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Cancer Research

लाइव इमेजिंग अध्ययन करने के लिए taxane प्रतिरोधी स्तन कैंसर में microtubule गतिशील अस्थिरता

Published: February 20, 2017 doi: 10.3791/55027
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Introduction

स्तन कैंसर से मृत्यु का प्रमुख कारण मेटास्टेसिस 1, 2 के माध्यम से है। ऐसे docetaxel और Paclitaxel के रूप में Taxanes, वर्तमान में पहली पंक्ति के रूप में metastatic स्तन कैंसर 2, 3, 4, 5, 6 के उपचार में regimens किया जाता है। वे microtubule को लक्षित एजेंट (एमटीए) कि microtubule गतिशीलता को बाधित के एक समूह का हिस्सा हैं। हालांकि, उपचारात्मक चिकित्सा में taxanes उपयोग करने के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक कैंसर की कोशिकाओं में taxane प्रतिरोध है, जो रोग की पुनरावृत्ति 7 की ओर जाता है का विकास है। ड्रग प्रतिरोध metastatic स्तन कैंसर 7 के साथ मरीजों के बीच सभी मौतों के 90% से अधिक के लिए खातों।

सूक्ष्मनलिकाएं α- और β ट्यूबिलिन heterodimers के polymerization द्वारा गठित कर रहे हैंवर्ग = "xref"> 8, 9। microtubule गतिशीलता के सटीक विनियमन सेल ध्रुवीकरण, कोशिका चक्र प्रगति, intracellular परिवहन, और संकेतन सेल सहित कई सेलुलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है। सूक्ष्मनलिकाएं और उनकी गतिशीलता का अनियंत्रण सेल समारोह को बाधित और कोशिका मृत्यु 10, 11 में परिणाम होगा। कैसे वे इस अनियंत्रण कारण के आधार पर, एमटीए दवाओं या तो microtubule स्थिर एजेंट (यानी, taxanes) या microtubule-destabalizing एजेंट (यानी, Vinca alkaloids या colchicine साइट पर बाध्यकारी एजेंट) 20 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। Microtubule बड़े पैमाने पर अपने विपरीत प्रभाव के बावजूद, एक पर्याप्त मात्रा में, दोनों वर्गों कैंसर की कोशिकाओं को microtubule गतिशीलता 21 पर उनके प्रभाव के माध्यम से मार सकते हैं।

Taxanes microtubule धुरी 12 स्थिर द्वारा मुख्य रूप से कार्य करते हैं, के लिए अग्रणीगुणसूत्र misalignment। धुरी विधानसभा चौकी (सैक) के बाद सदा सक्रियण बँटवारा में सेल गिरफ्तारी। लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी तो apoptosis 13, 14 का कारण बनता है। Taxane β ट्यूबिलिन 8, 15, जो इकट्ठे tubulin 16 में ही मौजूद है पर taxane बाध्यकारी साइट के माध्यम से सूक्ष्मनलिकाएं के साथ सूचना का आदान प्रदान।

Taxane प्रतिरोध के लिए एकाधिक तंत्र, 17 9 प्रस्तावित किया गया है। ये तंत्र दवा तपका प्रोटीन और taxane-विशिष्ट प्रतिरोध 5, 9, 18, 19 की overexpression के कारण दोनों को सामान्य बहुऔषध प्रतिरोध में शामिल हैं। उदाहरण के लिए, taxane प्रतिरोधी कैंसर की कोशिकाओं को अभिव्यक्ति और कुछ β-टब के समारोह में परिवर्तित हो सकता हैUlin 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23 isotypes। एक विवो विधि का उपयोग microtubule गतिशील अस्थिरता को मापने के लिए करके, हम बताते हैं कि, जब गैर-प्रतिरोधी, माता पिता का MCF 7 सीसी कोशिकाओं की तुलना में 17, docetaxel प्रतिरोधी MCF 7 TXT कोशिकाओं की गतिशीलता microtubule docetaxel उपचार के लिए असंवेदनशील हैं।

बेहतर एमटीए के समारोह और कैंसर कोशिकाओं में taxane-प्रतिरोध की सटीक व्यवस्था को समझने के लिए, यह microtubule गतिशीलता को मापने के लिए आवश्यक है। यहाँ, हम ऐसा करने का एक विवो विधि की रिपोर्ट। कोशिकाओं में GFP टैग tubulin की अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में रहते इमेजिंग का उपयोग करके, हम MCF 7 TXT और साथ MCF 7 सीसी कोशिकाओं और वाई के microtubule गतिशीलता उपाय कर सकते हैंthout docetaxel उपचार। परिणाम हमें और अधिक प्रभावी दवाओं है कि taxane प्रतिरोध पर काबू पाने कर सकते हैं डिजाइन कर सकते हैं।

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Protocol

1. रहते इमेजिंग के लिए कक्षों की तैयारी

  1. सेल संस्कृति और बोने
    1. Docetaxel (एमसीएफ-7 TXT) और उनके गैर-प्रतिरोधी पैतृक सेल लाइन (एमसीएफ-7 सीसी) के प्रतिरोध के लिए चयन किया MCF 7 स्तन कैंसर की कोशिकाओं का प्रयोग करें। विस्तृत चयन प्रक्रिया और इन चयनित सेल लाइनों के लक्षण वर्णन में पहले 24 में वर्णित किया गया।
    2. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 10% से 90% की रचना की और गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक एक माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेमी संस्कृति बर्तन में सभी कोशिकाओं को विकसित। एक 5% सीओ 2 माहौल में मध्यम बनाए रखें। 5 एनएम docetaxel पर MCF 7 TXT कोशिकाओं को बनाए रखें।
    3. लाइव इमेजिंग के लिए coverslips पर बीज कोशिकाओं। उन्हें 70% शराब के साथ rinsing और फिर रात भर यूवी करने के लिए उन्हें उजागर द्वारा 24 मिमी पाली एल Lysine लेपित गिलास coverslips जीवाणुरहित। coverslips 35 मिमी के 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में रखें। Plप्रत्येक कुएं में एक coverslip ऐस।
    4. 10 सेमी संस्कृति पकवान से मध्यम निकालें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। trypsin-EDTA के 0.5 एमएल पकवान में जोड़ने पकवान से कोशिकाओं को अलग करने के लिए। संस्कृति के माध्यम से 5 एमएल पकवान में जोड़ने कोशिकाओं की टुकड़ी निम्नलिखित trypsin बेअसर।
    5. एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना प्रति इकाई मात्रा सेल की संख्या निर्धारित करने के लिए।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से प्रति इकाई मात्रा सेल नंबर के आधार पर करने के लिए लगभग 10 5 कोशिकाओं जोड़ें। यह धीरे मिलाने के बाद, इनक्यूबेटर में वापस थाली रख दिया कोशिकाओं coverslips को संलग्न करने की अनुमति है।
  2. GFP टैग α ट्यूबिलिन की अभिव्यक्ति
    1. Microtubule गतिशीलता परख करने के लिए, वाणिज्यिक GFP पारगमन नियंत्रण (जैसे, BacMam) निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार साथ GFP टैग α ट्यूबिलिन के साथ कोशिकाओं transduce।
    2. संस्कृति एक 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 36 घंटे के लिए अच्छी तरह से कोशिकाओं कॉम अनुमति देने के लिएplete आसंजन और 60% संगम।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए, निम्न समीकरण के अनुसार GFP टैग α ट्यूबिलिन की उचित मात्रा की गणना:
      समीकरण
      कोशिकाओं की संख्या अनुमानित कुल लेबलिंग के समय में अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या है और वांछित पीपीसी सेल प्रति कणों की संख्या है।
      नोट: MCF 7 कोशिकाओं सीडिंग 20 के एक वांछित पीपीसी के साथ 10 5 से 2 x 10 5 से कोशिकाओं की संख्या दोगुनी हो जाना चाहिए, मात्रा प्रत्येक coverslip के लिए आवश्यक है इसलिए 40 μL है। विभिन्न कोशिकाओं के लिए, मात्रा उपरोक्त सूत्र के आधार पर गणना सबसे अच्छा नहीं हो सकता है। सटीक मात्रा GFP ट्यूबिलिन की वास्तविक अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
    4. उलटा द्वारा GFP टैग α ट्यूबिलिन कई बार मिश्रण एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए। भंवर मत करो।
      नोट: नियंत्रण के लिए, अशक्त (नियंत्रण) अभिकर्मक किसी भी स्तनधारी आनुवंशिक का अभावतत्वों और निर्धारित संभावित baculovirus की मध्यस्थता प्रभाव और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक गैर लक्षित GFP पारगमन नियंत्रण भी इस्तेमाल किया जा सकता है, जो पूरे सेल प्रकाश होगा।
    5. ताजा माध्यम के साथ संस्कृति के माध्यम से बदलें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए GFP टैग α ट्यूबिलिन के नए माध्यम के 2 एमएल और 40 μL जोड़ें।
    6. प्लेट धीरे हिला संस्कृति के माध्यम से GFP टैग α ट्यूबिलिन का पूरा मिश्रण की अनुमति है। संस्कृति इनक्यूबेटर थाली लौटें और 24 घंटे के लिए सेते GFP ट्यूबिलिन की अभिव्यक्ति की अनुमति है।
  3. Docetaxel के साथ व्यवहार कोशिकाओं
    नोट: इस प्रयोग microtubule गतिशील अस्थिरता पर docetaxel के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए है। इस प्रकार, कोशिकाओं docetaxel के वांछित एकाग्रता के साथ व्यवहार कर रहे हैं।
    1. एक मध्यम DMEM के 90% और 10% FBS की रचना की और गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक तैयार करें। फिनोल लाल के बिना DMEM प्रयोग करें क्योंकि फिनोल लाल fluorescen के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैंGFP ट्यूबिलिन के सीई। docetaxel (10 एनएम से 10 माइक्रोन से लेकर) के वांछित एकाग्रता जोड़ें। docetaxel के शेयर समाधान डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 10 मिमी है।
    2. पूर्व गर्म टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक docetaxel युक्त मध्यम।
    3. docetaxel युक्त मध्यम के साथ सामान्य संस्कृति के माध्यम से बदलें और टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेते हैं। प्रत्येक docetaxel एकाग्रता के लिए अच्छी तरह से प्रति कम से कम 3 coverslips होना चाहिए।

2. लाइव इमेजिंग microtubule गतिशील अस्थिरता की जांच करने के लिए

  1. प्रणाली की स्थापना
    1. एक कक्ष 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर बनाए रखा में प्रयोगों का प्रदर्शन। एक सूक्ष्म प्रणाली एक 60x, एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर और एक सीसीडी कैमरा के साथ 1.42 एनए तेल उद्देश्य लेंस के साथ सुसज्जित के साथ समय व्यतीत हो जाने से प्रतिदीप्ति छवियों मोल।
    2. लाइव इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को निर्धारित करें। पूर्व गर्म दोनों नमूना धारक और37 डिग्री सेल्सियस के लिए मध्यम। जांच करने के लिए एक coverslip चुनें। एक नमूना धारक पर ब्याज की coverslip माउंट और कदम 1.3.1 में तैयार docetaxel युक्त मध्यम के 1 एमएल के साथ यह सेते हैं।
  2. Microtubule गतिशील अस्थिरता का लाइव इमेजिंग
    1. कोशिकाओं है कि इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा पहचानें। वे सपाट होना चाहिए, व्यक्त GFP ट्यूबिलिन के एक उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता है, और स्पष्ट microtubule संरचना है।
    2. पहली जांच करने के लिए कदम 2.2.1 से पहचान की कोशिकाओं के समूह से एक कक्ष का चयन करें। पहचान सेल के परिधीय क्षेत्र पर ध्यान दें। जोखिम समय के लिए कार्यक्रम और छवि के अधिग्रहण की आवृत्ति सेट करें। जोखिम समय आमतौर पर 0.5 है, छवियों हर दो रों का अधिग्रहण किया जाएगा।
    3. 1.33 से 2.2.3 के लिए कदम के लिए एक अतिरिक्त 20 मिनट की अनुमति दें। इस प्रकार, वास्तव में docetaxel के अलावा के बाद 50 मिनट, कदम 1.3.3 में वर्णित है, शुरू इमेजिंग (इस मानकीकरण के लिए है)।
    4. रिकॉर्ड microtubule घynamics 2 मिनट के लिए, एक तस्वीर लेने के लिए हर 2 से। कुल में, पहचान सेल के लिए 60 छवियों का अधिग्रहण।
    5. अगले पहचान सेल में ले जाएँ और दोहराने कदम 2.2.4 के लिए 2.2.2। प्रक्रिया दोहराएँ जब तक 5 कोशिकाओं imaged किया गया है। यह ऐसा करने के लिए जरूरी है समय से पहले, कदम 1.3.3 में वर्णित के रूप में docetaxel के अलावा के बाद 70 मिनट तक पहुँचता है।
    6. प्रत्येक उपचार हालत के लिए, दोहराने कदम 2.2.1 3 अलग coverslips के लिए 2.2.5 करने के लिए। कुल में, छवि 15 कोशिकाओं, microtubule गतिशील अस्थिरता को मापने के लिए पर्याप्त डेटा है।

3. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण

  1. छवियों की Deconvolution
    1. एक उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए अधिग्रहीत छवियों Deconvolve। deconvolution माइक्रोस्कोप प्रणाली से लैस कार्यक्रम खोलें।
    2. "प्रक्रिया" क्लिक करें और चुनें "Deconvolve।" "इनपुट" खिड़की करने के लिए छवि फ़ाइल खींचें और क्लिक करें "करो" छवि फ़ाइल deconvolved किया जाएगा, औरdeconvolved फ़ाइल स्वचालित रूप से एक नई फ़ाइल के रूप में सहेजा जाएगा।
  2. वीडियो की पीढ़ी
    1. सुसज्जित सॉफ्टवेयर के साथ खोलने के लिए deconvolved छवि फ़ाइल पर क्लिक करें।
    2. "फाइल" क्लिक करें और "फिल्म के रूप में सहेजें।" "ए वी" और "एनीमेशन शैली" के रूप में "मूवी प्रारूप" का चयन करें "आगे।" "संपीड़न गुणवत्ता" "100%" और "फ्रेम दर" करने के लिए सेट "5 / दूसरा।"
    3. "समय के माध्यम से चेतन" और क्लिक के बॉक्स को चेक करें "यह मत करो।" वीडियो उत्पन्न हो जाएगा।
  3. Microtubule छोटा करने और विकास दर के मापन
    1. सूक्ष्मनलिकाएं कि माप के लिए इस्तेमाल किया जाएगा पहचानें। प्रत्येक कक्ष के लिए, केवल कुछ ही सूक्ष्मनलिकाएं उनकी कमी या वृद्धि स्पष्ट रूप से और पूरी तरह से पालन किया है करने में सक्षम हो जाएगा।
    2. वीडियो के प्रत्येक फ्रेम की जांच करना फ्रेम कि microtubule एक के शुरुआती लंबाई से पता चलता पहचान करने के लिएएन डी सबसे बढ़ाया या छोटा microtubule के साथ फ्रेम। दो सूक्ष्मनलिकाएं और समय दो फ्रेम के बीच गुजरे बीच की लंबाई में परिवर्तन को मापने।
    3. समय से लंबाई में परिवर्तन को विभाजित करके विकास या छोटा करने की दर की गणना (इकाई माइक्रोन / एस) है। प्रत्येक उपचार हालत के लिए, कम से कम 10 कोशिकाओं का पालन करें और कम से कम 20 सूक्ष्मनलिकाएं उपाय।
    4. प्रत्येक उपचार हालत के लिए औसत और मानक त्रुटि की गणना। छात्र परीक्षण का उपयोग कर स्थितियों के बीच अंतर सांख्यिकीय विश्लेषण। एक तालिका में और / या एक चार्ट में डेटा रिपोर्ट।

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Representative Results

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम सामान्य (एमसीएफ-7 सीसी) और docetaxel प्रतिरोधी (एमसीएफ-7 TXT) स्तन कैंसर की कोशिकाओं की गतिशीलता पर microtubule docetaxel के प्रभावों का अध्ययन किया। छवियों के दो सेट MCF 7 सीसी और MCF 7 TXT कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) में microtubule विकास और छोटा करने पर docetaxel (0.5 माइक्रोन) के के प्रभाव को दिखाने के लिए।

हम भी दो सेल लाइनों के लिए इन शर्तों के तहत microtubule विकास या छोटा करने की दर की गणना की और पता चला कि 0.5 सुक्ष्ममापी पर, docetaxel जोरदार MCF 7 सीसी कोशिकाओं की गतिशीलता tubulin नहीं बल्कि MCF 7 TXT कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) को रोकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: microtubule गतिशील पर Docetaxel का प्रभावMCF 7 TXT और MCF 7 सीसी प्रकोष्ठों के एस। लाइव इमेजिंग के रूप में वर्णित किया गया था। (ए) MCF 7 सीसी और 1 घंटे के लिए 0.5 माइक्रोन के docetaxel साथ इलाज के बाद MCF 7 TXT कोशिकाओं में microtubule गतिशीलता का जीना इमेजिंग से चयनित छवियों। तीर का विस्तार सूक्ष्मनलिकाएं इंगित करता है। नोक छोटा सूक्ष्मनलिकाएं इंगित करता है। साइज बार = 5 माइक्रोन। (बी) के विस्तार की दर और सूक्ष्मनलिकाएं का छोटा दर दर्ज की छवियों से मापा गया। प्रत्येक दत्त कम से कम 8 विभिन्न कोशिकाओं से 20 माप का औसत है। त्रुटि पट्टी मानक त्रुटि है। ** इंगित करता है कि अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है, पी <0.01 के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इन विट्रो में और vivo में: वहाँ दो प्रमुख तरीके microtubule गतिशील अस्थिरता को मापने के लिए कर रहे हैं। इन विट्रो विधि में, शुद्ध tubulin कंप्यूटर बढ़ाया समय चूक अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी के साथ microtubule गतिशील अस्थिरता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। इन विवो विधि में, फ्लोरोसेंट tubulin microinjected, या GFP ट्यूबिलिन व्यक्त की, सूक्ष्मनलिकाएं में शामिल किया है। सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता (विकास और छोटा) तो अंतरावस्था कोशिकाओं 10, 20, 25 के परिधीय क्षेत्र में एक संवेदनशील कैमरे का उपयोग कर समय व्यतीत द्वारा दर्ज की गई है। माइक्रोस्कोप के विभिन्न प्रकार इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया गया है, प्रोटोकॉल हम यहां बताया एक deconvolution माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है।

विवो में, गतिशील अस्थिरता केवल microtubule प्लस समाप्त होता है (β ट्यूबिलिन जावक का सामना करना पड़ के साथ समाप्त होता है) पर होता है, जबकिशून्य से समाप्त होता है (α ट्यूबिलिन जावक का सामना करना पड़ के साथ समाप्त होता है) एक ही लंबाई 26 में रहते हैं। दूसरी ओर, इन विट्रो में इकट्ठे सूक्ष्मनलिकाएं के लिए, गतिशील अस्थिरता सूक्ष्मनलिकाएं के दोनों सिरों पर होता है, के साथ साथ समाप्त होता है और अधिक मजबूत की तुलना में शून्य से समाप्त हो जाती है 27 होने के साथ। इन विट्रो में गतिशील अस्थिरता का विश्लेषण करने का मुख्य लाभ यह है कि यह विशिष्ट सेलुलर नक्शे के अभाव में microtubule गतिशीलता पर विभिन्न एजेंटों की भूमिका के बारे में यंत्रवत जानकारी प्रदान करता है। इसके अलावा, इन विट्रो की शर्तों के तहत, गतिशील अस्थिरता दोनों सिरों पर अध्ययन किया जा सकता है। यह तंत्र है जिसके द्वारा दवाओं या नियामक प्रोटीन विपरीत छोर पर microtubule स्थिरता को प्रभावित में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। ऐतिहासिक, शून्य से समाप्त होता है बहुत कम प्लस समाप्त होता है 10 से ट्रैक किए गए हैं। Microtubule व्यवहार के बारे में हमारी समझ के ज्यादातर इन विट्रो में शुद्ध tubulin से इकट्ठा सूक्ष्मनलिकाएं पर अध्ययन से आता है। हालांकि, microtubule व्यवहार के बुनियादी सिद्धांतों इन अध्ययनों से प्राप्त के कई लोग भी कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिकाएं को लागू किया जा सकता है, वहाँ इन विट्रो और इन विवो के बीच में microtubule गतिशीलता में कुछ मतभेद हैं। कोशिकाओं में, सूक्ष्मनलिकाएं अक्सर करने के लिए एक पांच से बढ़ने तेज दर दस गुना है, और विकास और / या छोटा बीच संक्रमण इन विट्रो में शुद्ध tubulin से इकट्ठा सूक्ष्मनलिकाएं के साथ अधिक से अधिक बार ~ 10 बार होते हैं। वहाँ भी सेल चक्र के दौरान microtubule संगठन में नाटकीय परिवर्तन और गतिशीलता है, जो सेलुलर microtubule व्यवहार के स्थानिक और लौकिक विनियमन के एक उच्च डिग्री को प्रतिबिंबित कर रहे हैं। यह व्यवहार में इन विट्रो अनुसंधान के द्वारा अध्ययन नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, microtubule गतिशीलता के विनियमन tubulin posttranslational संशोधन, tubulin निर्धारण अभिव्यक्ति, और नक्शे और अन्य microtubule-बातचीत प्रोटीन का एक बड़ा समूह है कि या तो स्थिर या सूक्ष्म को अस्थिर करके हासिल की है28 नलिकाओं, 29। इसलिए, जीवित कोशिकाओं में microtubule अस्थिरता का अध्ययन बहुत अधिक physiologically लागू है।

विधि यहाँ वर्णित जीवित कोशिकाओं में microtubule गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक सरल और बहुत विश्वसनीय प्रोटोकॉल है। कदम है कि अधिक ध्यान देने की जरूरत अवलोकन के लिए सेल के चयन और जोखिम समय के निर्धारण कर रहे हैं। यह कोशिकाओं है कि फ्लैट हैं का चयन करें और GFP ट्यूबिलिन के उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी उत्तेजना की तीव्रता और जोखिम समय GFP प्रतिदीप्ति की लुप्त होती बचने के लिए कम करने के लिए वांछनीय है। निश्चित रूप से, विवो तरीकों में अन्य सब की तरह, इस प्रोटोकॉल नहीं विभिन्न छेड़छाड़ की शर्तों के तहत microtubule गतिशील अस्थिरता का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। उदाहरण के लिए, α- और β ट्यूबिलिन के विभिन्न isoforms microtubule गतिशीलता के संदर्भ में अलग तरह से व्यवहार कर सकता है। केवल इन विट्रो तरीकों में करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताtudy microtubule गतिशील अस्थिरता पर व्यक्तिगत शुद्ध tubulin isoforms के प्रभाव। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति लेबल tubulin के microinjection के साथ तुलना में, अभिकर्मक या plasmids के पारगमन द्वारा GFP टैग tubulin की अभिव्यक्ति के एक अपेक्षाकृत कम संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदर्शन कर सकते हैं। हालांकि, अभिकर्मक या plasmids के पारगमन द्वारा कोशिकाओं में GFP टैग tubulin की अभिव्यक्ति अधिक स्वतंत्रता प्रयोगात्मक अन्य सेलुलर विशेषताओं को बदलने के लिए अनुमति देता है।

प्रोटोकॉल यहां बताया विभिन्न अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक तरफ, यह कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों के दौरान सूक्ष्मनलिकाएं के समारोह के बारे में उपन्यास और महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, विशेष रूप से बँटवारा में। यह भी इस तरह के पलायन के रूप में विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं, के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए microtubule गतिशीलता पर इस्तेमाल किया जा सकता है। दूसरी ओर, यह (उनमें से कई कैंसर दवाओं रहे हैं) microtubule गतिशीलता पर सामान्य में विभिन्न microtubule अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है औरअधिक शारीरिक शर्तों के तहत कैंसर कोशिकाओं। हम दोनों docetaxel प्रतिरोधी और गैर-docetaxel प्रतिरोधी स्तन कैंसर की कोशिकाओं में microtubule गतिशील अस्थिरता पर विभिन्न विरोधी mitotic कैंसर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Non-essential amino acids Life Technologies, Invitrogen 11140-050
FBS Gibco, Invitrogen 12483
Anti-Anti (100x) Life Technologies, Invitrogen 15240-062
docetaxel Sigma-Aldrich 01885-5mg-F
DMEM phenol red-free Gibco, Invitrogen 21063
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin ThermoFisher Scientific C10613 Key reagent for expressing GFP tubulin in cells
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP ThermoFisher Scientific B10383 Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich+B9:AA9 472301 for dissoving decetaxel
22-mm glass coveslip Fisher Scientifics 12-545-101
6-well culture plate Greiner Bio-One International 6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems GE Health This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific Hausser Scientific, Distributed by VWR Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172

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References

  1. Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
  2. Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
  3. Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
  4. Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
  5. Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
  6. Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
  7. Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
  8. Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
  9. McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
  10. Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
  11. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
  12. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  13. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
  14. Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
  15. Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
  16. Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
  17. Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
  18. Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
  19. Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
  20. Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
  21. Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
  22. Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
  23. Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
  24. Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
  25. Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
  26. Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
  27. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  28. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  29. Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).

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कैंसर रिसर्च अंक 120 ट्यूबिलिन microtubule microtubule गतिशील अस्थिरता स्तन कैंसर taxane प्रतिरोध Docetaxel लाइव इमेजिंग, और GFP ट्यूबिलिन
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Wang, R., Wang, H., Wang, Z. Live… More

Wang, R., Wang, H., Wang, Z. Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers. J. Vis. Exp. (120), e55027, doi:10.3791/55027 (2017).

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