Abstract
Zebravisembryo's vormen een ideale experimenteel systeem om complexe morfogenetische processen te bestuderen vanwege hun gemakkelijke toegankelijkheid en optische transparantie. Vooral achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling waarbij meerdere weefsel vervormingen werken samen om de vorming van een groot deel van de lichaamsas sturen. Om dit proces te observeren door langdurige time-lapse imaging moet een bevestigingstechniek waarmee voldoende steun monsters in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en verkrijging gebruiken. Daarnaast moet de montage ook voldoende bewegingsvrijheid voor de uitgroei van de achterste lichaamsgebied zonder aantasting van de normale ontwikkeling. Tenslotte moet een zekere veelzijdigheid van de montagewijze beeldvormende worden vrijgemaakt voor diverse imaging setups. Hier presenteren we een bevestigingstechniek voor beeldvorming van de ontwikkeling van achterste lichaam elongation in de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl de achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. We zullen zien hoe dit kan worden aangepast voor rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie set-ups. Hoewel dit protocol is gericht op montage embryo's voor beeldverwerking met het achterste lichaam, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de live imaging meerdere aspecten van zebravis ontwikkeling.
Introduction
Achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling van het embryo zich een groot deel van de lichaamsas vormen. Het is een voorbeeld van een complex morfogenetisch proces waardoor meercellige gedrag optreden coördinerend de morfogenese op het niveau van afzonderlijke weefsels genereren. Deze differentiële weefsel vervormingen dan samenwerken om de verlenging van het achterste lichaam te genereren in de hele structuur niveau. Om te begrijpen hoe deze processen worden aangestuurd en gecoördineerd tijdens de ontwikkeling, moeten we in staat zijn om deze processen op verschillende schalen te volgen (dat wil zeggen op het niveau van moleculen, cellen, celpopulaties en weefsels) en deze rechtstreeks verband houden met de morfogenese van de gehele structuur .
Zebravis embryo's zijn ideaal voor imaging achterste lichaam rek als hun optische transparantie en de geringe afmetingen zorgt voor de toepassing van minimaal invasieve licht imaging benaderingen zeer geschikt voor live beeldvorming. 1 Dit werd aangetoond door een aantal recente publicaties die gebleken werpen op achterste lichaam ontwikkeling op moleculair niveau, 2 enkele cellen, 3 en inter-weefsel gedrag, 4 en op het niveau van de celpopulatie en hele organen. 5
Geavanceerde imaging technieken zoals confocale, multi-foton microscopie en selectieve vliegtuig verlichting microscopie (SPIM) worden waardoor de lange termijn beeldvorming van ontwikkelingsprocessen met een verminderde werking van het licht toxiciteit en foto-bleken. Robuuste technieken voor de bevestiging van levende monsters nodig heeft drie doelen: 1) voldoende steun aan de bemonsteringen in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en tijdens acquisitie, 2) voldoende bewegingsvrijheid van het monster om de uitgroei van het achterste lichaam regio zonder dat zijn normale ontwikwikkeling, en tenslotte 3) een zekere mate van veelzijdigheid van de montage-methode om imaging staan op diverse imaging set-ups.
Dit protocol introduceert een bevestigingstechniek voor het afbeelden van de ontwikkeling van de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl het achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. Als zodanig is het ook een geschikte methode voor de lange termijn beeldvorming van andere delen van het lichaam ontwikkelen als agarose maakt beeldvormend standaardfitting beeldvormingstechnieken. Dit protocol demonstreert montage van embryo's in een zijwaartse richting, maar het is ook mogelijk om embryo's in alteratieve oriëntaties monteren. Het zal verder zien hoe u de methode voor het rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie opstellingen aan te passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Solutions en trok glazen naald
- Wordt 25x voorraadoplossing van tricaïne (3-amino benzoëzuurethylester, ook wel ethyl 3-aminobenzoaat) en 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 en breng deze oplossing bij pH 7. Aliquot van 4 ml en bewaar bij -20 ° C.
LET OP: De verdoving tricaïne werkt bij voorkeur op neurale-voltage-gated natriumkanalen waardoor spiertrekkingen en beweging 6 blokkeren. - Maak een werkoplossing van tricaïne bij een uiteindelijke concentratie van 0,17 mg / ml in E3 embryo medium. 7
LET OP: Maak de tricaïne werkende oplossing ex tempore als de pH van deze oplossing drijft. - Los het lage smeltpunt agarose tot een uiteindelijke concentratie van 1,5% in E3 embryo medium in een 50 ml buis door verwarming van de oplossing in een magnetron. Laat deze oplossing in evenwicht tot 42-45 ° C in ofwel een waterbad of bench-top incubator. Als voorbereiding van grote schotels voor verticalelight-sheet imaging (stap 4), maak dan een extra 25 ml van 1% -norm smeltende agarose in E3 embryo medium.
- Gebruik borosilicaatglas met filament capillairen met een afmeting van 1,20 mm OD, ID 0,69 mm, lengte 10 mm.
- Als haarvaten worden getrokken van het type verwarming filament naald puller in de tabel van de apparatuur en reagentia, gebruik de volgende instellingen beschreven: Heat 600, Pull 120, Velocity 50, Time 225, Pressure 500. Met een paar scherpe tang, breken de naald net voorbij het punt waar het buigt om een schone en scherpe naald voor het oriënteren embryo's en het verwijderen van overtollige agarose creëren. Een micro-scalpel kan ook worden gebruikt om overtollige agarose te verwijderen.
2. Inbedding van embryo's voor Inverted of Upright Microscopy
- Breng de embryo's tot aan de juiste fase in E3 embryo medium. 7
- Aan het vereiste stadium dechorionate embryo met een paar scherpe tang onder een binoculaire dissecTing microscoop.
- Incubeer de dechorionated embryo gedurende tenminste 5 min in tricaïne werkoplossing.
- Zodra de gesmolten agarose oplossing afgekoeld tot 45 ° C, gebruikt een glazen Pasteur pipet om de dechorionated embryo direct in de 50 ml buis met minimale overdracht van E3 medium.
- Verwijder embryo samen met ongeveer 1 ml van de montage medium en voeg ong. 100 ui samen montage medium met het embryo van de centrale cirkel van een 35 mm glazen bodem petrischaal met een 10 mm microwell.
- Aangezien het fixeermiddel plaatst, beweegt het embryo naar de rand van de cirkel van agarose met de staart naar buiten (Figuur 1A). Gebruik de capillaire naald voor het embryo handhaven de gewenste zijwaartse richting totdat de gel volledig is ingesteld. Om het achterste lichaam ontwikkeling, zorg om het embryo in als zijwaartse een oriëntatie mogelijk te oriënteren. Daarom onderhouden van de embryo in deze positie door zorgvuldige adjustments met de capillaire naald.
OPMERKING: meerdere embryo's kunnen worden toegevoegd aan de montage schotel op dit punt, indien nodig. Als dit het geval brengt de laagsmeltende agarose in de schaal eerst en voeg het embryo naar het midden van de agarose druppel. Druk vervolgens de embryo's op de randen van de glazen ring en oriënteren in de gewenste positie. Tot zes embryo's kunnen op deze manier voor de agarose wordt gestold worden gemonteerd.
3. Verwijdering van Excess Agarose Around the Posterior Body
NB: Dit deel beschrijft de procedure waarmee agarose uit de regio rond het achterste lichaam wordt verwijderd. Bij achterste lichaam rek, is het belangrijk dat de staart kan groeien-out normaal. Door het verwijderen van de agarose nadat het embryo volledig is opgenomen door agarose, wordt het embryo links omsloten door het kopgebied en ongeveer de helft van de dooierzak.
- Nadat de agarose druppel heeft ingesteld, overspoelen de petri dish met de tricaïne werkende oplossing.
- Onder een microscoop ontleden verrekijker met een verzonden licht base, pas de spiegel positie en de hoek van invallend licht, zodat het sterke contrast maakt de bezuinigingen in de agarose duidelijk worden gezien door de operatie.
- Uitvoeren gesneden 1 (figuur 1) Gebruik de capillaire naald of micro-scalpel om de agarose halverwege langs de dooier snijden, vanaf een plaats juist achter het vormen hart veld de positie van de somite 5 (de 5 e anterior somite).
- Start de eerste cut grenst aan de vorming van het hart, zoals aangegeven, en de volledige weg door de agarose aan het glas.
- Houd de capillaire of micro-scalpel diep in de agarose, en langzaam zag op en neer, terwijl begint een lange snee boven het embryo te maken, zoals getoond figuur 1. Gesneden zo dicht mogelijk bij het embryo mogelijk zonder doorboren het embryo of de dooier.
- Vervolgens bezuinigen 2 en 3 (figuur 1 Opmerking: Het snijden van de agarose tot de rand van het glas cirkel (zie figuur 1) helpt bij het verwijderen van de agarose als een volledig blok (stap 3,6). Dit is echter niet noodzakelijk.
- Vanaf de kruising van bezuinigingen 1 en 3, maak een langzame diagonale snede aan het einde van de snede 2, terwijl langzaam te tillen boven het oog op het plein van agarose rond de achterste lichaam los te maken.
Notities: In sommige gevallen wordt dit vrijgegeven in een blok en de operatie in één keer voltooid. In andere gevallen kan het enkele pogingen ondernemen om dis-lodge alle agarose rond het embryo. - Met een paar scherpe tang, verwijder de verdreven bsloten agarose uit het embryo medium. Om te helpen bij dit proces, beweegt de stukken agarose aan de kant van de schaal en het gebruik van de wand van de petrischaal ondersteuning tijdens het optillen van de stukken agarose.
Figuur 1: Schema's van Montage Set-ups. (A) Het diagram toont de positie van de gemonteerde embryo in het centrum glasring van een petrischaal. Aan de rechterkant is een gezoem van de embryo met elke opeenvolgende snede door de omliggende agarose getoond met dottted rode lijnen. (B) De gemonteerde embryo wordt schematisch in zijaanzicht het weergeven van de gemakkelijke toegang voor zowel omgekeerd en rechtop doelstellingen. (C) Een soortgelijke digram toont hoe embryo's kunnen worden gemonteerd voor verticale licht sheet beeldvorming set-ups. Gelieve click hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Als spiertrekkingen niet volledig geblokkeerd is op dat punt, druppels tricaïne toe te voegen uit de voorraad oplossing van 4 mg / ml, pH 7.
4. Montage van embryo's voor Vertical Light-sheet Microscopy
Opmerking: Dit is een variatie op de hierboven beschreven werkwijze die het mogelijk maakt voor de toegang van meerdere doelen voor beeldvorming steekproefsgewijs verticaal georiënteerde SPIM. Het idee achter deze wijziging is het monster iets hoger dan de bodem van de schaal te heffen, zodat gemakkelijk naar de twee imaging doelen.
- Vóór montage monster, laag een 100 mm plastic petrischaal met 1% agarose in E3 medium tot een hoogte van 5 mm en laat opstijven.
- Een druppel van 1 ml laag-smeltpunt agarose naar het midden van de schaal en laat opstijven.
- Embedden embryo's in laag-smeltpunt agarose zoals in hoofdstuk 2. Echter, dit keer, verwijder het embryo uit de 50 ml buisagarose met een kleinere druppel van oplossing (0,5 ml) en plaats deze kleine druppel boven de 1 ml vallen in het midden van de schaal.
- Gebruik de capillaire naald om het embryo te plaatsen in het midden van het druppeltje en de correcte positie te houden totdat gel ingesteld.
- Overspoelen de schotel met tricaïne werkende oplossing en verwijder de overtollige agarose zoals in hoofdstuk 3, maar zonder te snijden door middel van het kussen van de 1% -norm agarose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol hierboven geschetste Gegevens een veelzijdige techniek voor de montage van de zebravis embryo's voor de lange termijn time lapse imaging. Een voorbeeld hiervan wordt getoond in figuur 2A en geanimeerde / video Figuur 1. Embryo's werden geïnjecteerd op de 1 cellig stadium met mRNA dat codeert voor het fluorescerende eiwit photoconvertible kikumeGR. Aan het 15 somiet fase werden zij geplaatst zoals hierboven beschreven en afgebeeld gedurende 12 uur op een omgekeerde confocale microscoop met een 10X objectief. De resulterende confocale stapels werden maximaal geprojecteerd te worden weergegeven zoals ze zijn. Deze film toont duidelijk dat de achterste lichaam vrijelijk gedurende de duur van de film beweegt en toont soortgelijke veranderingen in morfologie zoals gezien in embryo's die zich vrij van het chorion in normale kweekomstandigheden ontwikkelen.
Een ander voorbeeld is getoond in F 2B igureen bewegende / video Figuur 2. Hier werden embryo geïnjecteerd op de 16 cellig stadium met een combinatie van mRNAs coderend histon 2B-mCherry eiwit (dat labelt de kernen) en eGFP: CAAX box (die labels membranen voor details zie referentie 5). Zij werden vervolgens afgebeeld op een rechtopstaande multiphoton microscoop met een onderdompeling in water 25X objectief schematisch weergegeven in figuur 1B. Beelden werden genomen gedurende 3 h uit de 10 somiet fase teneinde cellulaire gedrag visualiseren tijdens tailbud formatie. Cellen kunnen worden gezien worden genereren actieve uitsteeksels en gerichte bewegingen als de tailbud vormen die normaal.
Figuur 2: Voorbeelden van Time-lapse beeldvorming van posterior Body Rek bij 10 X vergroting. (A) Opeenvolgende framesvan een representatieve film die het proces van axiale verlenging. Embryo's worden getoond in zijaanzicht met posterior naar de rechterkant van het beeld. (B) opeenvolgende frames van een hogere vergroting film toont individuele cel gedrag tijdens tailbud formatie. Embryo's worden getoond in zijaanzicht met posterior naar rechts. Gestippelde lijnen een overzicht van de vormen tailbud. Kleine gekleurde lijnen vertonen sporen van kernen aan individuele cel bewegingen volgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Animated / Video Figuur 1: Time-lapse film van posterior Body Verlenging van een KikumeGR mRNA geïnjecteerd zebravis embryo door confocale microscopie. Embryo wordt getoond met anterior naar links en posterIOR naar rechts. Beelden werden genomen op 10 min tussenpozen 10x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Animated / Video Figuur 2: Time-lapse film van posterior Body Verlenging van een nucleair-mCherry en Membraan-GFP gelabelde zebravis embryo afgebeeld door twee-foton microscopie. Embryo wordt getoond met anterior naar rechts en posterior naar links. Beelden werden genomen op 2 min tussenpozen 25X vergroting. Gekleurde lijnen tonen sporen van cellen voor de laatste tien time-stappen voor elke bijgehouden cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze montage techniek maakt het mogelijk embryo's nog steeds tijdens de overdracht aan de microscoop en op lange termijn time-lapse imaging experimenten gericht op het volgende achterste lichaam rek bij meerdere lengteschalen worden gehouden. Bovendien is veelzijdig doordat het zorgt voor beeldvorming zowel rechtop en ondersteboven microscopie opstellingen en een suggestie gedaan voor hoe dit verder kan worden aangepast om verticaal georiënteerde SPIM.
Een kritische stap in dit protocol is het voorzichtig verwijderen van overtollige agarose rond het achterste lichaam dat belangrijk teneinde de normale ontwikkeling van deze structuur. Het is belangrijk om te zorgen hier nemen geen beschadiging van de embryo, met name bij het verwijderen van de agarose rond de bovenkant van de dooier. Bovendien moet erop worden gelet bij het verwijderen van de gesneden agarose blok van hele embryo, zoals soms het mogelijk is om het embryo uit de mal verliest tijdens dit proces. Daarom is dit een lage-throughput product watt is niet geschikt voor de montage van vele zebravisembryo's tegelijkertijd, in tegenstelling tot eerder gepubliceerde werkwijzen die gebruik maken 3D bedrukte plastic mallen. 8, 9 echter embryo's zeer stabiel bij deze montagewijze en daarom worden getransporteerd naar de microscoop veel gemakkelijker en behouden hun 3D oriëntatie door achterste lichaam rek.
Een andere belangrijke stap is de nauwkeurigheid van de eerste laterale richting van het embryo, vermijden antero-posterior en dorso-ventrale tilt. Ofwel tilt zal de laterale visie op de achterste lichaam uitbreiding, die is de meest handige kijkhoek voor verdere analyse in de weg. De antero-posterieure tilt zal bovendien resulteren in het achterste lichaam groeien of omlaag ten opzichte van het horizontale vlak, waarbij de overname van meer gestapeld in z en dus tijd vervalt met een lagere tijdresolutie betekent.
Deze methode is versatile en is toegestaan voor beeldvorming van celdelingssnelheid met behulp van de Fucci regel 5, 10 en multiscalaire morfometrische analyses. 5 Gezien de dramatische totale verplaatsing van de tailbud tijdens de verlenging van het achterste lichaamsas, slechts relatief lage doelstellingen vergroting kan worden gebruikt om het gehele proces, vast te leggen zoals weergegeven in figuur 2. Dit komt omdat hogere vergroting resultaten in het gebied van belang het gezichtsveld binnen 3 verlaten - 4 h acquisitie (Video figuur 1). Daarom is een manier om de beeldvorming van de tailbud verdere verbetering is een geautomatiseerd volgalgoritme dat de totale beweging van de tailbud kan volgen en de x, y, z positie van de microscooptafel passen tijdens acquisitie hebben. Gezien de toegenomen stabiliteit van het embryo in alle axiale afmetingen van de montagewijze beschreven, moet vatbaar zijneen dergelijke aanpak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
- Schröter, C., et al.
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
