Abstract
doença isquêmica do coração (DIC), ou síndrome coronariana aguda (SCA), é uma das principais causas de morte nos Estados Unidos. DIC é caracterizada por fornecimento reduzido de sangue ao coração, resultando na perda de oxigénio a que se seguiu e a necrose do músculo cardíaco. O modelo MI ganhou popularidade por seu uso como modelo de isquemia-reperfusão de curto prazo e um modelo de ligadura permanente de longo prazo. A seguir, descrevemos um método confiável para a ligadura permanente da LAD. Com rato tecnologia de engenharia genética cada vez mais avançadas, e com uma crescente disponibilidade de instrumentos cirúrgicos murino de qualidade, o rato tornou-se um modelo popular para cirurgias MI. Nosso modelo cirúrgico incorpora o uso de um anestésico facilmente reversível para a rápida recuperação do mouse; uma intubação endotraqueal minimamente invasivo, sem envolver uma traqueostomia; e uma thoracentesis através do site toracotomia original, sem a criação de uma incisão adicional no peito, como éfeito em alguns outros métodos, para remover eficazmente o excesso de sangue e ar a partir da cavidade torácica. Este método é relativamente menos invasivos do que outros métodos, o que reduz dramaticamente complicações e mortalidade cirúrgica e de pós-cirúrgicas e melhora a reprodutibilidade.
Introduction
Doença coronária, ou ACS, é o evento cardiovascular mais prevalente e será considerada a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo em 2020 1. A causa de ACS é a presença de uma trombose do miocárdio devido à ruptura de uma placa aterosclerótica coronária que bloqueia ou reduz o fluxo de sangue para o tecido do coração 2. Portanto, há sinais clínicos consistentes com a presença de isquémia miocárdica aguda, tais como o enfarte do miocárdio (MI) de 3, 4. MI leva a uma perda de massa dos cardiomiócitos e uma progressão para o remodelamento ventricular patológica, o que pode levar à disfunção ventricular e insuficiência cardíaca 5, 6.
Uma das formas mais eficazes para estudar DIC tem sido a de imitar a enfarte do miocárdio humano num modelo animal. Isto é conseguido por oclusão da LAD emratos. Usando esse modelo, estudamos como o coração pode ser protegido contra os danos resultantes de DIC.
Durante a última década, os pesquisadores mudaram de utilizar modelos animais maiores para pequenos animais, incluindo a mudança de ratos para camundongos. O modelo mais pequeno rato está começando a ser preferido por muitas razões, incluindo o seu tamanho pequeno, tamanho grande maca, baixo custo de manutenção, e de curto período de gestação, assim como para a disponibilidade expansiva de transgénicos e knockout do gene modelos 7. Embora os ratos são pequenos em tamanho, os novos instrumentos cirúrgicos projetado especificamente para eles ter ajudado neste desenvolvimento. Nosso método utiliza estes novos instrumentos cirúrgicos.
Embora vários métodos de implementação de uma traqueotomia invasivo, usamos um método menos invasivo da intubação endotraqueal. Usando iluminação sobrecarga da orofaringe, que entubar sem criar nenhuma incisão, proporcionando uma experiência mais segura e menos traumática para tEle animal. O rato é em seguida colocado num ventilador e mantido em isoflurano durante todo o procedimento. Devido à curta duração da anestesia produzidos pela droga, demora apenas alguns minutos para que o animal recuperar da anestesia, uma vez que é descontinuada. Nosso modelo cirúrgico inclui também um thoracentesis minimamente invasiva. A remoção cuidadosa do sangue e excesso de ar a partir da cavidade torácica Toracocentese através da incisão inicial toracotomia abordou uma complicação pós-operatória comum da ligadura LAD: a tensão pneumotórax. Este método, o qual elimina a necessidade das duas incisões adicionais utilizados noutros métodos de-um para o outro para traqueostomia e o menor número de complicações pós-cirúrgicas toracentese-rendeu e reduziu drasticamente a mortalidade.
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Protocol
Este protocolo animal foi analisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) no Hospital Rhode Island.
1. A anestesia e intubação
- Pesa-se o rato para calcular a dosagem de medicação para a dor pós-operatória.
- Colocar o rato numa câmara de indução e entregar 4% de isoflurano para 9-10 min, monitorizando o animal ao longo. Ligar um esterilizador quente talão de modo que o aparelho pode pré-aquecer a aproximadamente 250 ° C. O pré-aquecimento levará 15 - 20 min.
- Uma vez que o rato atinge um plano de profundidade de anestesia, a respiração com uma taxa de cerca de 32 respirações / min, colocar o rato supina sobre uma placa de Styrofoam e usar uma banda elástica fixada sob os incisivos superiores para segurar a boca aberta. Confirmar sedação através da realização de uma pitada dedo do pé. Posicionar um iluminador de alta intensidade acima do rato de modo que a orofaringe pode ser visualizado.
- Use uma pinça curva para abrir a garra e outro parde fórceps para erguer a língua para fora do caminho. Certifique-se de entubar enquanto posicionado no ou ligeiramente abaixo do nível dos olhos com o corpo do mouse. O uso de lupas cirúrgicas é recomendado.
- Visualize a abertura e fechamento das cordas vocais. Quando abertas, inserir um calibre 20, 1-na (IV) de cateter intravenoso com um introdutor de agulha de ponta romba. Usar a agulha para guiar o cateter para a abertura da traqueia, mas evitar a inserção da agulha para dentro da traqueia. Verificação do posicionamento correto pode ser feito usando uma pipeta de plástico.
- Transferir o rato entubados para uma superfície operacional equipado com um dispositivo de aquecimento. Ligue o rato a um pequeno ventilador de roedor definido como um volume de curso de 150 uL / acidente vascular cerebral e uma taxa de acidente vascular cerebral de 130 cursos / min.
- Fornecer 2,5% de isoflurano. Verifique a intubação, marcando a expansão do tórax bilateral. Verifique anestesia através da realização de uma pitada dedo do pé. O rato pode precisar de 5 - 10 min sobre o ventilador para se tornar totalmente anestesiado.
- Fita para baixo do tubo de intubação no local de ligação entre o ventilador e o cateter IV. Tape as extremidades. Coloque gotas lubrificantes estéreis sobre os olhos.
- Aparar o lado ventral esquerda do tórax com uma máquina de barbear eléctrica. Poeira da pele rapada com toalhetes secos e aplicar uma pequena camada de creme de depilação usando uma mecha de algodão estéril. O creme deve permanecer em contato com os folículos pilosos para aproximadamente 30 - 45 s.
- Enquanto os processos de creme, colocar três cotonetes estéreis em três tubos de 1,5 ml, cheio com Betadine para embeber. Usando lenços umedecidos com água destilada, limpe suavemente o creme e pele.
- Limpar o campo cirúrgico três vezes, alternando Betadine e estéreis de 70% de isopropanol almofadas de preparação, limpeza com um movimento circular em movimento do centro para a periferia. Coloque uma cortina estéril com um buraco do tamanho de um quarto de todo o campo cirúrgico do mouse.
- Limpar a área em torno do mouse com 70% de etanol. Verifique anestesia mais uma vez com uma pitada dedo do pé.
3. LAD Ligadura
- Colocar os instrumentos cirúrgicos autoclavada em esterilizador quente talão pré-aquecido a 250 ° C durante aproximadamente 20 s. Coloque os instrumentos esterilizados no campo cirúrgico autoclavado estéril. Don luvas cirúrgicas.
- Use uma pinça de ponta fina para levantar delicadamente a pele em um ponto aproximadamente 5 mm à esquerda da cartilagem xifóide proeminente. Usar um bisturi cirúrgico com uma lâmina n ° 10 para criar uma incisão vertical na pele a partir deste ponto para cima, para o nível do manubrium.
- Use uma pinça curva para separar delicadamente as camadas da pele e músculo. Abrir a camada muscular, após a incisão na pele. Inserir dois 5-0 suturas de polipropileno através da camada muscular, uma em cada lado da incisão, e assegurar que as suturas temporariamente com grampos para segurar a camada de músculo aberto.
- Identificar e fazer uma incisão no terceiro espaço intercostal, seguindo oângulo natural da caixa torácica. Retire a fita a partir das extremidades esquerdo do mouse e garantir o seu pé traseiro esquerdo para seu pé direito traseiro com fita adesiva. Cortar um pedaço maior de fita e assegurar o seu pé frontal esquerda para a superfície operacional numa posição ligeiramente elevada. Limpe as luvas com 70% de etanol.
- Utilize um afastador para espalhar delicadamente para além dos 3 º e 4 º costelas. Cortar uma pequena secção de gaze estéril, aproximadamente 1 em x ½ em, e mergulhá-lo em solução salina estéril a 0,9%. Espremer para fora o excesso de soro fisiológico e utilizar uma pinça para inserir suavemente a gaze contra o pulmão esquerdo para prevenir danos nos pulmões acidental durante o procedimento.
- Suavemente remover o pericárdio fina com uma pinça.
- Rasgar uma pequena quantidade de algodão off um cotonete estéril e enrolá-lo em uma pequena bola. Mergulhar esta bola de algodão em solução salina estéril a 0,9% e limpe suavemente sobre a superfície do coração para apreciar as artérias. Suavemente empurrar a aurícula esquerda para cima e para localizar as artérias coronárias sobNeath.
- Identificar o LAD e passar um fio de sutura 8-0 de nylon sob a LAD; completa dois lances para garantir a ligadura. Se a ligação for bem sucedida, o ventrículo esquerdo distai do branquear vontade ligadura.
- Utilizando uma pinça, retire a gaze inserido anteriormente, e em seguida, remover suavemente o afastador. Inserir uma 6-in, de calibre 25 de tubo flexível ligada a uma agulha de calibre 25 para dentro da cavidade torácica, através da abertura de toracotomia. Avançar aproximadamente 1 - 2 em de tubagem para dentro do espaço acima do pulmão esquerdo. Devolver o mouse para a posição supina e limpar as luvas com 70% de etanol.
- Use 5-0 de polipropileno em um padrão simples interrompido para fechar a caixa torácica, mantendo o tubo no peito no lugar. Retire as duas suturas segurando a camada muscular aberto. Use 5-0 suturas de polipropileno em um padrão contínuo simples para fechar a camada muscular, novamente mantendo o tubo de peito no lugar.
- Anexar uma seringa de 1 mL para a agulha de calibre 25 na tubo de peito. Com cuidado, puxe para cima na mergulharr ao extrair simultaneamente gradualmente o tubo de peito da cavidade torácica com uma pinça. Extrai-se a tubagem lentamente, como este passo remove o excesso de ar e sangue, que de outro modo ficam presas na cavidade torácica e em resultado um pneumotórax.
- Uma vez que a seringa é cheia, retirar a seringa da agulha e eliminar os resíduos numa proveta ou dissipador de resíduos. Continuar o processo até que o tubo de peito é completamente extraído. Certifique-se que o peito é hermeticamente fechado.
- Diminuir o isoflurano a 1,5%. Feche a pele com 4-0 de polipropileno em um padrão simples interrompido. Ligue o vaporizador isoflurano off.
- Administrar 0,1 mg / ml de buprenorfina em 0,9% de soro fisiológico por meio de uma injecção intraperitoneal (IP). Topicamente aplicáveis 2 mg / ml de lidocaína com 2 mg / ml em Bupivacaína 0,9% de solução salina para a incisão. Administrar entre 200-500? L de 0,9% de soro fisiológico por meio de uma injecção subcutânea, o dimensionamento da quantidade de solução salina para o peso do rato.
- Esperar 5 min após a administering os medicamentos para a dor para remover o rato a partir do tubo de intubação. Isto ajuda na transição do respirador.
- Se o mouse não tem uma elevação do tórax bilateral uma vez fora do ventilador, realizar descompressão agulha. Para o fazer, introduzir uma agulha estéril de calibre 25 e uma seringa de 1 mL entre os dias 3 e 4 th costelas até que ele entra na cavidade torácica, denotada por uma diminuição súbita na resistência. Puxe suavemente o êmbolo para remover o excesso de ar.
- Quando o rato demonstra uma taxa de respiração bilateral adequada e profundidade e responde a uma pitada dedo do pé, coloque o rato em uma gaiola de recuperação limpa sob uma lâmpada de calor. Fornecer o rato com alimentos húmidos e uma garrafa de água, a monitorização em uma câmara de fluxo laminar para 15 - 20 min. Monitor para um esforço exagerado para respirar, sangramento excessivo, ou outras complicações potencialmente fatais.
- Durante os próximos três dias, administrar 0,1 mg / ml de buprenorfina medicação para a dor por meio de um IPprojeç~ao duas vezes por dia. Monitorar o mouse diária.
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Representative Results
Os ratinhos são sacrificados vinte e oito dias após a cirurgia, e os corações são colhidas e examinadas. Os ratos são anestesiados com 50-75 mg / kg de cetamina e 5 - 10 mg / kg de xilazina. Quando o animal está sob anestesia adequada, a cavidade torácica é aberta, e utilizando uma agulha de calibre 23, cloreto de potássio frio (KCL, 30 mM) é injectado na região posterior da basal do coração. O coração é preso em diástole. Para mais a validação da ligadura, o coração é retirado do animal e é injectado com 4% de paraformaldeo e, em seguida, 1% de corante azul de Evan. A Figura 1 mostra a ausência de azul de Evan no ventrículo esquerdo isquémica. A Figura 2 mostra uma configuração adequada entubação endotraqueal. A Figura 3 mostra a colocação do dreno para o toracentese no local da incisão inicial, com a camada de músculo fechada por sutura em torno do tubo antes da extracção do ar a partir do chest cavidade. Tricromo mostra um aumento em colagénio na região enfartada (Figura 4).
Figura 1: Injeção azul de Evan. A injecção de azul de Evan revela uma falta de corante no tecido isquémico, localizada ao ventrículo esquerdo região enfartada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A intubação endotraqueal. Demonstração de uma configuração adequada entubação endotraqueal. O operador, usando lupas cirúrgicas, está sentado ao nível dos olhos com o mouse. Um iluminador de alta intensidade é focada para baixo para a região de traqueal, transiluminação o oropharynx. Uma banda elástica é enganchado por trás dos incisivos superiores, permitindo que o operador abra a boca com as pinças curvas. As pinças curvas são usadas para segurar a língua para o lado para visualização clara. Uma cânula de cateter intravenoso de intubação com um introdutor de agulha de ponta romba é avançada com uma ligeira inclinação para cima, enquanto a abertura e fecho das cordas vocais é visualizada. Visualização das cordas vocais abrindo e fechando antes da tentativa de intubação é um dos pontos críticos para a intubação bem sucedida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Toracocentese. A colocação do tubo de peito usado para toracentese, inserido no local da incisão inicial. A camada de músculo está fechada por sutura em tornoo tubo antes de o ar dentro da cavidade torácica é extraído com uma seringa, e, em seguida, o tubo de peito é removido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração Trichrome. Painel esquerdo: Coração de controle, não-LAD-ligado. Painel direito:, coração infartado ligados-LAD. Tricromo (Masson) empregando solução Biebrich escarlate-fucsina ácida, uma solução de ácido fosfotúngstico / fosfomolíbdico, e azul de anilina revela um aumento de colagénio (azul), como um marcador para a fibrose no ventrículo esquerdo região enfartada em corte transversal. Bar = 500. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Com uma crescente utilização do modelo MI em laboratórios, o procedimento descrito visa aumentar a taxa de eficiência e de sobrevivência dos ratos, minimizando a dor pós-operatória e desconforto. Este protocolo se esforça para minimizar a mortalidade, fazendo inúmeras melhorias para vários aspectos do procedimento LAD ligadura. Existem algumas distinções. Alguns estudos de intubação murino que utilizam cetamina e xilazina, juntamente com isoflurano para a indução, devido ao benefício de sua maior duração da anestesia, mostraram aumento da mortalidade 8. Nosso método utiliza apenas isoflurano para a indução, reduzindo o potencial de complicações relacionadas com a droga. Outro protocolo LAD ligação semelhante inclui uma traqueotomia, produzindo um tempo de recuperação prolongado e uma maior necessidade de formação precisa 9. O processo aqui descrito utiliza um método não-invasivo de intubação endotraqueal, resultando em lower mortalidade e maior reprodutibilidade dos resultados. Além disso, em vez de usar apenas uma máquina de barbear eléctrica, o nosso processo utiliza também creme de depilação para a remoção da pele, proporcionando uma visualização completamente clara do campo estéril em menos de 1 min.
Outra distinção chave é o reposicionamento do rato, que ocorre depois, em vez de antes, as incisões iniciais. Fazendo as incisões enquanto o mouse é supina permite uma visualização mais direto e preciso de marcos, como a cartilagem xifóide, resultando em maior reprodutibilidade dos resultados. Nosso método também utiliza cotonetes estéreis em vez de um Cauter de sangramento gestão, diminuindo queimaduras iatrogênicas e o risco de infecção. Para além destas diferenças, a inserção de dreno de tórax para a toracocentese é especialmente digno de nota, como o nosso método não envolve a criação de uma nova incisão para o tubo. Em vez disso, ele envolve a inserção do tubo para dentro de uma incisão anterior, diminuindo novamente mortalidade. O procedimento também descrever inclui: (1) o uso de um afastador, permitindo uma visualização mais precisa e estável das artérias coronárias; (2) a inserção de gaze estéril para a cavidade torácica durante o procedimento, reduzindo, assim, o risco de lesões pulmonares iatrogénicas; e (3) a administração de uma solução salina seguindo o processo, o que tem sido demonstrado que tanto a encurtar o tempo de recuperação e evitar a hipotermia.
Embora nós descrevemos um modelo de ligadura permanente, este procedimento também pode ser modificado para um modelo de infarto agudo do miocárdio. O modelo de enfarte agudo do miocárdio, também descrita como a isquemia e reperfusão, refere-se a 30 - 60 minutos de isquemia seguida de reperfusão no tecido cardíaco 7. Um método alternativo para avaliar o tamanho do enfarte ou a área em risco após isquemia e reperfusão é a coloração de 2% de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) 10. colorao TTC baseia-se na capacidade de manchar tecido viável após o insulto isquémicodevido a desidrogenases presentes no tecido cardíaco. Estas enzimas convertem um componente solúvel em um componente vermelho insolúvel, delineando assim a região enfartada 11. O modelo de enfarte agudo do miocárdio pode imitar os mecanismos que ocorrem na doença de coração humano e, portanto, pode ser uma ferramenta útil para elucidar os acontecimentos de isquemia miocárdica 10. A ligadura LAD pode ser verificado observando-se uma mudança imediata na cor do tecido, proporcionando uma vantagem para este método de induzir uma MI. Outro método para verificar se há ligação bem sucedida é o uso de electrocardiogramas, embora isso envolve o uso de equipamento caro e pode não ser viável para todos os laboratórios.
Como descrito acima, existem várias técnicas moleculares fáceis e acessíveis para confirmar a ligação após a colheita do coração. As duas técnicas mostradas acima são a coloração azul de Evan e tricromo. corante azul de Evan é injectado directamente no arco da Aorta, indicando onde existe uma falta de fluxo de sangue. Este é um método rápido e eficiente empregue imediatamente após a colheita do coração para testar se o modelo foi bem sucedida e para medir o grau de obstrução coronária. Para tricromo, o coração deve ser seccionado e, em seguida, submetidos a imuno-histoquímica. Tricromo pode indicar áreas fibróticas pós-isquémicas cardíacas ou áreas afectadas por isquemia crónica. A injecção de pós-operatório ratinhos 2-24 h antes de serem sacrificados com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), um análogo de timidina, é um método eficaz para indicar áreas de replicação de DNA e proliferação celular após isquémia, especialmente no estudos que envolvem a regeneração vascular 12.
Em geral, as limitações do estudo LAD ligação incluem a incidência de mortalidade pós-operatória, causada principalmente pela presença de arritmias cardíacas, sangramento e pneumotórax. Um thoracentesis eficaz, sagacidadehout incisões no peito adicionais (descrito no modo de corrente), e tratamento pós-operatório adequada são necessárias para evitar morbidez e mortalidade nos animais. O acompanhamento muito atento de hipotermia pós-operatória também é crítica. A redução no número de pescoço e peito incisões (por traqueostomia e toracocentese) descrito no método atual vai ajudar a melhorar as taxas de sobrevivência. A evasão de anestésicos pré-operatórias injectáveis aqui descritos também vai melhorar a recuperação pós-operatória dos animais.
A fim de obter uma alta reprodutibilidade, o modelo LAD ligadura exige treinamento e experiência rigorosa. O operador precisa realizar várias semanas de cirurgias para ganhar a capacidade de fazer reprodutível infartos nos locais desejados no coração. Formação e experiência são dois fatores críticos para uma cirurgia de sobrevivência LAD ligadura de sucesso.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Intensity Light Source | Harvard Apparatus | 72-0215 | |
| SurgiSuite Operating Platform | Kent Scientific Corporation | SurgiSuite | Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery. |
| SurgiSuite LED Lighting Kit | Kent Scientific Corporation | SURGI-5003 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize. |
| Small Rodent Anesthesia System | VetEquip Inc. | 901810 | |
| Isofluorane | Piramal Enterprises | 66794-017-10 | |
| Buprenorphine | Rhode Island Hospital Pharmacy | NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Surgical Loupes | Roboz | RS-6687 | |
| Small Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Lubricating Drops | Thermo Fisher Scientific | 19-898-350 | |
| Electric Razor | Kent Scientific Corporation | CL 9990-1201 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Medical Tape | Thermo Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| Betadine | Thermo Fisher Scientific | 19-027136 | |
| 70% Isopropanol Wipes | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Surgical Drapes | Braintree | SP-TS | |
| Surgical Gloves | Thermo Fisher Scientific | 18999102D | |
| 5-0 Polypropylene Sutures | Ethicon | 8630G | |
| 8-0 Nylon Sutures | Fine Science Tools | 12051-08 | |
| Platinum-Cured Tubing | Harvard Apparatus | 72-1042 | 0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter |
| 0.9% Saline | Thermo Fisher Scientific | 19-310-207 | |
| 4-0 Polypropylene Sutures | Ethicon | 8631G | |
| 1 CC Syringe with 25-Gauge Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-100 | |
| Scissors | Kent Scientific Corporation | INSS600225 | |
| Forceps | Kent Scientific Corporation | INS700100 | |
| Cotton Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| IV Catheter, 20-Gauge | Thermo Fisher Scientific | NC9892181 | |
| Retractor | Kent Scientific Corporation | INS 750369 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Dissecting Forceps, Straight | Kent Scientific Corporation | INS 700101 | |
| Dissecting Forceps, Curved | Kent Scientific Corporation | INS 700103 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Kent Scientific Corporation | INS 750451 | |
| Hemostatic Forceps, Curved | Kent Scientific Corporation | INS 750452 | |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS 700131 | |
| Needle Holder | Kent Scientific Corporation | INS 600109 | |
| Scissors | Kent Scientific Corporation | INS 600225 |
References
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