Summary
間葉系幹細胞 (MSC) の小さい割合 (1-5%) が静脈注射または腹腔内炎症コロン1,2ホーム大腸炎症モデルにおけるマウスの調査は示した。本研究は、MSCs の超音波ガイド下心臓内注射が腸への増加のローカリゼーションの結果することを示しています。
Abstract
クローン病 (CD) は、中小企業の一般的な慢性炎症性疾患と大腸です。マウスとヒト間葉系幹細胞 (MSCs) 免疫抑制の可能性があるし、腸管炎症のマウス ・ モデルにおける炎症を抑制する示されているにもかかわらず、彼らのホーミングと有効性1投与経路を制限できます。,3,4,5. 大腸損傷モデルに MSCs のローカル アプリケーションは、大腸の炎症の改善に大きな効果を示しています。しかし、小腸、実験 Crohn 病のひき割りトウモロコシ-1/YitFc (SAMP) モデルにおける炎症のサイトにひと骨髄由来 Msc (hMSCs) のローカリゼーション技術に関するデータの不足があります。この作品では、サンプ マウスで hMSCs 慢性炎症性腸のよ特徴付けられた自発的なモデルの超音波ガイド下心臓内注射用手法について説明します。セックスと年齢-一致炎症無料 AKR/J (AKR) マウスは、コントロールとして使用されました。生体内分布と局在を解析するには、hMSCs いたトリプル レポーターを含むレンチ ウイルスで導入しました。生物発光イメージング; ホタルのルシフェラーゼ (フロリダ州)、成っていたトリプル記者セルの並べ替え; 単量体赤い蛍光蛋白質 (mrfp)切り捨てられた単純ヘルペス ウイルス チミジンのキナーゼ (ttk)、陽電子放出断層撮影 (PET) 画像。本研究の結果は、炎症無料 AKR マウスではなくサンプ マウスの小腸で hMSCs をローカライズする心腔内投与後 24 h を表示します。この小説は、ひき割りトウモロコシ マウスの左心室の hMSCs 超音波ガイド下注入マウスの急速な回復のため最小限の罹患率と死亡率を可能にする携帯配信の高い成功率を保証します。この手法は、小腸の炎症、TNFΔRE6などの他のモデルの MSCs の強化されたローカリゼーションの有用な方法で可能性があります。将来の研究は、動脈内配信で hMSCs の増加のローカリゼーション治療効果の増加する可能性が決定されます。
Introduction
クローン病 (CD) は小型の一般的な慢性炎症性疾患と大腸と腸内細菌7、8にホストの免疫システムの不適切な応答に起因すると考えられます。最近の研究では、マウスとヒト間葉系幹細胞 (MSCs) することができます腸炎症1,3,4、5のマウス ・ モデルにおける炎症を抑制することを示しています。CD9を含む炎症性腸疾患 (IBD) の患者を治療する骨髄や脂肪組織由来ヒト MSCs を使用して複数の進行中の臨床試験があります。MSC 療法の 2 つのルートは、これらの臨床試験に使用されている: 1 つは全身投与を含む (すなわち、静脈内) 内腔 IBD (CD を含む)、および、その他の MSCs の瘻孔の幹細胞のローカライズされたアプリケーション/注入が含まれます肛門周囲 CD 患者の管。最近メタ分析 MSC IBD、全身療法の (すなわち、静脈内投与) で (CD 含む) 内腔の IBD のための MSC 治療を 40% に有用であった (95 %ci: 7 79%)、患者の有効性は高く、61% で (95 %ci: 36 85%)、MSCs病気にかかった CD 瘻9にローカルを注入しました。最近の段階 III の多施設プラセボ対照無作為同種脂肪幹細胞治癒、肛門周囲瘻の統計的に有意な臨床および放射能の証拠を示した CD 患者の肛門周囲瘻に直接注入されます。10メタ解析の結果を裏付けます。MSC 療法, CD の静脈内投与の効力感が低い理由は不十分な調査されて、しかし、理由の一つは炎症のサイトに MSCs の不十分なホーミングかもしれません。MSCs (1-5%) 静脈内注入のわずかな割合に達する炎症コロンだけに、残りの MSCs が肺 (初回通過効果)1,2 フィルタ リング大腸炎症モデルにおけるマウスの調査は示した ,5,11,12。複数のマウス研究したがって大腸炎4の動物モデルにおける MSC 管理の腹腔内のルート (i. p.) を使用しています。ただし、効果があると細胞のごく一部に到達し、コロンを接がのみ腫瘍壊死因子誘導性遺伝子 6 蛋白質のような水溶性のパラクライン因子の分泌 (TSG-6)2を関連をも示しています。免疫と治癒の MSC 機構を含むパラクリン; を含む多面的なアプローチTSG-6; のような細胞の近さに依存しない因子近接依存の要因のようなセルとプログラム死リガンド 1 (PD L1);またはジャグ 1。したがって、炎症のサイトに MSC 局在効果9,13あります。実際には、最近の研究は、結腸損傷部位に直接注入する MSCs により血管新生促進血管内皮増殖因子 (VEGF) の分泌によって治癒された示した。その一方で、最小限の癒し効果は静脈注射5後指摘されました。炎症 (すなわち、ひき割りトウモロコシ マウスの小腸) のサイトに局在を増加するには、左心室で MSC の管理にこの超音波ガイド下心臓内注射法が開発されました。画像誘導の注入により成功率が高いにつながるし、罹患率と死亡率を減少する正確な注入になります。また、左心室に MSCs の注入は動脈循環、肺の中に閉じ込めになる前に炎症を起こした小腸を達することができるにそれらを提供します。
本研究では、CD14のひき割りトウモロコシ-1/YitFc (SAMP) マウス モデルにおける注射用ひと骨髄由来 Msc (hMSCs) が使用されました。サンプは、ほぼ 100% 浸透度14小腸炎症を開発する慢性炎症のよ特徴付けられた自発的なマウス モデルです。炎症は細菌叢がない場合は任意の化学的、免疫学的、または遺伝的操作への応答で開発し、人間 CD11が近い。セックスと年齢をマッチさせた炎症無料 AKR/J (AKR) マウス、ひき割りトウモロコシのペアレンタル コントロールのマウスは、この研究で使用されました。
HMSCs は分離され、インフォームド コンセントを使用して検証され、プロトコル15,16以前公開されて後に通常、正体不明のドナーから得られた骨髄 (BM) サンプルから研究室で展開します。MSC 機能拡張、分離後の骨、脂肪細胞、軟骨細胞分化研究室で複数のアッセイ15評価したと。皮下免疫不全 CB17 Prkdc SCID マウス17で hMSCs 含有ハイドロキシアパ タイト/リン酸リン酸行列のセラミック キューブをはめ込むことによって骨の機能分析を行った。キューブの試金は骨と軟骨分化の可能性を示し、個々 の MSC 準備17を評価するための究極のテスト。ホタルのルシフェラーゼ (フロリダ州)、単量体の赤色けい光たんぱく質 (mRFP)、単純ヘルペス ウイルスのチミジンのキナーゼ (ttk ファイルで構成される三重レポーター遺伝子コンストラクトで hMSCs を変換に使用されたレンチ ウイルス注入後 hMSCs生体内可視化、)、変更された骨髄肉腫ウイルス (mnd) プロモーター18によって駆動されます。トリプルの記者でホタルのルシフェラーゼは酵素で hMSCs オキシルシフェリンにその隠れ家の注入ルシフェリンと光子/白色光を生成します。これ生体の光イメージング システム、マウスのライブ hMSCs 可視化できる高感度電荷結合素子 (CCD) カメラ (生物発光) によって検出されます。生物発光イメージング (結合) は、連続ex vivo解析、細胞を追跡するために使用できる重要な手法です。国防部の強力なプロモーターの使用はトリプル融合レポーター遺伝子コンストラクトの連続の式をドライブし、16 週間19以上の注入の hMSCs のイメージングのためできます。HMSCs にくい変換低伝達効率を持ちます。最適化されたプロトコルを使用して、hMSCs 伝達効率が改良され、遺伝子発現の強化された18才だった。フローサイトメトリー mRFP 式 (トリプル レポーター遺伝子の 1 つ) を使用して、最大 83% の高効率で hMSCs を変換する機能を示した。分化アッセイおよび生体内でキューブの試金、軟骨細胞、脂肪細胞および骨17に区別するために導入された hMSCs の能力を発揮しました。
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Protocol
すべてのマウスの実験と研究の手順は、ケース ウエスタン リザーブ大学によって承認された ' s 機関動物ケアおよび使用委員会。評価の協会で手続きを行った、実験動物管理 (AAALAC) 認定認定施設。BM はインフォームド コンセント後ケース ウエスタン リザーブ大学で幹細胞の中核施設が大学病院治験審査委員会承認の議定書の下で吸気だった
。1 文化伝達ひと骨髄由来間葉系幹細胞 (hMSCs)
注: hMSCs の分離以前の出版物 15 の詳細については 、。 20
。- 文化分離ダルベッコの hMSCs ' 10% 牛胎児血清 (FBS) s ワシの変更中-低血糖 (DMEM LG) 培。37 ° C、湿度 95%、および 5% CO 2 T175 成長培地を 25 mL のフラスコでの細胞を培養します。媒体ごとに 3-4 日を交換します。14 日の hMSCs 主通路を実行します。
- ときセル 80% 合流点に到達、古いメディアを完全に削除、優しく洗浄滅菌リン酸緩衝生理食塩水 5 mL でセル (PBS; 75 cm 培養フラスコ).
- は、フラスコから PBS を削除し、0.25% トリプシン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 4 つの mL を追加します。フラスコが 37 ° C で 5 ~ 10 分のためのインキュベーターに戻って配置できるだけ簡潔露出の時間を維持します 。
- 牛子牛血清トリプシンの半分の体積に等しい量を追加することによって反作用を停止し細胞の大半がバランスのとれたか培養皿から切断したと、 。
- は、適切なサイズの遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。5 分間 400 x g で細胞を遠心し、上清を慎重に取り外します.
- は、5 mL の培地で細胞を再懸濁します (DMEM LG + 10 %fbs) 診断とセルをカウントと
。 注: この時点で、細胞継代またはできるトリプル記者増殖型します 。
- トリプル記者で hMSCs の伝達を行います。
- シード 1.5 x 10 6 細胞 1 つ T175 フラスコ。成長培地で 37 ° C、95%, 湿度, 5% の CO 2 の 25 の mL の細胞を培養します。24 h を付けるセルを待つ 。
- は、参照 18 に従って 15 mL チューブにカクテル ウイルスを作る。
- 水で 37 ° C で融解レンチのお風呂。ダルベッコの 5 mg/mL proteamine 硫酸溶液の 160 μ L を追加 ' s 修正イーグル培地 (DMEM) 培養液 8 ml (DMEM LG + 10 %fbs) 最終濃度 100 μ g/mL の。3, 追加 5 (MOI) 感染症のウイルスの多様性の渦 (1 回解凍) .
- 細胞培養用フラスコ (ステップ 1.2.1) からメディアを削除し、細胞にウイルス カクテルを追加。37 ° C、湿度 95%、および 5% CO 2 で 10 時間インキュベートします 。
- 100 μ g/mL proteamine 硫酸 4 mL を加えて 4 mL DMEM LG + 10 %fbs し追加 14 h,
- 25 ml の培地交換で 24 h 後伝達を停止 (DMEM LG + 10 %fbs).
- 流れ cytometry 18 mRFP 式を評価することで伝達効率を確認します
。 注: ここでは、導入された hMSCs 効率 65% 以上使用した 。
- は、25 ml の新鮮な媒体の交換によってセルを展開 (DMEM LG + 10 %fbs) 週に 2 回。37 ° C、95%, 湿度, 5% の CO 2 の細胞を培養します。80% の合流点に達すると、細胞を通過します 。
- 細胞の必要な数に達すると、実行手順 1.1.2 - 1.1.4 あたり trypsinization 。
- セルをカウントし、滅菌 PBS でそれらを中断 (1 x) 1 x 10 の最終的な集中で 6 セル/75 μ L。 細胞維持輸送のため氷の上超音波マシンに。実験用通路番号 2-5 からの hMSCs 。
2。左心室に超音波ガイド下 hMSCs の心腔内注射
注: 実験のための確立された小腸炎症と年齢と性別一致 AKR/J マウスを使用 SAMP1/YitFc。特定病原体フリーの条件の下でサンプと AKR マウスを維持、餌を標準研究所の食事は、12 時間の明暗サイクルのそれらを保ちます。ここでは、超音波ガイド下心臓注射を消毒剤で消毒し、70% アルコールですすぎ CWRU 動物研究施設にある専用の病原体フリー心臓超音波ルームで行った。研究室研究員は、心腔内注射時にガウン、マスクの目の盾と滅菌手袋を含む個人の保護具を着用する必要があります。プロシージャの持続期間のためマウスの体の熱を維持する必要があります
。- は、マウスを麻酔する前に超音波システムを設定します。このプロトコル マウス心エコー検査用超音波検査機を使用します。
- パワーと初期化トランスデューサー (30 MHz) 新しい研究を設定するを有効にします 。
- 0.2 のレートで 100% 酸素の 3-4% イソフルランを用いた誘導室でマウスを麻酔 - 0.5 L/min と鼻の円錐形によって 100% 酸素の 2% イソフルレン全体の手順のための動物を維持します。イメージングを実行する前に適切な anesthetization を確認、足指をつまんで、ローリング マウスとの動きの有無を観察します
。 注: 眼科用軟膏は角膜の乾燥を防ぐために麻酔導入を次の目に適用する必要があります。麻酔下のマウスに、麻酔薬イソフルランの維持の線量を受け取る彼らイメージング マシン (すなわち、 生物発光イメージング システムや超音波) を転送します。尾をつまみに反応の欠如を観察することによって麻酔開始時刻および麻酔の深さと足パッド麻酔の全体の持続期間のための 10 分毎を決定します 。
- イメージング テーブルと超音波ゲルの温度を 37 に設定 ° C
- 完全に脱毛クリームを使って、マウスの麻酔下の胸部領域の上毛皮を削除します 。
- は、仰臥位の画像のテーブルの上にマウスを置くし、プロシージャの間に身体の動きを避けるために粘着テープで上肢および下肢を保護します。すべてのマウスのプロシージャの間に心電図モニターを使用します 。
- は、70% エタノール綿棒に続いて 10% ポビドン ヨード綿棒を使用して胸部領域の肌をクリーンアップします。マウスの胸部領域にゲルの厚い層を適用します 。
- ホルダーに探触子をマウントし、左心室が明らかにビューのフィールドに表示されるまで、その位置を調整します 。
- 負荷 150 μ L の導入された立体的細胞懸濁液 (150 μ L の滅菌 PBS で 2 x 10 6 hMSCs) 28 G と 1 mL 注射器に針、注射器ホルダーを固定します。脈動の血を視覚化し、注射器で小さな空気柱を維持します。群生していることを避けるため、注射する前にセルを中断します 。
- マウス胸部へ注射器を進める超音波ガイド針の軌道を調整し、左心室を入力します 。
- 肋間スペースとマウスの左心室に注射針を貫通超音波イメージングのガイダンスに従う
。 注: 注射器の針の先端は超音波画像を左心室にはっきりと見えるにする必要があります。適切な配置は、注射器に新鮮な動脈血液流出によってさらに確認すべき。これらは、成功した挿入の兆候です 。
- 注入立体的細胞懸濁液かけて非常にゆっくり 2 分、穏やかなプリを適用します。内します 。
- 以下の浮遊細胞の注入、軽く超音波ゲルをきれい、針を撤回し、テープ拘束からマウス ボタンを離します 。
- 予熱パッドと新しい、きれいなケージに動物を配置します
。 注: プロシージャの終了後暖かい環境ありますマウスの回復まで。末梢血管拡張、回復を危険にさらすので、過熱は避けてください。マウスを密接に監視し、完全復旧、胸骨の横臥を維持する能力によって示されるまで他のマウスから隔離する必要があります 。
- 彼らは、実験の終わりまで毎日麻酔から完全な回復を達成するまで動物を監視します 。
3。(結合) の生物発光イメージングの hMSCs
- は、生物発光イメージング システムの心腔内注射後マウス 24 h をイメージします。生体内で イメージ投射ソフトウェアを開始します。イメージング システムを初期化し、新しい研究を開きます。
- コントロール パネルをクリックして撮像パラメーターを設定 " シーケンス セットアップ " イメージング モードで、選択 " 発光 " と " 写真。 " 0.5 から露光時間を設定に 10 分に s、ビニング設定 " 中 " と F。停止/" 1。 " 励起フィルターを設定 " ブロック " とする発光フィルター " 開く。 " にビューのフィールドを設定 " C " 2 つのマウス。画像ウィザードへ取得コントロール パネルをクリックしてシーケンス設定を追加します 。
- マシンの内部ノーズコーンと誘導商工会議所では 2.5% 酸素ポンプとセット、イソフルランに切り替える 。
- D-ルシフェリン (12.5 mg/mL) の 300 μ L でマウス i. p. を挿入します 。
- は、麻酔誘導チャンバーにマウスを配置します。
- 2-3 分後、生体内で イメージ投射区域麻酔マニホールド上鼻の円錐形の頭にマウスを移動します。画像の中に、目を保護するために光の軟膏を塗る。複数のマウスを画像に隣接するマウスに光の反射を防ぐために黒の光バッフルを使用します 。
- をクリックして、" を取得 " D-ルシフェリン注射後 10 分画像の取得を開始するボタン 。
- 3.3 3.5 以上のマウスをイメージする手順を繰り返します 。
- 生体内で 撮影後の死を確認するための頚部転位続いて CO 2 吸入によるマウスを安楽死させます。前のヴィヴォ 解析を実行します。
- 繰り返せば; マウスを犠牲にする前にルシフェリン注入 (ステップ 3.3) の 20 分後に 前のヴィヴォ 解析を実行すると、バリの信号がルシフェリン注射後 20 分を低下します 。
- 全体消化管 (すなわち、 胃から直腸)、腸間膜リンパ節 (MLN)、肺、脾臓と肝臓を削除するマウスを解剖。鉗子、はさみの 2 , 4 を使用してシャーレ内に配置します 。
- イメージング室 explanted 器官を含むペトリ皿を置き、ステップ 3.1 3.6 ごとバリ画像を取得します 。
- 画像取得後 explanted 臓器を最適な切削温度 (OCT) 化合物を含む試験片金型に転送します。Cryofreeze-80 ° c ドライアイスを使用して金型。凍結切片の hMSCs 16 の存在を確認する抗ルシフェラーゼ抗体を用いた免疫組織化学を実行します 。
- 光強度の定量化, ツール パレット 16 , 19 の利益 (率 ROI) の領域を使用します。投資収益率のフレームを選択し、画像上の関心領域に移動します。クリックして " ROI の測定 " と SEQ ファイル形式でデータを保存します。.Txt ファイルとしてデータをエクスポートし、定量化 16 の基本的な統計的テストを実行する統計ソフトウェアを使用します 。
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Representative Results
図 1は、自分の幹細胞の性質を保存する高効率でトリプル記者増殖型 hMSCs ことができますを示しています。バリ (図 1図 3) で、導入された hMSCs をリアルタイムで視覚化できます。この小説は、ひき割りトウモロコシ マウスの左心室への hMSCs の超音波ガイド下注入注入、最小限の罹患率と死亡率 (図 2) マウスの高速リカバリを可能にする、非常に高い成功率を保証します。HMSCs と 1 つのマウスを注入するための平均時間は約 10 分と未満 8-9% の罹患率と死亡率はこの手法で観察されました。死亡率の主な理由は、脳卒中と出血性心嚢から心タンポナーデです。前のヴィヴォ解析 24 h 立体的の心内 (動脈) 管理、確認後管理結果のこのルートで行う無料の炎症ではなく、サンプ マウス炎症小腸 hMSCs のホーミング(図 3およびD) マウスを制御します。さらに、hMSCs 炎症無料 AKR マウスの小腸に滞在し、蓄積または (図 3 b) 肺の中に閉じ込め取得開始をしない傾向にあります。
図 1. hMSCs は、 In Vivo可視化および幹細胞特性の保持と高効率で導入することができます。(A)導入された hMSCs の顕微鏡像。(B)および(C)バリ mRFP 式によって決定される、人間の MSCs の成功した伝達はフローサイトメトリーによる評価。導入された hMSCs 導入された hMSCs 軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞に分化する能力を示す分化アッセイによって確認された幹細胞特性を保持します。機能の試金のためハイドロキシアパ タイト/リン酸リン酸行列のセラミック キューブは hMSCs の骨異所性ドナー (D)を形成するための能力を発揮する免疫不全 CB17 Prkdc SCID マウスにおける皮下移植されました。A のバーをスケール = 500 μ m スケール バー C ではバリの単位を示す (103光子/s/cm2/steradian)。D でバーをスケール = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 超音波ガイド下注射器です。(A)機器のパノラマ ビュー: 心臓超音波イメージング システム (赤い正方形)、しっくり来るホルダー、シリンジ ホルダー (緑色の正方形)、麻酔、吸入麻酔マシンのノーズと手術台でマウント トランスデューサー誘導室 (黄色い正方形)。注射器の針(B)超音波画像: 針の先端 (赤矢印) がはっきりと見える内部左心室 (黄色の矢印)。(C)注射器に新鮮な動脈血液流出は立体的投与前に左心室に注射針の挿入を確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3. hMSCs サンプ マウス Intracardiac 内 arterial 投与後小腸に Localize 。3-4 マウス/グループの代表的な画像は、24 h の安楽死注射後、3 つの独立した実験からのとおりです。生物発光イメージング体内投与(A)ひき割りトウモロコシと AKR マウス 24 h で hMSCs の存在を示しています。前のヴィヴォサンプ マウスにおける hMSCs を優先的に小腸 (すなわち炎症のサイト) にローカライズすることを示します(D)、彼らは無料の炎症コントロール AKR の小腸に滞在しないように傾向があるに対しマウス(C)。実際には、最初の動脈通過後 hMSCs よりサンプ マウス(B)ではなく、AKR マウスの肺に蓄積を開始します。 HMSCs のほんの一部は、脾臓、肝臓、ひき割りトウモロコシと AKR マウス (B, C, D) の肺でも検出できます。 スケール バーは、バリの単位を示す (103光子/s/cm2/steradian)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、実験的 CD の小腸マウスモデルで hMSCs 超音波ガイド下心臓内注射法について説明します。この手法は、針の軌道が超音波によって提供されるマウスの左心室のリアルタイム、高解像度の画像に基づいて調整することができる生存と成功率が非常に高いです。左心室への配信の利点は、hMSCs 気管動脈内投与に分散されて静脈、肺の細胞の凝集を避けるためのバイパスします。以前は、動脈内の配信のため頚動脈カテーテルは、MSCs16,21を注入する使用されました。頸動脈カテーテル検査法には、動脈内カテーテルを配置するために頚動脈を公開するために手術が含まれます。カテーテルは、輸血細胞のため大動脈弓に向かって進んだ。カテーテルが削除されその後、内頚動脈結紮します。この手法頚動脈カテーテルと比較して、左の心室の MSCs の超音波ガイド下注入は低侵襲くらい高速 (約 10 分/マウス 60 分/マウス対) であり以下の罹患率と死亡率 (<10%対30%)。上腸間膜動脈のカテーテルを介して hMSCs 人間臨床試験へのマウス超音波ガイド下心臓内注射の臨床の翻訳になる (現在実行慢性腸間膜虚血の治療のためと難治性消化管出血) 病気の小腸に hMSCs を提供します。
変更、マウスの左心室の hMSCs 超音波ガイド下心臓内注射のトラブルシューティングのいくつかの考慮事項があります。プロシージャの重要な側面は、左心室に注射針をガイドに超音波の使用をマスターします。任意の手順、適切な訓練、実践、そして専門家のフィードバックのようなこの手順を正常に実行する重要なコンポーネントです。貧しいテクニックは、出血性心嚢から心タンポナーデと死につながることができます。、細胞の凝集と (すなわち、ストローク) の脳塞栓のリスクを最小限に抑えるには、各注入前 hMSCs を再懸濁します欠かせません。この手順を実装する前に、専門家のアドバイスを受けるローカル動物研究施設の担当獣医師に相談することが重要です。動物の安全かつ効果的な使用のためのガイドラインは、マウスに不注意による怪我を最小限に抑えることを確認します。
投与マウスの hMSCs の生体内分布を調べるトリプル記者と高効率で hMSCs を導入する正常にされました。実行分化アッセイは、軟骨細胞、脂肪細胞および骨細胞18に区別するために導入された hMSCs の能力を発揮しました。骨機能試金のためヒドロキシアパ タイト/リン酸リン酸行列のセラミック キューブは免疫不全の SCID マウス皮下移植され、ドナーの異所性骨17,18 を形成する hMSCs の能力を実証.これらの分化と機能アッセイ導入された hMSCs がその幹細胞の特性を保持することを示します。本研究の結果は、サンプ マウスにおける炎症のサイトである小腸に導入された hMSCs サンプ マウス心腔内注入に使用をローカライズすることを示します。腸の炎症無料 AKR マウス、少数だけの意味、炎症のない状態で、注入後腸 24 h にローカライズ hMSCs hMSCs は腸に残ってはいません。このデータは移行し損傷、急性心筋梗塞22心など16放射線負傷した脚の負傷した BM のサイトで接が MSCs の能力を示されている他の複数の研究では。ような他の病気大腸損傷モデルに MSCs のローカル アプリケーションは炎症23を改善に有効性を示しています。大腸炎ラットの 2,4,6 trinitrobonzene スルホン酸 (TNBS) モデルは、林らは注入ラット大腸の粘膜下層の BM 由来 Msc 周辺 TNBS にさらされ、実証加速23 大腸炎の治癒.
Manieriらによる最近の研究は遠位結腸、プロスタグランジン欠損マウスにおける大腸損傷部位の大腸の MSCs の内視鏡射出の小説技法を使用し、の形成を防ぐことで、その有効性を示した穿通性潰瘍5。サンプ小腸炎症のモデルで、これらのマウスは、大腸の炎症を発症しません。私たちの研究室を開発し、評価し大腸の炎症やマウスの腫瘍の開発の定量化法の内視鏡を検証します。ただし、内視鏡デバイスはライブ マウス24で小腸に達することができません。スコアリング システムは、ターミナル安楽死後 SAMP マウスにおける炎症の評価法としてのみ使用できます。したがって、内視鏡はサンプ モデルの MSCs のローカル アプリケーションに適していません。インジェクションのこの手法を使用して、MSCs の小腸へのローカリゼーション強化を実現できます。炎症小腸への増加のローカリゼーションが効果につながるかどうかは知られていないと将来の研究の焦点になります。サンプ モデルに加え、MSCs の超音波ガイド下注入は hMSCs 実験 CD TNFΔRE6マウス モデルなどの小さな腸管炎症の他のモデルでの強化されたローカリゼーションのための有用な方法でしょう。
バリは敏感な立体的ホーミングの正確な定量化のため、生体内hMSCs、しかしそれを追跡する連続使用できる便利な手法を指定することはできません。マウスでトリプル記者導入 hMSCs を使用する利点は、トリプルの記者で酵素 ttk がもっと定量的な陽電子放射断層撮影 (PET) 画像19のできることです。ガンマ数に比例している、病気のサイトに明らかな移植の hMSCs 数の定量的評価 (ローカライズを提供する) コンピューター断層撮影 (CT) スキャン (検査プローブ) と非常に定量的 pet を組み合わせることできます、ttk 遺伝子が付いた実行可能な hMSCs の数です。立体的定位の正確な定量化は hMSCs ホーミングと治療効果のパーセンテージを決定することができます、将来研究の焦点になります。
この技術は、その多くの利点にもかかわらずいくつかの制限があります: i) 高価な心臓超音波のマウス、ii) の死亡率と罹患率の心腔内注射、iii) に使用することができないに関連付けられているシステムの要件、低速注入 (すなわち、m > 時間以上) 細胞および他の分子の。これらの制限にもかかわらず hMSCs 強調としての動脈内注入のため頚動脈カテーテル法, 上記の現在の技術に比べて多くの利点があります。
結論として、本研究の結果は、有効性と hMSCs 実験 CD のひき割りトウモロコシ モデルにおける炎症のサイトへの局在化を改善するために超音波ガイド下注入の技術の利便性を示します。今後の研究は動脈内配信で hMSCs の増加のホーミングが小腸炎症モデルで治療効果の向上につながることができるかどうかを決定します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
マニッシュ デイブは、国防総省グラント PR141774 およびクローンの大腸炎財団のアメリカのキャリア開発賞によってサポートされます。ファビオ Cominelli の研究室は、NIH 支え DK042191 ・ (FC)、DK055812 (・ FC)、DK091222 (FC) と DK07948 (・ FC) を付与します。アーノルド ・ キャプランの研究室を一部 L. デイヴィッド ・ e. バージニア州ボールドウィン財団によってサポートされています。資金の機関に研究分析や原稿の執筆での役割はなかった。内容は、著者の責任です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
References
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