Summary
Fatores epigenéticos podem interagir com programas genéticos para modular a expressão gênica e regulam a função de células B. Combinando a estimulação de vitro em células B, qRT-PCR e elevado-throughput do microRNA-sequência e abordagens de RNAm-sequência, podemos analisar a epigenética modulação da expressão de gene e miRNA em células B.
Abstract
Respostas de anticorpos são realizadas através de vários processos, células B crítico-intrínseca, incluindo somática (SHM), recombinação de DNA de classe-switch (RSE) e diferenciação de células plasmáticas. Nos últimos anos, modificações epigenéticas ou fatores, tais como deacetilação de histona e microRNAs (miRNAs), têm sido mostrados para interagir com os programas genéticos de células B a respostas de anticorpos de forma, enquanto a disfunção dos fatores epigenéticos foi encontrada para conduzir a respostas de auto-anticorpos. Analisando a expressão de miRNA e mRNA de todo o genoma em células B em resposta a epigenéticas moduladores é importante para compreender a regulação epigenética da célula B função e anticorpo resposta. Aqui, demonstramos um protocolo para indução de células B submeter-se a diferenciação de RSE e células plasmáticas, tratando estas células B com inibidores de histona deacetilase (HDAC) (IDHs) e analisando a expressão do mRNA e microRNA. Neste protocolo, analisamos diretamente complementares sequências de DNA (cDNA) usando sequenciamento de mRNA de próxima geração (seq-mRNA) e tecnologias de miRNA-seq, mapeamento do sequenciamento lê ao genoma e quantitativa (qRT) a transcrição reversa-PCR. Com estas abordagens, definimos que, em células B induzidas a se submeter a RSE e diferenciação de células plasmáticas, HDI, um regulador epigenético, seletivamente modula a expressão miRNA e mRNA e altera a diferenciação de RSE e células plasmáticas.
Introduction
Marcas epigenéticas ou fatores, como a metilação do DNA e RNA não-codificante (incluindo microRNAs), posttranslational modificações do histone modulam a função celular, alterando a expressão de gene1. Modificações epigenéticas regulam a função de linfócitos B, tais como recombinação de DNA de classe-interruptor de imunoglobulina (RSE), somática (SHM) e diferenciação de células B de memória ou pilhas de plasma, desse modo, modulando o anticorpo e auto-anticorpos respostas de2,3. RSE e SHM criticamente exigem deaminase citidina induzida por ativação (auxílio, codificado como Aicda), que é altamente induzida em células B em resposta ao T-dependentes e T-independentes antígenos4. As células B classe-comutado/hypermutated mais se diferenciar em plasmócitos, que secretam grandes quantidades de anticorpos de forma criticamente dependente da proteína de maturação de linfócitos B-induzido 1 (Blimp1, codificado como Prdm1)5. Mudanças epigenéticas anormais nas células B podem resultar em respostas de anticorpo/auto-anticorpos aberrante, que podem levar à resposta alérgica ou auto-imunidade1,4. Compreendendo fatores como epigenéticas, tais como os miRNAs, modulam célula B-intrínseca expressão gênica não é apenas importante para o desenvolvimento de vacina, mas também é essencial para revelar os mecanismos de respostas potenciais de anticorpo/auto-anticorpos anormais.
Deacetilação e acetilação da histona são modificações dos resíduos de lisina em proteínas histonas normalmente catalisadas por histona acetiltransferase (chapéu) e histona deacetilase (HDAC). Estas modificações levam à acessibilidade crescente ou decrescente da cromatina e, ainda mais, permitam ou impedem a ligação de fatores de transcrição ou proteínas ao DNA e a alteração do gene expressão5,6, 7 , 8. inibidores HDAC (IDH) são uma classe de compostos que interferem com a função das HDACs. Aqui, usamos HDI (VPA) para abordar o Regulamento de HDAC sobre o perfil de expressão de gene intrínseca das células B e seu mecanismo.
os miRNAs são pequenos, não-codificantes RNAs aproximadamente de 18 a 22 nucleotídeos de comprimento que são gerados por vários estágios. miRNA anfitrião genes são transcritos e formam o grampo principal microRNAs (miRNAs-pri). São exportados para o citoplasma, onde pri-miRNAs são subsequentemente transformados em miRNAs precursor (pre-miRNAs). Finalmente, formam-se através da segmentação dos pre-miRNAs miRNAs maduros. os miRNAs reconhecer as sequências complementares dentro da região 3' untranslated do seu alvo mRNAs6,7. Através do silenciamento pós-transcricional, miRNAs regular a atividade celular, tais como a proliferação, diferenciação e apoptose10,11. Já vários miRNAs podem direcionar o mesmo mRNA, e um único miRNA potencialmente pode direcionar vários mRNAs, é importante ter uma visão do contexto do perfil de expressão de miRNA para compreender o valor do indivíduo e o efeito conjugado dos miRNAs. os miRNAs foram mostrados para ser envolvido no desenvolvimento de células B e diferenciação periférica, bem como diferenciação de estágio específico de células B, resposta imunitária e auto-imunidade1,4,9. Na 3' UTR de Aicda e Prdm1, existem vários validados ou previsível evolutivamente conservadas sites que podem ser direcionados por miRNAs8.
Modulação epigenética, incluindo modificação pós-transcrição de histona e miRNAs, exibir um tipo de célula e célula padrão de regulamento de estágio específico do gene expressão9. Aqui, descrevemos os métodos para definir a modulação mediada por HDI de miRNA e expressão do mRNA, CSR e diferenciação de células plasmáticas. Estes incluem protocolos para indução de células B submeter-se a RSE e diferenciação de células plasmáticas; para tratar as células B com IDH; e para analisar a expressão miRNA e mRNA por qRT-PCR, miRNA-seq e mRNA-seq10,11,12,8,13.
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Protocol
o protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais de The cuidados institucionais do Animal e uso de comitês da University of Texas Health Science Center em San Antonio.
1. estimulação de pilhas do rato de B para a RSE, diferenciação de células plasmáticas e HDI tratamento
- preparação de suspensões celulares de baço
Nota: executar todas as etapas em uma capa de fluxo laminar, com exceção do mouse eutanásia e dissecção.- Euthanize a isentos de agentes patogénicos específicos C57BL/6J mouse (8-12 semanas de idade) por inalação de CO 2.
- Colocar o mouse na placa de dissecação com o abdome virado para cima. Colocar todos os quatro pés do mouse com agulha de calibre 18, 1.5 - na.
- Esterilizar a pele usando toalhetes de encharcada de etanol 70%.
- Usar um conjunto de instrumentos cirúrgicos esterilizados em autoclave (pinças e tesouras dissecação) para cortar a pele logo abaixo da caixa torácica para visualizar o baço (no lado esquerdo do abdômen, logo abaixo do fígado).
- Usar outra pinça estéril e tesouras tesouras para extrair o baço, que se encontra abaixo da curvatura maior do estômago, por aperto o baço suavemente com fórceps e cortando todo o tecido de conexão com a dissecação. Certifique-se de remover todo o tecido conexão.
- Colocar o baço em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga contendo 1.000 µ l de meio RPMI1640 completo (RPMI 1640 meio suplementado com soro 10% inactivadas pelo calor fetal bezerro (FBS), 2 mM L-glutamina, a penicilina 100 µ g/mL, 100 mg/mL estreptomicina, anfotericina B de 0,25 µ g/mL e 50 µM β-Mercaptoetanol).
- Coloque um coador de célula de 70 µm em um tubo de centrifuga conico polipropileno de 50 mL e despeje o baço do tubo microcentrifuga no filtro da célula. Use a ponta de um tubo de centrifuga conico polipropileno de 15 mL para amasse delicadamente o baço através do filtro. Lave o filtro de célula com 15 a 20 mL de meio completo.
- Spin-down as células a 350 x g, durante 5 min e descartar o sobrenadante.
- Remover os glóbulos vermelhos de suspensões de células do baço. Ressuspender as células em tampão de Lise ACK (5 mL por baço). Incubar durante 4 min em temperatura ambiente com agitação ocasional e depois saciar com 25 mL de meio completo.
- Spin para baixo as células a 350 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ou 10 mL de meio completo. Contar as células viáveis usando um hemocytometer.
- Célula B isolamento
Nota: as células B isolar pela seleção negativa, seguindo o fabricante ' instruções s. Non-B células são direcionadas para remoção com biotinilado anticorpos dirigidos contra células não-B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) e TER119) e partículas magnéticas streptavidin-revestido. Tubo de fundo redondo de- Prepare uma suspensão de células de 0,25 a 2 mL de 1 x 10 8 células/mL em meio completo em um poliestireno estéril 5 mL (12 x 75 mm). Adicionar soro rato normal (50 µ l/mL) para a amostra.
- Isolamento de adicionar 50 µ l/mL cocktail à amostra. Misture as células pipetando suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
- Adicionar 75 µ l/mL streptavidin-revestido partículas magnéticas para a amostra. Misture a mistura suavemente pipetando acima e para baixo 2 - 3 vezes e incube por 2,5 min à temperatura ambiente.
- Adicionar meio RPMI 1640 completo. Misture as células pipetando delicadamente acima e abaixo de 2 - 3 vezes.
- Colocar o ímã do tubo (sem a tampa) e incubar a temperatura ambiente por 2,5 min. deite fora o sobrenadante contendo intocadas células B em um novo tubo cônico de 15 mL.
- Contar as células viáveis usando um hemocytometer e mancha azul Trypan. Avaliar a pureza das células B por análise de citometria de fluxo de marcadores de superfície de células B, como B220 e CD19.
- Estimulação de células B e tratamento HDI
- Ressuspender as células B purificadas em meio RPMI 1640 completo em uma concentração final de 0,3 x 10 6 células/mL.
- Usar uma placa de cultura de células de 48-bem para cultura de células. Para cada poço, adicionar 1 mL de suspensão de células B purificado (0,3 x 10 6 células/mL), LPS (concentração final de 3 µ g/mL) de Escherichia coli, IL-4 (concentração final de 5 ng/mL) e 0 ou 500 µM HDI (ácido valproico; VPA).
- Incube as celulas em 37 ° C e 5% CO 2 para 60h por qRT-PCR e análise do elevado-throughput do mRNA - e miRNA-sequenciamento, ou 96 h para análise de citometria de fluxo.
- Flow cytometry análise de RSE e diferenciação de células plasmáticas
- após 96 h de cultura, separar as células de cada poço pipetando as células acima e para baixo várias vezes. Transferi a suspensão de células para um tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Gire para baixo as células a 350 x g por 5 min utilizando uma centrífuga de bancada e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 100 µ l de tampão HBSS contendo 1% de BSA e 0,5 ng/mL fluoresceína (FITC) cabra conjugada anti anticorpos de IgM de rato de – (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-anti-rato conjugados rato IgG1 Ab monoclonal (mAb), 0,2 ficoeritrina ng/mL (PE)-conjugados rato anti-rato B220 mAb, 0,2 ng/mL PE-Cy7-conjugados rato anti-rato CD138 mAb e 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Incubar as células com anticorpos conjugados de fluorescência (etapa 1.4.2) no escuro à temperatura ambiente por 30 min.
- Lavar as células com 1 mL de HBSS com 1% de BSA.
- Spin-down as células a 1.500 x g por 5 min utilizando uma centrífuga de bancada e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 300 µ l de HBSS com 1% de BSA e transfira a suspensão de células para um tubo de poliestireno de fundo redondo. Cobrir o tubo com papel alumínio para evitar a exposição à luz.
- Executar análise de citometria de fluxo em uma suspensão de célula única. Colete 50.000 eventos para cada amostra de compensação e 250.000 eventos para as outras amostras. Analisar os dados usando o software do equipamento.
- Eliminar os detritos e parelhas usando um portão de geometria de pulso (FSC-H x FSC-A e SSC-H x SSC-A). Portão apropriadamente o lote 7-AAD para excluir as células mortas.
2. Elevado-Throughput do mRNA-Seq
h- após 60 da cultura, extrair o RNA total de 2-4 × 10 6 células usando um kit de isolamento de RNA total que pode recuperar o pequeno RNA seguindo o fabricante ' instruções s. Incluem uma DNase eu passo tratamento.
- Verificar a integridade do RNA usando um bioanalyzer, seguindo o fabricante ' instruções de s.
- Usar 500-1.000 ng do RNA total de alta qualidade (número de integridade do RNA RIN > 8.0) para o RNA-seq preparação de biblioteca com uma RNA comercial amostra pkit de rep seguindo o fabricante ' instruções de s.
- As bibliotecas de mRNA-seq individuais com base em suas parcelas respectivas 6-bp índice dos adaptadores do pool e as bibliotecas em 50 bp/sequência de sequências. Usar um sistema de DNA de alto rendimento de acordo com o fabricante ' protocolos de s.
- Após a execução de sequenciamento, demultiplex com CASAVA para gerar o arquivo fastq para cada amostra. Realizar leituras de mapeamento e análise de bioinformática, como anteriormente descrito 11.
- Alinhar todas as leituras de sequenciamento com seus genomas de referência (UCSC rato genoma compilação mm9) usando TopHat2 padrão configurações 14. Processar os arquivos de bam de alinhamento usando a contagem de HTSeq para obter as contagens por gene em todas as amostras.
3. Elevado-Throughput miRNA-Seq
- uso 100 ng-1 µ g de RNA total de alta qualidade, como preparado no passo 2.1, para a preparação de biblioteca de RNA-seq pequena usando um pequeno kit de RNA-seq comercial.
- Ligam a 3 degenerado ' adaptador sobre o 5 ′ extremidades das partida pequenas moléculas de RNA com um kit de ligadura comercial. Ligam o degenerado 5 ' adaptador sobre o 3 ′ extremidades das partida pequenas moléculas de RNA com um kit de ligadura comercial. Converter o RNA em cDNA por transcrição reversa e amplificar a pequena biblioteca de RNA-seq por amplificação por PCR com jogos comerciais.
- Usar um gel de PAGE 6% nativo TBE para isolar a final pequena biblioteca de RNA-seq. Funcione o gel com 1 buffer de X TBE a 200 V, até a banda de bromofenol tintura de controle se aproxima da parte inferior do gel (0,5 - 1 cm).
- Retire o gel as chapas de vidro e manchar com brometo de etídio (0,5 µ g/mL na água) em um recipiente limpo para 2-3 min.. Visualize o gel bandas em um transiluminador UV ou outro instrumento de documentação de gel de.
- Cortar fora a banda ~ 150-bp usando uma lâmina limpa e coloque-o em um tubo de 1,7 mL.
- Extrair o DNA usando um kit de extração do gel de acordo com as instruções do fabricante.
- Verificar a distribuição de tamanho da biblioteca final com um teste de DNA de alta sensibilidade comercial e a concentração com um ensaio comercial dsDNA por fabricantes de ' instruções.
- As bibliotecas da piscina por amplificação e um posterior sequenciamento executados com um sistema de sequenciamento de DNA da elevado-produção comercial pelo fabricante ' protocolos de s.
- Demultiplex com CASAVA para gerar o arquivo fastq para cada amostra pelo fabricante ' protocolos de s.
- Para análise de RNA-seq pequena de cada amostra, use Flicker para alinhamento de RNA pequeno pelo fabricante ' protocolos s.
- Remover leituras que são alinhadas a contaminantes, tais como mitocôndrias, rRNA, cartilhas, etc.
- Alinhar os dados para amadurecer miRNA sequências.
- Alinhar os dados de sequências de laço do gancho de cabelo (precursor miRNA).
- Alinhar os dados a outros pequenos RNA sequências (usando banco de dados fRNA) 15.
- Depois que todas as amostras são quantificadas, definir os miRNAs expressados diferenciais entre diferentes grupos/amostras. Prever os miRNAs que destino selecionados mRNAs ou mRNAs que pode ser alvo de uma miRNA seletiva usando ferramentas de previsão de alvo de miRNA on-line, como TargetScan 16, microcosmo 17 e PicTar 18 .
- Se houver necessidade de análise funcional de anotação ou caminho, submeter os genes previstos para análise via engenho (IPA) ou DAVID.
4. RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) de mRNAs e miRNAs
- análise de qRT-PCR de RNAm
- extrair o RNA de 0,2-5 × 10 6 células usando um comercial total RNA isolamento kit que pode recuperar o pequeno RNA, seguindo o fabricante ' instruções s. Incluem uma DNase eu passo tratamento.
- Sintetizar o cDNA de RNA total com um sistema de síntese de primeiro-costa usando primer oligo-dT.
- Quantificar cDNA por qRT-PCR com primers adequados, usando 2 x mistura mestre de PCR em tempo real com o seguinte protocolo: 95 ° C por 15 s, 40 ciclos de 94 ° C por 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s.
- Realizar a aquisição de dados durante a etapa de extensão de 72 ° C e realizar análise de curva de fusão de 72 para 95 ° C.
- análise de qRT-PCR de miRNA
- alíquota RNA das amostras preparadas na etapa 4.1.1.
- Reversa-transcrever o RNA em cDNA. Usar um kit de transcrição reversa do microRNA comercial, seguindo o fabricante ' instruções de s.
- Realizar PCR em tempo real de microRNA utilizando uma mistura mestre SYBR Green em tempo real do PCR com 250 nM miRNA madura frente primers em conjunto com um primer universal reverso.
Cartilha de
- degelo 2 x PCR Master Mix, miRNA específicos para a frente da primeira demão e universal reversa à temperatura ambiente. Misturar as soluções individuais.
- Preparar uma mistura de reação da seguinte maneira para um volume de 25 µ l-por-bem reação (usado em placas de PCR de 96 poços):
2 x PCR Master Mix 12,5 µ l
miRNA encaminhar as primeiras demão (2,5 μM) 2,5 µ l
Universal reversa de primer (2,5 μM) 2,5 µ l
RN µ l ase-free water5 - Adicionar 22.5 μL da mistura de reação a uma placa PCR de 96 poços. Adicionar 2,5 μL de cDNA de modelo (50 pg-3 ng) nos poços de placa individual.
- Firmemente selar o filme de placa. A placa por 1 min em 1.000 x g e temperatura de centrifugação.
- Colocar a placa no cycler em tempo real e iniciar o seguinte programa de ciclismo: 95 ° C por 5 min, 40 ciclos de 94 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s.
- Usar o ΔΔCt método para análise de dados qRT-PCR com uma folha de cálculo. Normalizar a expressão dos miRNAs relevantes para a expressão de pequena nuclear/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 e Snord70/SNORD70.
- Análise estatística
- realizar análise estatística para determinar os valores de p por emparelhado e desirmanadam estudante ' s t - teste usando uma folha de cálculo e considerar os valores de p < 0,05 como significativa.
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Representative Results
Usando nosso protocolo, purificado de células B colocadas com LPS (3 µ g/mL) e IL-4 (5 ng/mL) para 96 h pode induzir a 30-40% da RSE para IgG1 e ~ 10% de diferenciação de células plasmáticas. Após o tratamento com HDI (500µM VPA), a RSE para IgG1 diminuiu para 10-20%, enquanto a diferenciação de células plasmáticas diminuíram de ~ 2% (Figura 1). Inibição mediada por HDI de RSE foi confirmada por uma diminuição da quantidade de pós-recombinação Iμ-Cγ1 e madura VHDJH-transcrições de Cγ1, que são as principais características da RSE concluído. Medida pelo qRT-PCR, a expressão de Aicda, que é crítico para a RSE/SHM e Prdm1 e Xbp1, que são importantes para a diferenciação de células plasmáticas, foram mostrados para ser inibidas pelo VPA (Figura 2).
A modulação da expressão de RNAm por HDI em células B foi altamente seletiva. Medida pelo mRNA-seq em células B estimuladas com LPS e IL-4, apenas 0,3% destes mRNAs altamente expressos foram upregulated por HDI mais de duas vezes e apenas 0,36% da altamente expressa (> 20 cópias/célula nas células B, sem tratamento de IDH) mRNAs, incluindo Aicda, Prdm1, e Xbp1, foram reduzidos em mais de 50% (Figura 3) IDH.
A downregulation de Aicda, Prdm1e Xbp1 expressão potencialmente poderia ser mediada por miRNAs, que são os reguladores negativos da expressão do gene. Usando miRNA segmentação ferramentas de predição (TargetScan.org, miRNA.org e miRbase.org), identificamos vários miRNAs que potencialmente podem direcionar Aicda ou Prdm1. A análise de miRNA-seq de miRNA perfila-se em células B tratados com HDI ou zero que mostrou IDHs seletivamente upregulate Aicda - e Prdm1 -direcionamento miRNAs (figuras 4-6).
Figura 1. Expressão de superfície de células B marcador B220 superfície anticorpo IgG1 e marcador de células plasmáticas CD138 foram analisados por citometria de fluxo.
B220+ IgG1+ células eram células B mudadas para IgG1. B220baixaCD138+ células eram células plasmáticas. A percentagem de células B comutação de IgG1 e células plasmáticas de linfócitos B estimulados com LPS e IL-4 na presença de zero ou HDI (VPA, 500m) para 96 h são indicados como os números dentro dos portões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Expressão de características de RSE concluído; maduras VHDJH-Cγ1 transcrições e transcrições de pós-recombinação Iμ-Cγ1; e Aicda, Prdm1e Xbp1 foram analisados por qRT-PCR, normalizado para Cd79b transcrições e mostrado em um histograma.
Expressão gênica em células B estimuladas com LPS e IL-4 na presença de 500 µM VPA e relevantes para a expressão do gene em B as células com o mesmo estímulo na presença de zero eram representadas como 1. Os dados são de três experimentos independentes. valores de p , emparelhados t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Células B foram estimuladas com LPS e IL-4 e tratadocom com HDI (VPA, 500 µM) ou zero para a expressão de RNAm de 60 h. foi analisado pelo mRNA-Seq
(A) níveis de expressão de mRNA médios de três experimentos independentes (leituras por mil por milhão leituras mapeadas, RPKMs) foram representados em gráficos de dispersão. Cada parcela corresponde a um nível individual de expressão de RNAm. As duas linhas tracejadas são linhas duas vezes. Dispersam parcelas localizadas acima da linha tracejada superior ou abaixo da parte inferior linha tracejada indicar mRNAs que expressam mais de duas vezes ou menos da metade quando induzido por VPA e zero, respectivamente. (B) os gráficos mostram a variação média nos níveis de expressão de RNAm (RPKMs médias de três experimentos independentes) em LPS e células B IL-4 estimulado tratadas com HDI, em comparação com aqueles em células B tratadocom com zero. Só os mRNAs em uma média RPKM > 20 em LPS e B IL-4 estimulado as células tratadas com zero estão incluídas. A expressão do mRNA em cada experiência individual, como mostrado por um gráfico de dispersão (C) ou um gráfico de barras (D), são retratados na mesma maneira como em (A) e (B). valores de p , emparelhados t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Células B foram estimuladas com LPS e IL-4 e tratadocom com HDI (VPA, 500 µM) ou zero para expressão de 60 h. miRNA foi analisado por miRNA-Seq
(A) a mudança nos níveis de expressão de miRNA média no B células tratadas com o IDH comparado a que nas células B tratados com zero eram representadas por gráficos de barras. (B) a alteração dos níveis de expressão de miRNA em B células tratadas com o IDH comparado a em células B tratadocom com zero em três experimentos independentes eram representadas por gráficos de barras. Só os miRNAs em média RPM > 0.5 em LPS e B IL-4 estimulado as células tratadas com zero estão incluídas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. HDI aumenta a expressão de Aicda -direcionamento miRNAs, como mostrado por miRNA-Seq
(A) alinhamento dos miRNAs e seus locais de destino da 3' UTR de mRNAs Aicda . (B) as células B foram cultivadas com LPS e IL-4 na presença ou ausência de IDH (VPA, 500 M) para 60 h. A expressão de miRNAs que foram previstos para alvo Aicda 3' UTR foram analisados por miRNA-seq e retratado como RPM. valores de p , emparelhados t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. HDI aumenta a expressão de Prdm1 -direcionamento miRNAs, como mostrado por miRNA-Seq
(A) alinhamento dos miRNAs e seus locais de destino da 3' UTR de mRNAs de Prdm1 . (B) as células B foram cultivadas com LPS e IL-4 na presença ou ausência de IDH (VPA, 500 M) para 60 h. expressão de miRNAs que foram previstos para o destino Prdm1 3' UTR foram analisado por miRNA-seq e retratado como RPM. valores de p , emparelhados t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo fornece abordagens globais para induzir a comutação de classe B célula e diferenciação de células plasmáticas; para analisar o seu impacto por moduladores epigenéticos, ou seja, IDH; e para detectar o efeito de IDH na expressão do mRNA e miRNA nestas células. A maioria dessas abordagens também pode ser usada para analisar o impacto do factor epigenética na expressão de função e mRNA/miRNA B-célula humana. O qRT-PCR e mRNA-seq/miRNA-seq abordagens também podem ser usadas para analisar as células B isoladas de ratos tratados com moduladores epigenéticas, tais como IDHs.
O modulate epigenéticas pode impactar muitas funções celulares diferentes, tais como a proliferação celular e viabilidade, que pode afetar sua diferenciação de RSE e células plasmáticas. Portanto, proliferação celular, viabilidade e os ciclos de celular das células B, com ou sem tratamento de HDI, deve ser analisados. Um dos desafios para a análise da modulação da expressão do mRNA e miRNA por HDI ou outros reguladores epigenéticos por qRT-PCR é escolher um gene de limpeza adequado ou um pequeno RNA. Muitos genes comuns de limpeza podem ser alterados em diferentes graus por moduladores epigenéticas. Os níveis de expressão de muitos genes diferentes de limpeza devem ser medidos e utilizados para normalizar a expressão de genes específicos por qRT-PCR. Esta questão também pode ser abordada pelo mRNA-seq e miRNA-seq, onde a expressão de mRNAs individuais ou miRNAs pode ser normalizada por níveis de mRNA ou miRNA todo o genoma.
mRNA-seq não pode apenas definir o perfil de expressão de RNAm com um pipeline de Bioinformática apropriado, mas esta abordagem também pode definir o perfil há muito tempo não codificante do RNA (lncRNA). mRNA-seq normalmente envolve o enriquecimento da poli + RNAs pela seleção de oligo (descolamento). Como um número de lncRNA são conhecidos por falta de caudas poli (a), a abordagem de mRNA-seq que envolve a seleção de oligo (dT) não é possível determinar a informação completa de expressão lncRNA. Para alcançar uma cobertura completa de perfis de expressão tanto do mRNA e lncRNA, uma abordagem de RNA-seq envolvendo esgotamento rRNA deve ser usada. Na maioria das nossas experiências, nós usamos um kit comercial para extrair o RNA total, incluindo miRNA, por miRNA-seq, seq-mRNA e qRT-PCR. Antes da construção de uma biblioteca de sequenciamento de alta produtividade, a qualidade do RNA total é validada, executando uma alíquota em um RNA, DNA e proteína amostra QC sistema automatizado. Recomenda-se que amostras do RNA tem um RIN número de 7.0 ou superior, se eles devem ser utilizados para a preparação de biblioteca pequena do RNA. Amostras com números mais baixos de RIN tem um percentual maior de produtos de RNA degradados na faixa de tamanho de pequenas espécies de RNA (15-30 nucleotídeos). Quando o número RIN está abaixo de 7,0, a cobertura não será tão bom. Outra opção para amostras de RNA de menos do que o ideal é realizar uma abordagem de depleção do rRNA, em vez de uma abordagem de isolamento do mRNA, mas isto requer que as amostras sejam pelo menos 10 ng/mL.
Os protocolos para mRNA-seq usados aqui são otimizados para 100-1.000 ng do RNA total. Para miRNA-seq usando menos de 100 ng do RNA total, preparação de biblioteca pequeno RNA-seq deve seguir um mais sensível pequeno RNA-seq protocolo da preparação, que aproveita a estrutura natural comum à maioria das moléculas microRNA conhecido. Os miRNAs mais maduros tem um 5'-fosfato e um grupo de 3'-hidroxila como resultado seu caminho biogênese. Devido a isso, os adaptadores de 3' e 5' neste kit estão diretamente ligados a miRNAs.
Para analisar o impacto do IDH na célula B mRNA e miRNA expressão na vivo, os ratos podem ser tratados com VPA ou outros IDHs adicionando este IDH para a água potável e a injeção intraperitoneal destes ratos com antígeno T-dependente NP-CGG ou T-independentes antigénio NP-LPS pode ser executado. As células B podem ser purificadas do baço 10 dias após a imunização.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas 105813 AI e AI 079705 (para PC), a Aliança para identificação de alvo de pesquisa de Lúpus no lúpus Grant ALR 295955 (para PC) e a pesquisa da artrite National Research Foundation concedem (a HZ). TS foi apoiado pelo centro médico de Pediatria, segundo Xiangya Hospital, Universidade de South Central, Changsha, China, no contexto do programa visita Xiangya-UT escola de medicina, San Antonio de estudante de medicina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
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