यम, और फोकस ऑफसेट: 3.5 मिमी। ऑफसेट फोकस पर निर्भर करता हैकांच की प्लेट की मोटाई।
    3. क्षेत्र में है कि जेल स्कैनर पर रह रहे हैं का चयन करें। स्कैन शुरू करने के लिए 'आरंभ' पर क्लिक करें।
    4. वैद्युतकणसंचलन दोहराएँ और स्कैन इसके अतिरिक्त के रूप में आवश्यक।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ऑरेंज जी लोडिंग डाई (6x: 100 एमएल 30% ग्लिसरॉल में 0.12 जी ऑरेंज जी) वैद्युतकणसंचलन की प्रगति की कल्पना करने के लिए लोड करने से पहले बाध्यकारी प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा जा सकता है। Bromophenol नीले सहित अन्य लोड करने वाले रंगों स्कैनिंग के दौरान पता लगाया जाएगा और इसलिए छवि विश्लेषण (चित्रा 1 बी) के साथ हस्तक्षेप।

EMSAs के कुछ उदाहरणों में, खासकर अगर परमाणु निकालने की तैयारी प्रयोग किया जाता है, पाली deoxyinosinic-deoxycytidylic (डीआई-डीसी) बाध्यकारी प्रतिक्रिया में डीएनए से 11 प्रोटीनों की गैर विशिष्ट बंधन कम करने के लिए शामिल किया गया है। हालांकि, 50 माइक्रोग्राम / डि-डीसी एमएल शुद्ध 6xHis-SOX -2 5'Dye डीएनए जांच (चित्रा 1 बी) के साथ के बंधन समाप्त कर दिया।

अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल डीएनए जांच के बंधन विशिष्टता दिखाने के लिए, हम गुम्मट या प्रतियोगियों के रूप में उत्परिवर्ती ठंड जांच (प्रयुक्त G73E करने के लिए बाध्य करने के लिए / SOX -2 जांच (चित्रा 1C, गलियों 3-6 बनाम। 7-10)। हालांकि, लिम-4 / SOX -2 (एम) ठंड SOX -2 बाध्यकारी साइट में उत्परिवर्तित जांच की प्रतियोगिता दक्षता 6xHis-SOX -2 G73E करने के लिए बाध्य करने के लिए गुम्मट लिम-4 / SOX -2 ठंड जांच की तुलना में बहुत कम है (चित्रा 1C, गलियों 13-16 बनाम। 17-20)।

प्रोटीन के बंधन विशिष्टता, प्रोटीन या टैग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन डीएनए बातचीत के supershift assays के प्रदर्शन खासकर जब परमाणु निकालने की तैयारी परख 1 के लिए प्रयोग किया जाता है के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। SOX -2 6xHis और ध्वज epitopes साथ टैग किया गया। 1 माइक्रोग्राम विरोधी 6xHis या 2.5 माइक्रोग्राम विरोधी झंडा M2 antibo के अलावा एक supershifted SOX-2-डीएनए बैंड (चित्रा 2) में हुई मर जाता है।

आकृति 1
चित्रा 1. FEMSA की FEMSA इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट रंजक लेबल oligonucleotides इस्तेमाल करते हैं। (ए) फ्लो चार्ट। (बी) bromophenol नीले रंग की डाई के प्रभाव, नारंगी जी, और FEMSA पर di-डीसी (1 माइक्रोग्राम)। 5'Dye-लिम-4 / SOX -2 जांच के 5 एनएम इस्तेमाल किया गया था। (सी) FEMSA लिम-4 / SOX -2 तत्व की SOX -2 लक्ष्य साइट के लिए 6xHis-SOX -2 G73E के बंधन विशिष्टता दिखा। 5'Dye-लिम-4 / SOX -2 जांच के 5 एनएम इस्तेमाल किया गया था। लिम-4 / SOX -2 (एम), उत्परिवर्ती लक्ष्य साइटों। जैल वैद्युतकणसंचलन के बाद 20 और 40 मिनट पर स्कैन किया गया। स्कैन की गई छवि 40 मिनट पर प्राप्त करने के बाद वैद्युतकणसंचलन फ्लोरोसेंट बैंड तीव्रता, जो किसी भी ठंड जांच के बिना लेन की तीव्रता से सामान्यीकृत था यों इस्तेमाल किया गया था। ए.यू., मनमाना इकाई।ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
FEMSA और एंटीबॉडी का उपयोग SOX-2-डीएनए परिसर की चित्रा 2. Supershift विश्लेषण। SOX -2 दोनों 6xHis और ध्वज epitopes साथ टैग किया गया। विरोधी 6xHis या विरोधी झंडा एंटीबॉडी के अलावा SOX-2-डीएनए परिसर का एक supershift का कारण बना। 5'Dye-लिम-4 / SOX -2 जांच इस्तेमाल किया गया था। जेल छवियों गलियों 2 और 3 अप्रासंगिक गलियों को बाहर करने के बीच spliced ​​रहे थे। जेल 40, 60 पर स्कैन किया गया था, और वैद्युतकणसंचलन के बाद 90 मिनट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

fEMSAs प्रोटीन डीएनए बातचीत की जांच के लिए एक कुशल उपकरण हैं, और डीएनए के रेडियोधर्मी लेबलिंग के लिए एक विकल्प हैं। ऐसे अवरक्त रंजक के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और रेडियोधर्मी डीएनए लेबलिंग की तुलना में एक सुरक्षित और अधिक पर्यावरण के अनुकूल विधि प्रदान करते हैं। अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबल oligonucleotides का उपयोग कर EMSAs postrun जेल प्रसंस्करण कदम की आवश्यकता नहीं है, और इसलिए अन्य डीएनए लेबलिंग तकनीकों की तुलना में समय और लागत बचाने के लिए। समय का पता लगाने के लिए रेडियोधर्मी EMSAs का उपयोग कर बैंड, 30 मिनट से कई दिनों तक हो सकती है रेडियोधर्मिता और 1 का परीक्षण डीएनए जांच की एकाग्रता पर निर्भर करता है। इसके विपरीत, FEMSA जैल की स्कैनिंग औसतन 25 मिनट पर ले जाता है, जिससे काफी प्रोटोकॉल समय को कम करने। fEMSAs भी रेडियोधर्मी लेबलिंग पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान के रूप में जेल विश्लेषण के लिए कांच की प्लेटों से हटा दिया जाना जरूरी नहीं है। इस जेल rescanned हो सकता है अगर प्रारंभिक चलाते समय पर्याप्त नहीं है की अनुमति देता हैप्रोटीन डीएनए परिसरों को हल करने के लिए। वैद्युतकणसंचलन का विस्तार करने के लिए विकल्प रेडियोधर्मी आइसोटोप या बायोटिन / streptavidin का उपयोग कर उपलब्ध नहीं है। सबसे महत्वपूर्ण बात, रेडियोधर्मी सामग्री से निपटने प्रयोगशाला कर्मियों के लिए एक सुरक्षा खतरा बना हुआ है, जबकि डीएनए जांच के फ्लोरोसेंट लेबलिंग खतरनाक नहीं है, और आसानी से निपटाया जा सकता है। Streptavidin का उपयोग भी पता लगाने के लिए जब तक एक लंबी अवधि (लगभग 3 घंटे) 12 की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल और यहाँ प्रस्तुत परिणाम दिखाना है कि FEMSA जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक प्रभावी और सुविधाजनक उपकरण है। हम सफलतापूर्वक विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी गतिविधि पर SOX -2 G73E उत्परिवर्तन का असर है कि घ्राण न्यूरॉन पहचान परिवर्तन 5,10 की ओर जाता है में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए FEMSA इस्तेमाल किया है।

घटना जब जेल का विश्लेषण है कि कोई या कमजोर संकेत का पता चला है, डीएनए जांच की एकाग्रता बढ़ सकता है। डीएनए हमारे परीक्षण में इस्तेमाल जांच एक पर एक अवरक्त फ्लोरोसेंट डाई के साथ चिह्नित किया गया हैइकलौता धागा। इस विधि जांच हम परीक्षण किया है के लिए सफलतापूर्वक काम किया है, वहीं यह बताया गया है एक भी कतरा के फ्लोरोसेंट लेबलिंग जांच है कि दोनों किस्में पर चिह्नित किया गया है की 30% तीव्रता है। तीव्रता बहुत कम साबित होता है, तो यह एक अवरक्त फ्लोरोसेंट डाई के साथ डीएनए जांच के दोनों किस्में लेबल करने के लिए सिफारिश की है। अगर स्थानांतरित कर दिया बैंड नहीं मनाया जाता है, प्रोटीन डीएनए जटिल अस्थिर हो सकता है। ग्लिसरॉल इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण प्रोटीन डीएनए बातचीत को स्थिर करने के लिए है। ग्लिसरॉल casted जैल, बाध्यकारी प्रतिक्रिया है, और चल बफर में शामिल है। विचार का एक और मुद्दा डाई का विकल्प है जब चलाने के दौरान जेल के माध्यम से नमूनों की प्रगति पर नज़र रखने के लिए है। ऑरेंज जी ऐसे bromophenol नीले जेल की स्कैनिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में लोड हो रहा है रंगों के अन्य प्रकार के रूप में इस उद्देश्य के लिए आदर्श है। जेल Prerunning यह भी सुनिश्चित करने के लिए अमोनियम persulfate जेल नमूने लोड करने से पहले से निकाल दिया जाता है महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, पाली di-डीसी के उपयोग bindin के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैंfEMSAs में डीएनए जांच के साथ ब्याज की प्रोटीन की जी। ब्याज और लक्ष्य डीएनए अखंडता के लिए प्रोटीन की पवित्रता भी उनकी बातचीत के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह भी जब इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग कर सही स्कैनिंग सेटिंग सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। उचित ध्यान देने के लिए ऑफसेट और तीव्रता मानकों को जेल प्लेटें और डीएनए जांच की तीव्रता की मोटाई के अनुसार चयन कर रहे हैं।

पिछले प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट EMSAs 13,14 प्रदर्शन करने के लिए वर्णित किया गया है। हालांकि, इन प्रोटोकॉल di-डीसी के उपयोग की आवश्यकता है, और / या पंप पानी प्रसारित करने के लिए एक खास तापमान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक अधिक विस्तृत तरीका प्रदान करता है, और किसी भी पंप के उपयोग की आवश्यकता नहीं है।

इस प्रोटोकॉल के लिए भविष्य आवेदन वास्तविक समय में निगरानी प्रतियोगिता assays शामिल हैं। Fluorescently लेबल जांच, इस अतिरिक्त अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान के रूप में जैल अलग वैद्युतकणसंचलन समय अंक पर कई बार स्कैन किया जा सकताटीएस। इसके अलावा, ब्याज और प्रतियोगी जांच की डीएनए जांच के दो रंग इमेजिंग के लिए अनुमति अलग अवरक्त फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किया जा सकता है। सभी तकनीकों के साथ के रूप में, वहाँ फ्लोरोसेंट EMSAs उपयोग करने के लिए सीमाएं हैं। अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता के कारण पारंपरिक EMSAs की तुलना में प्रोटीन की उच्च सांद्रता की जरूरत है। एक और सीमा अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक पता लगाने के लिए उच्च संकल्प के साथ एक विशिष्ट इमेजिंग प्रणाली की आवश्यकता है। हालांकि प्रारंभिक लागत स्कैनर खरीद करने के लिए अधिक है, अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक लेबलिंग का लंबे समय तक इस्तेमाल लागत प्रभावी है। इन सीमाओं के बावजूद, फ्लोरोसेंट EMSAs महत्वपूर्ण जैविक सवालों को संबोधित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका प्रदान करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1  Bio-Rad 1610158 Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) ThermoFisher MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody  Sigma-Aldrich F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade New England Biolabs B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos Integrated DNA Technologies Custom DNA oligo These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-) New England Biolabs M0212S
LightShif Poly (dI-dC) ThermoFisher 20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell  Bio-Rad 1658000FC  This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System LI-COR Biotechnology Odyssey CLx Infrared Imagng System This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System  LI-COR Biotechnology Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0) LI-COR Biotechnology Image Studio software  This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript. 
Orange G Sigma-Aldrich O3756-25G
6x Orange loading dye 0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
  3. Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
  4. Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
  5. Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
  6. Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
  7. Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
  8. Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
  9. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  10. Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
  11. Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
  12. Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
  13. Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
  14. Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).

Tags

जैव रसायन अंक 117 फ्लोरोसेंट EMSA अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक अवरक्त इमेजिंग प्रणाली, एचएमजी बॉक्स प्रतिलेखन कारक postmitotic न्यूरोनल पहचान
Electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट रंजक लेबल oligonucleotides उपयोग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang,… More

Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (117), e54863, doi:10.3791/54863 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter