Summary
Epigenetiske faktorer kan interagere med genetiske programmer til at modulere genekspression og regulere B-cellefunktion. Ved at kombinere in vitro B-celle stimulation, qRT-PCR, og høj overførselshastighed mikroRNA-sekvens og mRNA-sekvensen tilgange, kan vi analysere den epigenetiske graduering af miRNA og gen udtryk i B-celler.
Abstract
Antistof svar er udført gennem flere kritiske B celle-iboende processer, herunder somatiske hypermutation (SHM), klasse-skifte DNA rekombination (CSR) og plasma Celledifferentiering. I de seneste år, har epigenetiske ændringer eller faktorer, såsom Histon deacetylation og MicroRNA (miRNAs), vist at interagere med B-celle genetiske programmer på figur antistof reaktioner, mens dysfunktion af epigenetiske faktorer har vist sig for at føre til autoantistof svar. Analysere genome-wide miRNA og mRNA udtryk i B celler som reaktion på epigenetiske modulatorer er vigtigt for at forstå den epigenetiske regulering af B-celle funktion og antistof respons. Her viser vi en protokol for inducerende B-celler til at gennemgå CSR og plasma celle differentiering, behandling af disse B-celler med Histon deacetylase (HDAC) hæmmere (HDIs) og analysere mRNA og microRNA expression. I denne protokol, vi direkte analysere supplerende DNA (cDNA) sekvenser ved hjælp af næste generations mRNA sekventering (mRNA-seq) og miRNA-seq teknologier, kortlægning af Sekventeringen læser til genom og kvantitative reverse transkription (qRT)-PCR. Med disse tilgange, har vi defineret i B celler inducerede underkastes CSR og plasma Celledifferentiering, HDI, en epigenetisk regulator, selektivt modulerer miRNA og mRNA udtryk og ændrer CSR og plasma celle differentiering.
Introduction
Epigenetiske mærker eller faktorer, såsom DNA methylering, Histon posttranslationelle ændringer og ikke-kodende RNA'er (herunder MicroRNA), modulere cellefunktion ved at ændre gen expression1. Epigenetiske ændringer regulere B-lymfocytter funktion, som immunoglobulin klasse-skifte DNA rekombination (CSR), somatiske hypermutation (SHM) og differentiering til hukommelse B celler eller plasma celler, hvorved modulerende antistof og autoantistof svar2,3. CSR og SHM kræver kritisk aktivering-induceret cytidine deaminase (støtte, kodes som Aicda), som er yderst induceret i B celler som reaktion på T-afhængige og T-uafhængig antigener4. Klasse-skiftet/hypermutated B celler yderligere differentiere sig til plasmaceller, der udskiller store mængder af antistoffer i en mode kritisk afhængig af B-lymfocytter-induceret modning protein 1 (Blimp1, kodes som Prdm1)5. Unormal epigenetiske ændringer i B-celler kan medføre afvigende antistof/autoantistof svar, hvilket kan føre til allergisk reaktion eller autoimmunitet1,4. Forstå hvordan epigenetiske faktorer, såsom miRNAs, modulere B celle-iboende genekspression er ikke kun vigtigt for vaccine udvikling, men er også afgørende for at afsløre mekanismerne af potentielle unormale antistof/autoantistof reaktioner.
Histon acetylation og deacetylation er ændringer af lysin rester på Histon proteiner typisk katalyseret af Histon acetyltransferase (HAT) og Histon deacetylase (HDAC). Disse ændringer fører til stigende eller faldende tilgængeligheden af kromatin og yderligere tillade eller forhindre bindingen af transkriptionsfaktorer eller proteiner til DNA, og ændringen i genet udtryk5,6, 7 , 8. HDAC-hæmmere (HDI) er en klasse af stoffer, der forstyrrer funktionen af HDAC-enzymerne. Her, brugt vi HDI (VPA) vedrører regulering af HDAC på den iboende gen expression profil af B-celler og på dets mekanisme.
miRNAs er lille, ikke-kodende RNA'er ca 18 til 22 nukleotider i længde, der genereres gennem flere faser. miRNA vært gener er transskriberet og danne hårnål primære MicroRNA (pri-miRNAs). De eksporteres til cytoplasma, hvor pri-miRNAs behandles yderligere i forløber miRNAs (pre-miRNAs). Endelig, modne miRNAs dannes ved spaltning af pre-miRNAs. miRNAs genkender de komplementære sekvenser i den 3' utranslaterede region af deres mål mRNAs6,7. Gennem post-transcriptional hæmning, regulere miRNAs cellulære aktivitet, såsom spredning, differentiering og apoptose10,11. Da flere miRNAs kan målrette den samme mRNA, og en enkelt miRNA potentielt kan målrette flere mRNAs, er det vigtigt at have en in-sammenhæng opfattelse af miRNA udtryk profil til at forstå værdien af enkelt og kollektive effekten af miRNAs. miRNAs har vist sig at være involveret i B-celle udvikling og perifere differentiering, samt B-celle stadium-specifikke differentiering, antistofrespons og autoimmunitet1,4,9. I 3' UTR af Aicda og Prdm1er der flere validerede eller forudset evolutionært bevarede websteder, der kan blive ramt af miRNAs8.
Epigenetiske nedsættelser, herunder Histon efter transskription ændring og miRNAs, vise en celletype og celle fase-specifik forordning mønster af gen expression9. Her, beskriver vi metoder til at definere den HDI-medieret graduering af miRNA og mRNA udtryk, CSR og plasma Celledifferentiering. Disse omfatter protokoller for inducerende B-celler til at gennemgå CSR og plasma Celledifferentiering; til behandling af B-celler med HDI; og til at analysere miRNA og mRNA udtryk af qRT-PCR, miRNA-FF. og mRNA-seq10,11,12,8,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokollen følger retningslinjerne dyrs pleje af den institutionelle dyrs pleje og brug udvalg af University of Texas Health Science Center i San Antonio.
1. stimulering af musen B celler for CSR, Plasma Celledifferentiering og HDI behandling
- forberedelse af milten celle suspensioner
Bemærk: udføre alle trinene i en laminar flow hætte med undtagelse af musen aktiv dødshjælp og dissektion.- Aflive specifikt patogenfrie C57BL/6J mus (8-12 uger gammel) af CO 2 inhalation.
- Lå musen på dissekere bord med maven opad. Fastgør alle fire fødder af mus med 18-gauge, 1,5 - in kanyler.
- Sterilisere huden med 70% ethanol-gennemblødt vådservietter.
- Bruge et sæt af autoklaveres kirurgiske værktøjer (pincet og dissekere saks) til at skære igennem huden lige under brystkassen til at visualisere milt (på venstre side af maven, lige under leveren).
- Brug en anden steril pincet og saks til at udtrække milten, som ligger under den større krumning af maven, ved fastspænding milten forsigtigt med pincet og afskære alle forbinder væv med dissekere saks. Sørg for at fjerne alle de tilsluttende væv.
- Placere milten i en 1,5 mL microcentrifuge tube indeholder 1.000 µL af komplet RPMI1640 medium (RPMI 1640 medium suppleret med 10% varme-inaktiverede føtalt kalveserum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 µg/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 0,25 µg/mL amphotericin B og 50 µM β-mercaptoethanol).
- Placerer en 70 µm celle si i et 50 mL polypropylen konisk centrifugeglas og hæld milt fra microcentrifuge tube på celle si. Brug spidsen af en 15 mL polypropylen konisk centrifugeglas til forsigtigt mash milten gennem sien. Skyl celle si med 15-20 mL af komplette mellemstore.
- Spin ned celler ved 350 x g i 5 min og Fjern supernatanten.
- Fjerne rød blod celler fra milt celle suspensioner. Resuspenderes celle i ACK lysisbuffer (5 mL pr milten). Inkuber i 4 min ved stuetemperatur under lejlighedsvis omrystning og derefter slukke med 25 mL af komplette mellemstore.
- Spin ned celler på 350 x g i 5 min og supernatanten. Celle resuspenderes i 1 eller 10 mL af komplet medium. Tælle de levedygtige celler ved hjælp af en hemocytometer.
- B-celle isolation
Bemærk: isolere B celler af negative valg efter fabrikanten ' s instruktioner. Non-B-celler er indskyde nemlig afsked med biotinylated antistoffer rettet mod ikke-B-celler (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1), og TER119) og streptavidin-belagt magnetiske partikler.- Forbered en 0,25-2 mL cellesuspension af 1 x 10 8 celler/mL i komplet medium i en steril 5 mL (12 x 75 mm) polystyren runde-nederste rør. Tilføje normal rotte serum (50 µL/mL) til prøven.
- Tilsættes 50 µL/mL isolation cocktail til prøven. Bland cellerne af forsigtigt pipettering op og ned 2 - 3 gange og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
- Tilføje 75 µL/mL streptavidin-belagt magnetiske partikler til prøven. Bland blandingen ved forsigtigt pipettering op og ned 2 - 3 gange og der inkuberes i 2,5 min ved stuetemperatur.
- Tilføje komplet RPMI 1640 medium. Bland cellerne af forsigtigt pipettering op og ned ad 2 - 3 gange.
- Placere røret (uden låg) i magneten og inkuberes ved stuetemperatur i 2,5 min. Hæld off supernatanten indeholdende urørte B-celler ind i en ny 15 mL konisk rør.
- Tæller de levedygtige celler ved hjælp af en hemocytometer og Trypan blå plet. Vurdere renhedsgraden af B-celler ved flow flowcytometri analyse af B-celle overflade markører, såsom B220 og CD19.
- B-celle stimulation og HDI behandling
- Resuspend renset B-celler i komplet RPMI 1640 medium i en endelig koncentration på 0,3 x 10 6 celler/mL.
- Bruger en 48-godt celle kultur plade til cellekultur. Til hver brønd, tilsættes 1 mL renset B-celle suspension (0,3 x 10 6 celler/mL), LP'ER (3 µg/mL slutkoncentration) fra Escherichia coli, IL-4 (5 ng/mL slutkoncentration) og 0 eller 500 µM HDI (valproinsyre; VPA).
- Ruger cellerne ved 37 ° C og 5% CO 2 til 60 h for qRT-PCR og høj overførselshastighed mRNA - og miRNA-sekventering analyse, eller 96 h for analysen af handelsstrømmen flowcytometri.
- Flow flowcytometri analyse af CSR og plasma celle differentiering
- efter 96 timer af kultur, frigør celler fra hver brønd ved pipettering celler op og ned flere gange. Overføre cellesuspension til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Spin ned celler på 350 x g i 5 min ved hjælp af en Bordcentrifuge og supernatanten.
- Resuspend celler med 100 µL af HBSS buffer indeholdende 1% BSA og 0,5 ng/mL fluorescein (FITC) - konjugeret gede anti-- musen IgM-antistof (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-konjugeret rotte anti-mus IgG1 monoklonale Ab (mAb), 0,2 ng/mL phycoerythrin (PE)-konjugeret rotte anti-mus B220 mAb, 0,2 ng/mL PE-Cy7-konjugeret rotte anti-mus CD138 mAb og 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Inkuber celler med fluorescens-konjugerede antistoffer (trin 1.4.2) i mørke ved stuetemperatur i 30 min.
- Cellerne vaskes med 1 mL af HBSS med 1% BSA.
- Spin ned celler på 1.500 x g i 5 min ved hjælp af en benchtop centrifuge og kassér supernatanten.
- Resuspend celler i 300 µL af HBSS med 1% BSA og overføre cellesuspension til en runde-bunden polystyren tube. Dække tube med folie for at undgå lys eksponering.
- Udføre flow flowcytometri analyse på en enkelt celle suspension. Indsamle 50.000 begivenheder for hver prøve, kompensation og 250.000 begivenheder for de andre prøver. Analysere data ved hjælp af udstyr software.
- Fjerner snavs og dubletter ved hjælp af en pulse geometri gate (FSC-H x FSC-A og SSC-H x SSC-A). Passende gate plot på 7-ald at udelukke døde celler.
2. Høj overførselshastighed mRNA-FF.
- efter 60 h af kultur, uddrag den samlede RNA fra 2-4 × 10 6 celler ved hjælp af en total RNA isolering kit, der kan genoprette små RNA efter fabrikanten ' s instruktioner. Omfatter en DNase jeg trinnet for behandling.
- Kontrollere RNA integritet ved hjælp af en bioanalyzer, efter fabrikanten ' s instruktioner.
- Bruge 500-1.000 ng af høj kvalitet total RNA (RNA integritet antallet RIN > 8.0) for RNA-seq bibliotek forberedelse med en kommerciel RNA prøve PedersenRep kit efter fabrikanten ' s instruktioner.
- Pool individuelle mRNA-seq biblioteker baseret på deres respektive 6-bp indeks dele af adapterne og sekvens biblioteker på 50 bp/sekvens. Bruge en høj overførselshastighed DNA system ifølge producenten ' s protokoller.
- Efter sekvensering run, afmultiplekse med CASAVA at generere filen fastq til hver prøve. Udføre læser kortlægning og bioinformatik analyse, som tidligere skitseret 11.
- Justere alle sekventering læser med deres reference genomer (UCSC mus genom opbygge mm9) ved hjælp af TopHat2 standard indstillinger 14. Behandle filerne bam fra justering ved hjælp af HTSeq-count for at opnå tæller pr. gen i alle prøver.
3. Høj overførselshastighed miRNA-FF.
- Brug 100 ng-1 µg af høj kvalitet total RNA, som er udarbejdet i trin 2.1, for små RNA-seq bibliotek forberedelse ved hjælp af en kommerciel små RNA-seq kit.
- Ligate de degenererede 3 ' adapter til 5 ′ ender af de start små RNA molekyler med en kommerciel ligatur kit. Ligate den degenererede 5 ' adapter på 3 ′ ender af de start små RNA molekyler med en kommerciel ligatur kit. Konvertere RNA til cDNA ved reverse transkription og forstærke de små RNA-seq bibliotek af PCR-amplifikation med kommercielle kits.
- Bruge en 6% TBE indfødte side gel til at isolere de sidste små RNA-seq bibliotek. Kør gelen med 1 X TBE buffer på 200 V indtil bromophenol blå tracking farvestof bandet nærmer sig bunden af gel (0,5 - 1 cm).
- Fjerner gel fra glasplader og plette med ethidiumbromid (0,5 µg/mL i vand) i en ren beholder til 2-3 min. Visualiser gelen bands på en UV transilluminator eller en anden gel dokumentation instrument.
- Skære ud ~ 150-bp bandet ved hjælp af en ren razor og læg det i en 1,7 mL tube.
- Uddrag DNA ved hjælp af en gel udvinding kit fabrikanten anvisninger.
- Kontrollere størrelse distribution af den endelige bibliotek med en kommerciel Højfølsom DNA analysen og koncentration med en kommerciel dsDNA assay pr. producenterne ' instruktioner.
- Pool bibliotekerne for forstærkning og en efterfølgende sekventering køres med en kommerciel høj overførselshastighed DNA-sekventering system pr. fabrikanten ' s protokoller.
- Afmultiplekse med CASAVA at generere filen fastq til hver prøve pr. fabrikanten ' s protokoller.
- For små RNA-seq analyse af hver prøve, bruge flimmer for små RNA justering pr. fabrikanten ' s protokoller.
- Fjerne læsninger, der er justeret til forurenende stoffer, såsom mitokondrier, rRNA, primere, og så på.
- Juster data for at modne miRNA sekvenser.
- Juster data til hårnål loop sekvenser (forløber miRNA).
- Juster data til andre små RNA sekvenser (ved hjælp af fRNA database) 15.
- Efter alle prøver er kvantificeret, definere de differentiale udtrykt miRNAs mellem forskellige grupper/prøver. Forudsige miRNAs, der er målrettet mod udvalgte mRNAs eller mRNAs, der kan blive ramt af en selektiv miRNA bruger online miRNA target forudsigelse værktøjer, TargetScan 16, mikrokosmos 17 og PicTar 18 .
- Hvis anmærkningen eller pathway funktionalanalyse er nødvendigt, forelægge de forudsagte gener til opfindsomhed Pathway analyse (IPA) eller DAVID.
4. Kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) af mRNAs og miRNAs
- qRT-PCR analyse af mRNA
- uddrag RNA fra 0,2-5 × 10 6 celler ved hjælp af en kommerciel total RNA isolering kit der kan genoprette små RNA, efter den fabrikanten ' s instruktioner. Omfatter en DNase jeg trinnet for behandling.
- Syntetisere cDNA fra total RNA med en første-streng cDNA syntese system ved hjælp af oligo-dT primer.
- Kvantificere cDNA ved qRT-PCR med passende primere, ved hjælp af 2 x real-time PCR master mix med følgende protokol: 95 ° C i 15 s, 40 cyklusser af 94 ° C til 10 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s.
- Udføre dataopsamling under trinnet 72 ° C udvidelse og udføre smeltende kurve analyse fra 72 til 95 ° C.
- qRT-PCR analyse af miRNA
- alikvot RNA fra prøver forberedt i trin 4.1.1.
- Omvendt-transskribere RNA i cDNA. Brug en kommerciel mikroRNA reverse transkription kit, efter fabrikanten ' s instruktioner.
- Udføre real-time PCR for mikroRNA ved hjælp af en SYBR Green real-time PCR master mix med 250 nM modne miRNA fremad primere sammenholdt med en universel omvendt primer.
- Tø 2 x PCR Master Mix, miRNA-specifikke fremad primer og universelle reverse primer ved stuetemperatur. Bland de enkelte løsninger.
- Udarbejde en mastermix som følger for en 25 µL pr. brønd reaktion bind (brugt i 96-brønd PCR plader):
2 x PCR Master Mix 12,5 µL
miRNA videresende primere (2,5 μM) 2,5 µL
Universal reverse primer (2,5 μM) 2,5 µL
RN ase-fri water5 µL - tilføje 22,5 μL af mastermix til en 96-brønd PCR plade. Tilføje 2,5 µL af skabelon cDNA (50 pg-3 ng) til de enkelte plade brønde.
- Segl stramt plade film. Centrifugeres plade for 1 min på 1.000 x g og stuetemperatur.
- Pladen anbringes i real-time cycler og starte programmet følgende cykling: 95 ° C i 5 min, 40 cyklusser af 94 ° C til 15 s, 55 ° C til 30 s og 72 ° C i 30 s.
- Bruge metoden ΔΔCt for qRT-PCR dataanalyse med et regneark. Normalisere udtryk for den relevante miRNAs til udtryk for små nukleare/nucleolar RNA'er Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 og Snord70/SNORD70.
- Statistisk analyse
- statistisk analyse for at bestemme p-værdier ved parret og uparrede studerende ' s t - test med anvendelse af et regneark og overveje p værdier < 0,05 som betydelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af vores protokol, renset B celler placeret med LP'ER (3 µg/mL) og IL-4 (5 ng/mL) for 96 timer kan fremkalde 30-40% af CSR til IgG1 og ~ 10% af plasma Celledifferentiering. Efter behandling med HDI (500µM VPA), VSA til IgG1 faldt til 10-20%, mens plasma Celledifferentiering faldt til ~ 2% (figur 1). HDI-medieret hæmning af VSA blev yderligere bekræftet af nedsat antal efter rekombination Iμ-Cγ1 og modne VHDJH-Cγ1 udskrifter, som er kendetegnende for afsluttede CSR. Målt ved qRT-PCR, var udtryk for Aicda, som er kritiske for CSR/SHM, og Prdm1 og Xbp1, som er vigtige for plasma Celledifferentiering, vist sig at være hæmmet af VPA (figur 2).
Graduering af mRNA udtryk af HDI i B-celler var yderst selektiv. Målt af mRNA-seq i B celler stimuleret med LP'ER og IL-4, kun 0,3% af disse stærkt udtrykt mRNAs var upregulated af HDI mere end to gange, og kun 0,36% af stærkt udtrykt (> 20 Kopier/celle i B celler uden HDI behandling) mRNAs, herunder Aicda, Prdm1, og Xbp1, blev reduceret med HDI mere end 50% (figur 3).
Downregulation af Aicda, Prdm1og Xbp1 udtryk kunne potentielt være medieret af miRNAs, som er negative regulatorer af genekspression. Ved hjælp af miRNA målretning forudsigelse værktøjer (TargetScan.org, miRNA.org og miRbase.org), identificeret vi flere miRNAs, der potentielt kan målrette Aicda eller Prdm1. MiRNA-seq analyse af miRNA profilering i B-celler behandles med HDI eller nul viste, at HDIs selektivt upregulate Aicda - og Prdm1 -målretning miRNAs (tal 4-6).
Figur 1. Overflade udtryk for B-celle markør B220, overflade antistof IgG1 og plasma-celle markør CD138 blev analyseret ved flowcytometri.
B220+ IgG1+ celler blev B-celler skiftet til IgG1. B220lavCD138+ celler blev plasmaceller. Procentdelen af IgG1-skiftede B-celler og plasmaceller fra B-celler stimuleret med LP'ER og IL-4 i overværelse af nul eller HDI (VPA, 500 M) til 96 timer er angivet som tal inden for portene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Udtryk for kendetegnende for afsluttede VSA. modne VHDJH-Cγ1 afskrifter og efter rekombination Iμ-Cγ1 afskrifter; og Aicda, Prdm1og Xbp1 blev analyseret af qRT-PCR, normaliseret til Cd79b udskrifter, og vist i et histogram.
Genekspression i B celler stimuleret med LP'ER og IL-4 i overværelse af 500 µM VPA og relevante for Gen-ekspression i B celler med de samme stimuli i overværelse af nil blev afbildet som 1. Data er fra tre uafhængige forsøg. p værdier, parret t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. B-celler blev stimuleret med LP'ER og IL-4 og behandlet med HDI (VPA, 500 µM) eller nul til 60 h. mRNA udtryk blev analyseret af mRNA-FF.
(A) gennemsnitlige mRNA udtryk niveauer i tre uafhængige eksperimenter (læser per kilobase per million tilknyttede læser, RPKMs) blev afbildet i scatter parceller. Hver plot svarer til ét enkelt mRNA udtryk niveau. De to stiplede linjer er to-fold linjer. Scatter parceller ligger over den øverste stiplede linje eller under bunden stiplet linje angiver mRNAs, der udtrykker mere end to gange eller mindre end halvdelen når induceret af VPA og nil, henholdsvis. B søjlediagrammer skildrer den gennemsnitlige ændring i mRNA udtryk niveauer (gennemsnitlig RPKMs fra tre uafhængige eksperimenter) i LPS og IL-4-stimuleret B celler behandles med HDI, i forhold til dem i B-celler behandles med nul. Kun mRNAs på en gennemsnitlig RPKM > 20 i LPS og IL-4-stimuleret B celler behandles med nil er inkluderet. MRNA udtrykket i hver enkelt eksperiment, som det fremgår af en scatter plot (C) eller søjlediagram (D), er afbildet på den samme måde som i (A) og (B). p værdier, parret t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. B-celler blev stimuleret med LP'ER og IL-4 og behandlet med HDI (VPA, 500 µM) eller nul til 60 h. miRNA udtryk blev analyseret af miRNA-FF.
(A) den ændring i de gennemsnitlige miRNA udtryk niveauer i B celler behandles med HDI i forhold til, der i B-celler behandles med nil blev skildret af søjlediagrammer. (B) ændring i miRNA udtryk niveauer i B celler behandles med HDI i forhold til at i B-celler behandles med nul i tre uafhængige forsøg blev skildret af søjlediagrammer. Kun miRNAs på gennemsnitlige RPM > 0,5 i LPS og IL-4-stimuleret B celler behandles med nil er inkluderet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. HDI øger udtryk for Aicda -målretning miRNAs, som det fremgår af miRNA-FF.
(A) rækkefølge justering af miRNAs og deres målwebsteder i 3' UTR af Aicda mRNAs. (B) B-celler blev kulturperler med LP'ER og IL-4 i tilstedeværelse eller fravær af HDI (VPA, 500 M) for 60 h. Udtryk for den miRNAs, der var forudset til at målrette Aicda 3' UTR blev analyseret af miRNA-FF. og afbildet som RPM. p værdier, parret t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. HDI øger udtryk for Prdm1 -målretning miRNAs, som det fremgår af miRNA-FF.
(A) rækkefølge justering af miRNAs og deres målwebsteder i 3' UTR af Prdm1 mRNAs. (B) B-celler blev kulturperler med LP'ER og IL-4 i tilstedeværelse eller fravær af HDI (VPA, 500 M) for 60 h. udtryk for den miRNAs, der var forudsagt for at målrette Prdm1 3' UTR blev analyseret af miRNA-FF. og afbildet som RPM. p værdier, parret t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver omfattende tilgange for at fremkalde B-celle klasse switching og plasma Celledifferentiering; at analysere indvirkningen af epigenetiske modulatorer, nemlig HDI; og til at påvise effekten af HDI på mRNA og miRNA udtryk i disse celler. De fleste af disse metoder kan også bruges til at analysere virkningen af epigenetiske faktor på humane B-celle funktion og mRNA/miRNA udtryk. QRT-PCR og mRNA-seq/miRNA-seq tilgange kan også bruges til at analysere B celler isoleret fra mus behandlet med epigenetiske modulatorer, som HDIs.
Den epigenetiske modulate kan påvirke mange forskellige cellefunktioner, som celleproliferation og levedygtighed, som kan påvirke VSA og plasma celle differentiering. Derfor, celleproliferation, levedygtighed og celle cyklusser af B-celler, med eller uden HDI behandling, bør analyseres. En af udfordringerne til at analysere graduering af mRNA og miRNA udtryk af HDI eller andre epigenetiske regulatorer af qRT-PCR er at vælge et egnet husholdning gen eller lille RNA. Mange fælles husholdning gener kan ændres til varierende grader af epigenetiske modulatorer. Udtrykket niveauer af mange forskellige husholdning gener bør måles og bruges til at normalisere den specifikke genekspression af qRT-PCR. Problemet kan også løses ved mRNA-FF. og miRNA-FF., hvor udtryk for individuelle mRNAs eller miRNAs kan blive normaliseret af genome-wide mRNA eller miRNA niveauer.
mRNA-seq kan ikke kun definere profilen mRNA udtryk med en passende Bioinformatik pipeline, men denne tilgang kan også definere profilen længe noncoding RNA (lncRNA). mRNA-seq involverer typisk berigelse af poly(A) + RNA'er af oligo(dT) udvalg. Som en række lncRNA er kendt for at mangle poly(A) haler, kan ikke mRNA-seq tilgang, der involverer oligo (dT) udvalg bestemme den fuldstændige oplysninger af lncRNA udtryk. For at opnå fuld dækning af både mRNA og lncRNA udtryk profiler, bør en RNA-seq tilgang, der involverer rRNA udtynding anvendes. I de fleste af vores eksperimenter bruger vi en kommerciel kit til at udtrække den samlede RNA, herunder miRNA, miRNA-FF., mRNA-FF. og qRT-PCR. Forud for opbygningen af en høj overførselshastighed sekventering bibliotek, valideres den samlede RNA kvalitet ved at køre en alikvot på en automatiseret RNA, DNA og protein prøve QC system. Det anbefales, at RNA prøver har en RIN på 7,0 eller højere, hvis de skal bruges til små RNA bibliotek forberedelse. Prøver med lavere RIN tal har en højere procent af nedbrudt RNA produkter i størrelsesområde for små RNA arter (15-30 nukleotider). Når RIN antallet er under 7.0, vil dækningen ikke være så god. En anden mulighed for mindre-end-ideelle RNA prøver er at udføre en rRNA udtynding tilgang snarere end en mRNA isolation tilgang, men dette kræver, at prøverne mindst 10 ng/mL.
Protokoller for mRNA-seq bruges her er optimeret til 100-1.000 ng af total RNA. For miRNA-seq bruger mindre end 100 ng af total RNA, små RNA-seq bibliotek forberedelse bør følge en mere følsomme små RNA-seq forberedelse protokol, som udnytter den naturlige struktur er fælles for de fleste kendte mikroRNA molekyler. Mest modne miRNAs har en 5'-phosphat og en 3'-hydroxyl gruppe som følge af deres Biogenese pathway. På grund af dette, er 3' og 5' adapterne i dette kit direkte forbundet til miRNAs.
Hvis du vil analysere virkningen af HDI på B-celle mRNA og miRNA udtryk i vivo, kan mus behandles med VPA eller andre HDIs ved at tilføje denne HDI til drikkevandet, og intraperitoneal injektion af disse mus med T-afhængige antigen NP-CGG eller T-uafhængig antigen NP-LP'ER kan udføres. B-celler kan blive renset fra milten 10 dage efter vaccination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud AI 105813 AI 079705 (til PC), giver Alliance for Lupus forskning målet identifikation i Lupus Grant ALR 295955 (til PC), og gigt Grundforskningsfond forskning (HZ). TS blev støttet af Pediatrics Medical Center, anden Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Kina, i forbindelse med Xiangya-UT skole af medicin San Antonio medicinstuderende besøger program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z.
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
