Introduction
Die Haupttodesursache Brustkrebs ist durch Metastase 1, 2. Taxane wie Docetaxel und Paclitaxel, werden derzeit als First-Line - Therapien bei der Behandlung von metastasierendem Brustkrebs 2, 3, 4, 5, 6 verwendet. Sie sind Teil einer Gruppe von Mikrotubuli-Targeting-Mittel (MTAs), die die Dynamik der Mikrotubuli stören. Allerdings ist eine der größten Herausforderungen für die Taxane in kurativen Therapie ist die Entwicklung von Taxan - Resistenz von Krebszellen unter Verwendung, die 7 bis Wiederauftreten der Krankheit führt. Arzneimittelresistenz ist für mehr als 90% aller Todesfälle bei Patienten mit metastasiertem Brustkrebs , 7.
Mikrotubuli sind durch die Polymerisation von α- und β-Tubulin-Heterodimeren gebildetclass = "xref"> 8, 9. Die genaue Regelung der Dynamik der Mikrotubuli ist wichtig für viele zelluläre Funktionen, einschließlich der Zellpolarisation, Zellzyklus, den intrazellulären Transport und Zellsignalisierung. Dysregulation von Mikrotubuli und deren Dynamik werden die Zellfunktion stören und führen in den Zelltod 10, 11. Je nachdem , wie sie diese Dysregulation verursachen kann MTA Medikamente entweder als Mikrotubuli stabilisierende Mittel eingestuft werden (dh Taxane) oder Mikrotubuli-destabalizing Mittel (dh, Vinca - Alkaloiden oder Colchicin-Bindungsstelle Mittel) 20. Trotz ihrer gegenläufigen Effekte auf Mikrotubuli Masse, bei einer ausreichenden Dosierung, beide Klassen können 21 Krebszellen durch ihre Auswirkungen auf die Dynamik der Mikrotubuli töten.
Taxane funktionieren in erster Linie durch die Mikrotubuli Spindel 12 zu stabilisieren, was zuchromosomale Fehlausrichtung. Die anschließende unaufhörlichen Aktivierung der Spindelanordnung checkpoint (SAC) hemmt die Zelle in die Mitose. Längerer mitotischen Arrest bewirkt dann , dass die Apoptose 13, 14. Taxan interagiert mit Mikrotubuli durch die Taxan - Bindungsstelle auf β-Tubulin - 8, 15, die im zusammengebauten Tubulin 16 nur vorhanden ist.
Mehrere Mechanismen für Taxan Widerstand haben 9 vorgeschlagen, 17. Diese Mechanismen umfassen sowohl allgemeine Multidrug - Resistenz durch die Überexpression von arzneimittel Efflux Proteine und Taxan-spezifischen Widerstand 5, 9, 18, 19. Beispielsweise Taxan-resistenten Krebszellen Expression und Funktion bestimmter β-Tub möglicherweise verändertulin Isotypen 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Durch die Verwendung eines in vivo - Verfahren Mikrotubuli dynamische Instabilität zu messen, zeigen wir , dass, wenn im Vergleich zu nicht-resistenten, elterliche MCF-7 - Zellen CC 17 die Mikrotubuli - Dynamik von Docetaxel-resistenten MCF-7 - Zellen zu TXT Docetaxel Behandlung unempfindlich sind.
Zum besseren Verständnis der Funktion von MTAs und der genaue Mechanismus der Taxan-Resistenz in Krebszellen zu verstehen, ist es wichtig, die Dynamik der Mikrotubuli zu messen. Hier berichten wir über eine in vivo - Methode, dies zu tun. Durch die Verwendung von Echtzeit- Bildgebung in Kombination mit der Expression von GFP-markierten Tubulin in Zellen, können wir die Dynamik der Mikrotubuli von MCF-7 TXT und MCF-7 CC - Zellen mit und wi messenthout Behandlung mit Docetaxel. Die Ergebnisse können uns wirksamer Medikamente helfen entwerfen, die Taxan Widerstand überwinden kann.
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Protocol
1. Vorbereitung der Zellen für Live-Imaging
- Zellkultur und Seeding
- Verwenden MCF-7 Brustkrebszellen , ausgewählt für die Resistenz gegen Docetaxel (MCF-7 TXT) und deren nicht-resistenten parentalen Zelllinie (MCF-7 CC). Die detaillierten Auswahlprozess und die Charakterisierung dieser ausgewählten Zelllinien wurden zuvor 24 beschrieben.
- Wachsen alle Zellen in 10 cm-Kulturschalen bei 37 ° C in einem Medium, 90% Dulbecco besteht modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und 10% fötales Rinderserum (FBS) und supplementiert mit nicht-essentiellen Aminosäuren. Pflegen Sie das Medium in einer 5% igen CO 2 -Atmosphäre. Pflegen MCF-7 TXT Zellen bei 5 nM Docetaxel.
- Seed-Zellen auf Deckgläser für die Live-Darstellung. Sterilisieren 24 mm poly-L-Lysin beschichteten Glasplättchen, indem sie mit 70% -igem Alkohol gespült und dann über Nacht sie UV ausgesetzt wird. Legen Sie die Deckgläser in einer 6-Well-Kulturplatte von 35 mm. Place ein Deckglas in jeder Vertiefung.
- Entfernen Sie das Medium aus dem 10-cm-Kulturschale und waschen Sie die Zellen mit PBS. Mit 0,5 ml Trypsin-EDTA in die Schale um die Zellen von der Schale zu lösen. 5 ml Kulturmedium in die Schale um das Trypsin nach der Ablösung der Zellen zu neutralisieren.
- Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer die Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit zu ermitteln.
- In etwa 10 5 Zellen in jede Vertiefung auf der Basis der Zellzahl pro Volumeneinheit. sanft, legte die Platte wieder in den Inkubator Nach Schütteln, damit die Zellen an den Deckgläsern zu befestigen.
- Expression von GFP-markierten α-Tubulin
- Zu testen Dynamik der Mikrotubuli, Transduktion der Zellen mit GFP-markierten α-Tubulin mit dem handelsüblichen GFP Transduktion Steuerung (zB BacMam) nach dem Protokoll des Herstellers.
- Kultur der Zellen in der Vertiefung für 36 h in einem 37 ° C Zellkulturinkubator com zu ermöglichenplete Adhäsion und 60% Konfluenz.
- Berechne den geeigneten Volumen GFP-markierten α-Tubulin zu jeder Vertiefung hinzugefügt, entsprechend der folgenden Gleichung:
Die Anzahl der Zellen ist, die geschätzte Gesamtzahl der Zellen in der Vertiefung zum Zeitpunkt der Markierung und der gewünschten PPC ist die Anzahl der Partikel pro Zelle.
HINWEIS: Die MCF-7 - Zellen Seeding sollte die Zellzahl 10 5 bis 2 x 10 5 mit einem gewünschten PPC 20 verdoppelt haben, das Volumen für jede Deck benötigt daher 40 & mgr; l. Für verschiedene Zellen, berechnet das Volumen auf der obigen Formel basiert möglicherweise nicht die beste sein. Das genaue Volumen sollte entsprechend der tatsächlichen Expression von GFP-Tubulin eingestellt werden. - Mische die GFP-markierten α-Tubulin mehrfach durch Umdrehen um eine homogene Lösung zu gewährleisten. Nicht mit dem Vortex.
HINWEIS: Für die Steuerung, die Null (Kontrolle) Reagens fehlt jede Säugetier genetischeElemente und können potentielle Baculovirus-vermittelte Effekte und Hintergrundfluoreszenz verwendet werden, bestimmen zu helfen. Eine nicht gezielt GFP Transduktion Kontrolle kann auch verwendet werden, die die gesamte Zelle leuchtet. - Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischem Medium. 2 mL des neuen Mediums und 40 ul GFP-markierten α-Tubulin zu jeder Vertiefung.
- Schütteln Sie die Platte vorsichtig vollständige Durchmischung von GFP-markierten α-Tubulin mit dem Kulturmedium zu ermöglichen. Bringen Sie die Platte mit dem Kultur-Inkubator und Inkubation für 24 h, um die Expression von GFP-Tubulin zu ermöglichen.
- Treat Zellen mit Docetaxel
Hinweis: Dieses Experiment wird die Wirkung von Docetaxel auf Mikrotubuli dynamische Instabilität zu testen. Somit werden die Zellen mit der gewünschten Konzentration von Docetaxel behandelt.- Bereiten Sie ein Medium, 90% DMEM und zu 10% der FBS und ergänzt mit nicht-essentiellen Aminosäuren. Verwenden Sie DMEM ohne Phenol rot, weil Phenolrot mit dem fluorescen störence von GFP-Tubulin. Fügen Sie die gewünschte Konzentration von Docetaxel (im Bereich von 10 nm bis 10 & mgr; M). Die Stammlösung von Docetaxel ist 10 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Vorwärmen der Docetaxel enthaltende Medium auf 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator.
- Ersetzen Sie die normalen Kulturmedium mit der Docetaxel-haltigen Medium und Inkubation für 30 min in der Gewebekultur-Inkubator. Es sollte für jeden Docetaxel-Konzentration mindestens 3 Deck pro Vertiefung sein.
2. Live-Imaging zu untersuchen Mikrotubuli dynamische Instabilität
- Einrichten des Systems
- Führen Experimente in einer Kammer bei 37 ° C und 5% CO 2 gehalten. Erwerben Fluoreszenzbilder von Zeitablauf mit einem mikroskopischen System mit einem 60X versehen, 1,42 NA Öl Objektivlinse auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop und mit einer CCD-Kamera.
- Legen Sie die Zellen für Livebild. Vorwärmen sowohl der Probenhalter unddas Medium auf 37 ° C. Wählen Sie ein Deckglas zu untersuchen. Montieren Sie das Deckglas von Interesse auf einem Probenhalter und Inkubation mit 1 ml der Docetaxel-haltigen Medium hergestellt in Schritt 1.3.1.
- Live - Bildgebung von Mikrotubuli dynamische Instabilität
- Identifizieren Sie die Zellen, die für die Bildgebung verwendet wird. Sie sollten flach sein, haben eine hohe Fluoreszenzintensität ausgedrückt GFP-Tubulin und haben klare Mikrotubuli-Strukturen.
- Wählen einer Zelle aus der Gruppe der identifizierten Zellen aus Schritt 2.2.1 zunächst zu untersuchen. Konzentrieren sich auf den Randbereich der identifizierten Zelle. Stellen Sie das Programm für die Belichtungszeit und die Häufigkeit der Bildaufnahme auf. Als Belichtungszeit gewöhnlich 0,5 s ist, werden die Bilder alle zwei s erfasst werden.
- Lassen Sie eine zusätzliche 20 Minuten für die Schritte von 1,33 bis 2.2.3. Somit genau 50 min nach der Zugabe von Docetaxel, wie in Schritt 1.3.3 beschrieben, beginnen imaging (dies für Normung).
- Notieren Sie sich die Mikrotubuli-dynamics für 2 Minuten, die ein Foto alle 2 s. Insgesamt erwerben 60 Bilder für die identifizierte Zelle.
- Gehen Sie zum nächsten identifizierten Zelle und wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 bis 2.2.4. Wiederholen Sie den Vorgang, bis 5 Zellen abgebildet wurden. Es ist zwingend notwendig, dies zu tun, bevor die Zeit 70 min nach der Zugabe von Docetaxel erreicht, wie es in Schritt 1.3.3 beschrieben.
- Für jede Behandlungsbedingung, wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 für 3 verschiedene Deck bis 2.2.5. Insgesamt Bild 15 Zellen, die genug Daten Mikrotubuli dynamische Instabilität zu messen.
3. Bildverarbeitung und Datenanalyse
- Deconvolution der Bilder
- Entfalten die aufgenommenen Bilder eine hohe Qualität zu erreichen. Öffnen Sie das Entfaltungsprogramm mit dem Mikroskopsystem ausgestattet.
- Klicken Sie auf "Bearbeiten" und wählen Sie "entfalten." Ziehen Sie die Datei in den "Input" Fenster und klicken Sie auf "Do" Die Bilddatei wird entfalteten und dieentfalteten Datei wird automatisch als neue Datei gespeichert werden.
- Die Erzeugung von Videos
- Klicken Sie auf die entfalteten Bilddatei mit ausgestatteter Software zu öffnen.
- Klicken Sie auf "Datei" und wählen Sie "als Film speichern". Wählen Sie den "Filmformat" als "AV" und "Animation-Stil" als "Forward". Stellen Sie die "Komprimierungsqualität" auf "100%" und der "Frame Rate" bis "5 / Sekunde."
- Überprüfen Sie die Schachtel "Animieren durch die Zeit" und klicken Sie auf "Do it." Das Video wird erzeugt werden.
- Die Messung der Mikrotubuli - Verkürzung und Wachstumsrate
- Identifizieren Sie die Mikrotubuli, die für die Messung verwendet wird. Für jede Zelle wird nur wenige Mikrotubuli Lage sein, ihre Verkürzung oder Wachstum haben klar und vollständig folgt.
- Untersuchen jeden Frame des Videos den Rahmen zu identifizieren, die die Ausgangslänge des Mikrotubuli a zeigtnd der Rahmen mit den meisten verlängert oder verkürzt Mikrotubuli. Messen der Änderung in der Länge zwischen den beiden Mikrotubuli und dem zwischen den beiden Rahmen verstrichene Zeit.
- Berechnen Sie die Geschwindigkeit des Wachstums oder der Verkürzung durch die Längenänderung durch Zeitteilung (die Einheit & mgr; m / s). Für jede Behandlungsbedingung, folgen mindestens 10 Zellen und mindestens 20 Mikrotubuli messen.
- Berechnen Sie den Mittelwert und der Standardfehler für jede Behandlungsbedingung. Analysieren Sie den statistischen Unterschied zwischen den Bedingungen des Student-Test. Melden Sie die Daten in einer Tabelle und / oder in einem Diagramm.
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Representative Results
Mit dem Protokoll hier vorgestellten, untersuchten wir die Wirkung von Docetaxel auf die Mikrotubuli - Dynamik der normalen (MCF-7 CC) und Docetaxel-resistenten (MCF-7 TXT) Brustkrebszellen. Zwei Sätze von Aufnahmen zeigen die Wirkung von Docetaxel (0,5 uM) auf Mikrotubuli Wachstum und Verkürzung in MCF-7 CC und MCF-7 - TXT - Zellen (1A).
Wir auch die Geschwindigkeit der Mikrotubulus - Wachstum oder Verkürzen unter diesen Bedingungen für die beiden Zelllinien berechnet , und zeigte , dass bei 0,5 uM, Docetaxel stark die Tubulin - Dynamik von MCF-7 - Zellen CC hemmt aber nicht MCF-7 TXT Zellen (1B).
Abbildung 1: Die Wirkung von Docetaxel auf die Mikrotubuli Dynamisches von MCF-7 TXT und MCF-7 CC - Zellen. Die Live-Bildgebung wurde wie beschrieben durchgeführt. (A) ausgewählte Bilder aus dem Echtzeit- Bildgebung der Dynamik der Mikrotubuli in MCF-7 CC und MCF-7 - TXT - Zellen nach Behandlung mit 0,5 uM Docetaxel für 1 h. Der Pfeil zeigt die Mikrotubuli erstreckt. Die Pfeilspitze zeigt die Verkürzung der Mikrotubuli. Größe bar = 5 um. (B) Die Ausdehnungsrate und die Verkürzung der Rate von Mikrotubuli wurden aus den aufgenommenen Bildern gemessen. Jeder Bezugspunkt ist der Durchschnitt von 20 Messungen von mindestens 8 verschiedenen Zellen. Die Fehlerbalken ist der Standardfehler. ** Gibt an, dass der Unterschied ist statistisch signifikant mit p <0,01. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Es gibt zwei Hauptmethoden Mikrotubuli dynamische Instabilität zu messen: in vitro und in vivo. In dem in vitro - Verfahren wird gereinigtes Tubulin verwendet Mikrotubuli dynamische Instabilität mit Computer-enhanced Zeitrafferdifferentialinterferenzkontrastmikroskopie zu messen. In dem in vivo - Verfahren, mikroinjiziert Fluoreszenz Tubulin oder Tubulin-GFP exprimiert, in Mikrotubuli eingebaut. Die Dynamik (Wachstum und Verkürzung) der Mikrotubuli wird dann durch Zeitraffer unter Verwendung einer empfindlichen Kamera in dem peripheren Bereich der Interphase - Zellen 10, 20, 25 aufgezeichnet. Während verschiedene Arten von Mikroskopen wurden für diesen Zweck verwendet wurde, verwendet das Protokoll berichteten wir hier eine Dekonvolution Mikroskop.
In vivo tritt dynamische Instabilität nur an Mikrotubuli und Enden (die Enden mit der β-Tubulin nach außen), währenddie Minus - Enden (die Enden mit dem α-Tubulin nach außen) bleiben die gleiche Länge 26. Auf der anderen Seite, für montierte Mikrotubuli in vitro tritt dynamische Instabilität an beiden Enden der Mikrotubuli, mit dem Plus Enden robustere ist als der minus 27 endet. Der Hauptvorteil der Analyse dynamischer Instabilität in vitro ist , dass es mechanistische Information über die spezifische Rolle der verschiedenen Agenten auf die Dynamik der Mikrotubuli in Abwesenheit von zellulären MAPs liefert. Darüber hinaus unter in vitro Bedingungen können dynamische Instabilität an beiden Enden untersucht werden. Dies liefert einen Einblick in die Mechanismen, mit denen Medikamente oder regulatorische Proteine Mikrotubuli Stabilität an den gegenüberliegenden Enden beeinflussen. Historisch gesehen , sind die Enden minus nachgeführt viel weniger als das plus 10 endet. Ein großer Teil unseres Verständnisses von Mikrotubuli Verhalten kommt aus Studien über Mikrotubuli aus gereinigtem Tubulin in vitro zusammengebaut. Während jedoch viele der grundlegenden Prinzipien der Mikrotubuli Verhalten aus diesen Studien gewonnen auch an Mikrotubuli in Zellen angewandt werden können, gibt es gewisse Unterschiede in Dynamik der Mikrotubuli zwischen in vitro und in vivo. In Zellen, wachsen Mikrotubuli oft zu einem fünf- bis zehnfach höheren Geschwindigkeit und Übergänge zwischen Wachstum und / oder Verkürzung auftreten ~ 10 - mal häufiger als mit Mikrotubuli aus gereinigtem Tubulin in vitro zusammengebaut. Es gibt auch dramatische Veränderungen in microtubule Organisation und Dynamik während des Zellzyklus, die einen hohen Grad der räumlichen und zeitlichen Regulation der zellulären Mikrotubuli Verhalten widerspiegeln. Dieses Verhalten kann nicht durch in - vitro - Forschung untersucht werden. Darüber hinaus ist die Regelung der Dynamik der Mikrotubuli von Tubulin posttranslationale Modifikation, Tubulin Isotyp Ausdruck erreicht, und eine große Gruppe von MAPs und anderen Mikrotubuli-interagierende Proteine, die entweder stabilisieren oder Mikro destabilisierenTubuli 28, 29. Daher wird in lebenden Zellen Mikrotubuli Instabilität des Studiums ist viel mehr physiologisch anwendbar.
Das hier beschriebene Verfahren ist ein einfaches und sehr zuverlässiges Protokoll Dynamik der Mikrotubuli in lebenden Zellen zu studieren. Die Schritte, die mehr Aufmerksamkeit erfordern, sind die Auswahl der Zelle für die Beobachtung und die Bestimmung der Belichtungszeit. Es ist entscheidend, um Zellen auszuwählen, die flach sind und eine hohe Fluoreszenzintensität von GFP-Tubulin haben. Es ist auch wünschenswert, die Intensität der Anregung und die Belichtungszeit zu vermeiden, das Verblassen der GFP-Fluoreszenz zu reduzieren. Sicherlich, wie alle anderen in vivo - Verfahren ist dieses Protokoll nicht geeignet Mikrotubuli dynamische Instabilität unter verschiedenen manipulierten Bedingungen zu studieren. Zum Beispiel können verschiedene Isoformen von α- und β-Tubulin verhalten sich anders in Bezug auf die Dynamik der Mikrotubuli. Nur in vitro - Methoden können s verwendet werdentudy die Auswirkungen der einzelnen gereinigten Tubulin-Isoformen auf Mikrotubuli dynamische Instabilität. Darüber hinaus, verglichen mit dem Mikroinjektion von fluoreszenzmarkierten Tubulin, die Expression von GFP-markiertes Tubulin durch Transfektion oder Transduktion von Plasmiden, eine relativ niedrigere Signal-zu-Rausch-Verhältnis aufweisen können. Die Expression von GFP-markierten Tubulin in Zellen durch Transfektion oder Transduktion von Plasmiden ermöglicht mehr Freiheit experimentell andere zelluläre Eigenschaften verändern.
Das Protokoll hier berichtet könnte für verschiedene Untersuchungen verwendet werden. Einerseits kann es neu und kritische Erkenntnisse in Bezug auf die Funktion der Mikrotubuli während der verschiedenen Phasen des Zellzyklus, insbesondere in der Mitose bereitzustellen. Sie kann auch zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener zellulärer Prozesse, wie Migration verwendet werden, auf die Dynamik der Mikrotubuli. Auf der anderen Seite kann es verwendet werden, um die Wirkungen verschiedener Mikrotubuli-Inhibitoren zu untersuchen (viele von ihnen sind Krebsmedikamente) auf die Dynamik der Mikrotubuli in normalen undKrebszellen unter mehr physiologischen Bedingungen. Wir haben dieses Verfahren verwendet, um die Wirkungen von verschiedenen anti-mitotische Krebsmedikamente auf Mikrotubuli dynamische Instabilität in beiden Docetaxel fest und nicht Docetaxel resistent Brustkrebszellen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
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