Summary
Мышиных исследования в моделях воспаление толстой кишки показали, что небольшой процент (1-5%) мезенхимальных стволовых клеток (МСК) вводят внутривенно или внутрибрюшинно дома воспаление толстой кишки1,2. Это исследование показывает, что УЗИ руководствуясь внутрисердечной инъекции MSCs приведет к увеличению локализации в кишечник.
Abstract
Болезнь Крона (CD) является общей хроническим воспалительным заболеванием малых и толстого кишечника. Мышиных и человека мезенхимальных стволовых клеток (МСК) у иммунодепрессивных потенциал и было показано для подавления воспаления в моделях мыши кишечного воспаления, даже несмотря на то, что маршрут администрации можно ограничить их самонаведения и эффективности 1 , 3 , 4 , 5. Местное применение MSCs толстой травмы модели показали большую эффективность в улучшении воспаления в толстой кишке. Однако существует нехватка данных о методах улучшения локализации человека костный мозг производные MSCs (использования), тонкой кишки, месте воспаления в SAMP-1/YitFc (SAMP) модели экспериментальной крона. Эта работа описывает Роман технику для УЗИ руководствуясь внутрисердечной инъекций использования в SAMP мышей, хорошо изученных спонтанное модель хронического воспаления кишечного. Соответствием пола и возраста, воспаление бесплатно мышей AKR/J (AKR) были использованы в качестве контроля. Чтобы проанализировать накопление и локализации, использования были преобразованы с человека, содержащий тройной репортер. Тройной репортер состояла из Светлячок Люцифераза (fl), для биолюминесцентных изображений; мономерные красным флуоресцентный белок (mrfp), для сортировки клеток; и усеченные герпеса вирус Тимидинкиназа (ТТК), для томографии, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). Результаты этого исследования показывают что 24 ч после внутрисердечной администрации, использования локализовать в тонком кишечнике SAMP мышей в отличие от воспаления бесплатно AKR мышей. Этот роман, УЗИ руководствуясь инъекций использования в левом желудочке SAMP мышей гарантирует высокий уровень успеха клеток доставки, что позволяет для быстрого восстановления мышей с минимальными заболеваемости и смертности. Этот метод может быть полезным методом для расширенной локализации MSCs в других моделях малых кишечного воспаления, такие как TNFΔRE6. Будущие исследования будет определять, если увеличение локализации использования, внутри артериальная доставка может привести к увеличению терапевтической эффективности.
Introduction
Болезнь Крона (CD) является общим хроническим воспалительным заболеванием малых и толстого кишечника и считается неадекватную реакцию иммунной системы в результате кишечные микробы7,8. Недавние исследования показали, что мышиных и человека мезенхимальных стволовых клеток (МСК) может подавить воспаление в моделях мыши кишечного воспаления1,3,4,5. Есть несколько текущих клинических испытаний, которые используют для лечения пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (IBD), которая включает в себя CD9человека MSCs, полученных из костного мозга и жировой ткани. В этих клинических испытаний были использованы два маршрута для MSC терапии: один предполагает системный инфузии (то есть, внутривенно) MSCs для Люминал IBD (включая CD) и другой предполагает локализованного приложения/инъекции стволовых клеток в свищ тракта больных с перианальной CD. В последних мета анализ MSC терапии для IBD, системные (т.е., внутривенно) MSC терапии для Люминал IBD (включая CD) был эффективным в до 40% (95% ДИ: 7-79%) больных, в то время как эффективность была намного выше, на 61% (95% ДИ: 36-85%), когда MSCs вводили локально в больной свищей CD9. Последний этап III многоцентрового рандомизированных плацебо-контролируемое испытание аллогенной жировых стволовых клеток, вводят непосредственно в перианальной фистулы CD пациентов показали статистически значимого клинического и радиологического перианальной свищи исцеление, подтверждающих результаты мета анализа10. Причины низкой эффективности MSC терапии внутривенно для Люминал CD недостаточно исследовано, но одна из причин может быть неадекватной самонаведения MSCs на сайт воспаления. Мышиных исследования в моделях воспаления кишечника, показали, что только небольшой процент MSCs (1-5%), вводят внутривенно достичь воспаление толстой кишки; остальные MSCs фильтруются легких (эффект первого прохода)1,2 ,5,,1112. Поэтому несколько мышиных исследования использовали внутрибрюшинного маршрут (и.п.) для управления MSC в животных моделях колит4. Однако они также показали, что только небольшая часть клеток достичь и привить толстой кишки и что эффективность относящиеся к секреции паракринными растворимых факторов, таких как фактор некроза опухоли inducible gene 6 белков (ТСГ-6)2. MSC механизм иммунитета и исцеления включает многосторонний подход, который предполагает паракринными; Мобильный близости независимые факторы, как ТСГ-6; и клеточной близости зависимых факторов, как запрограммировано смерть лиганд 1 (PD-L1); или зазубренные 1. Таким образом MSC локализации на сайт воспаления может привести к повышению эффективности9,13. В самом деле недавнее исследование показало, что MSCs, имплантированных непосредственно на месте толстой травмы привели к Исцеление секретирующих ангиогенез содействие Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). С другой стороны было отмечено минимальный лечебный эффект, после внутривенного введения5. Для увеличения их локализации на сайт воспаления (т.е., тонкой кишки в SAMP мышей), был разработан этот метод УЗИ руководствуясь внутрисердечной инъекции для администрирования MSC в левого желудочка. Изображение руководствуясь инъекций гарантирует точную инъекции, что приводит к более высокий уровень успеха и на снижение заболеваемости и смертности. Кроме того инъекции MSCs в левый желудочек доставляет их артериального кровообращения, где они могут достигать воспаление тонкой кишки, прежде чем стать в ловушке в легких.
В этом исследовании человека костный мозг производные MSCs (использования) были использованы для инъекций в SAMP-1/YitFc (SAMP) мышиных модели CD14. SAMP представляет собой хорошо изученных спонтанное мышиных модель хронического воспаления, которая разрабатывает малых кишечного воспаления с почти 100% пенетрантностью14. Воспаление развивается в ответ на микрофлору в отсутствие каких-либо химических, иммунологические или генетических манипуляций и близко напоминает человека CD11. Пол и возраст соответствует воспаления бесплатно AKR/J (AKR) мышей, родительский контроль мышей SAMP, были использованы в этом исследовании.
Использования были изолированы и расширена в лаборатории из образцов костного мозга (БМ), полученные от нормальной, неопознанные доноров после обоснованного согласия с помощью проверки и ранее опубликованные протоколы15,16. После изоляции и расширение, MSC способности в остеогенном, адипогенном и хондрогенном дифференциация была оценена в лаборатории несколько анализов15. Остеогенные функционального анализа была выполнена путем имплантации керамические кубов гидроксиапатита/Трикальцийфосфат фосфат матрицы, содержащие использования подкожно в мышей с ослабленным иммунитетом SCID CB17-Prkdc17. Куб демонстрирует остеогенез и chondrogenesis потенциал и считается конечной тест для оценки отдельных препаратов MSC17. Чтобы визуализировать использования в естественных условиях после инъекции, Лентивирусы был использован для передают использования с тройной Репортер ген конструкцию, которая состоит из Светлячок Люцифераза (fl), мономерные красным флуоресцентный белок (mRFP) и простого герпеса вирусная Тимидинкиназа (ТТК ), обусловлено изменение миелопролиферативных саркома промоутер вирус (МНД)18. Светлячок Люцифераза в тройной репортер является ферментом, что кроющих вводят люциферин в оксилюцеферин в использования и производит фотоны/белый свет. Это определяется чувствительных зарядовой (связью ПЗС) фотоаппарат (биолюминесценции) в в естественных условиях оптических изображений системы, позволяя визуализации живых использования мышей. Биолюминесценции изображений (BLI) является чувствительной технологией, которая может использоваться поочередно для отслеживания клетки и ex vivo анализа. Использование сильной МНД промоутер диски постоянное выражение тройной фьюжн Репортер ген конструкции и позволяет изображения вводят использования для более чем 16 недель19. Использования трудно передают и имеют КПД низкий трансдукции. С помощью оптимизированного протокола, эффективность использования трансдукции была улучшена и трансген выражение было более18. С помощью выражения mRFP (один из генов, тройной репортер) на проточной цитометрии, была продемонстрирована способность передавать использования с высоким КПД до 83%. Дифференциация анализов и в естественных условиях Куба анализов продемонстрировала способность transduced использования дифференцироваться в хрящевые клетки, адипоциты и остеоциты17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
всех мышей экспериментов и процедур в рамках исследования были утверждены Западный резервный университет Кейза ' s, институциональный уход животных и использования Комитетом. Процедуры были проведены в ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных ухода (АААЛЖ) аккредитованных объекта. BM был придыханием под университет больницы институциональных Наблюдательный Совет утвердил протокол на объекте ядро стволовых клеток на Западный резервный университет Кейза после информированного.
1. Культура и трансдукция из костного мозга человека-производные мезенхимальных стволовых клеток (использования)
Примечание: изоляции использования подробно описан в предыдущих публикациях 15 , 20.
- Культуры изолированных использования в Дульбекко ' s орла изменения среднего низкого среднего глюкозы (DMEM-LG) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС). Культура клетки при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO 2 в T175 колбы с 25 мл среднего роста. Замените носитель каждые 3-4 дня. На 14 день выполните основной проход использования.
- Когда клетки достигают 80% слияния, полностью удалить старые среднего и аккуратно помыть клетки с 5 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS; для фляги культуры ткани-75см).
- Вынуть колбу PBS и добавить 4 мл 0,25% трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Место, флакон обратно в инкубаторе при 37 ° C за 5-10 мин держать время выдержки как можно более краткими.
- Когда большинство клеток стали хорошо округлые или отделены от культуры блюдо, остановить реакции, добавляя объем говядину телячьей сыворотки равен половине объема трипсина.
- Суспензию клеток передавать соответствующие размеры пластиковых пробирок. Центрифуга клетки на 400 g x 5 мин и затем тщательно удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в 5 мл среды (DMEM-LG + 10% FBS) и подсчитать количество ячеек с Горяева.
Примечание: В этой точке, клетки могут быть subcultured или преобразованы с тройной репортер.
- Выполняют трансдукции использования с тройной репортер.
Колба
- семя 1,5 х 10 6 клеток в одном T175. Культура клетки в 25 мл среднего роста при 37 ° C, 95%, влажность и 5% CO 2. Подождите 24 часа для клеток прикрепить.
- Сделать вирус коктейль в 15 мл пробирок, как описано в ссылка 18.
- Оттепель человека при 37 ° C в воде ванны. 160 мкл раствора сульфата 5 мг/мл proteamine в Дульбекко ' s Modified Eagle среднего (DMEM) до 8 мл питательной среды (DMEM-LG + 10% FBS) для окончательного концентрации 100 мкг/мл. Вортекс для 3 s. Добавить разносторонность вирусной инфекции (МВД) 5 (первый раз талой) .
- Удалить носитель из колбы культуры клеток (шаг 1.2.1) и добавить вирус коктейль в клетки. Проинкубируйте втечение 10 ч при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO 2.
- Добавить 4 мл 100 мкг/мл proteamine сульфата в 4 мл DMEM-LG + 10% FBS и проинкубируйте дополнительных 14 h.
- Остановить трансдукции после 24 ч, заменив 25 мл среды (DMEM-LG + 10% FBS).
- Подтверждение электромеханической эффективности путем вычисления выражения mRFP потока цитометрии 18.
Примечание: Здесь, использования, которые были преобразованы с более чем 65% эффективности были использованы. - Расширения клетки, заменив 25 мл свежей среды (DMEM-LG + 10% FBS) два раза в неделю. Культура клетки при 37 ° C, 95%, влажность и 5% CO 2. Проход клетки после того, как они достигают 80% впадения.
- Как только будет достигнуто требуемое количество клеток, выполняют trypsinization за шаги 1.1.2 - 1.1.4.
- Подсчитать количество ячеек и приостановить их в стерильных PBS (1 x) в конечной концентрации 1 x 10 6 клеток/75 мкл. Держите клетки на льду для транспорта на УЗИ машину. Для экспериментов, используйте использования от прохода номеров 2-5.
2. УЗИ руководствуясь внутрисердечной введения использования в левый желудочек
Примечание: использование SAMP1/YitFc с установленным малых кишечного воспаления и соответствует возрастной и гендерной AKR/J мышей для экспериментов. Поддерживать SAMP и AKR мышей при определенных условиях возбудителя бесплатно, кормить их стандартный лабораторный Чоу и держать их на 12-h свет/темно циклов. Здесь руководствоваться ультразвук сердца инъекции были исполнены в выделенного возбудителя свободной сердца УЗИ комнате, расположенной в КЕЙЗА животных исследования объекта, который был санирован с дезинфицирующим и промыть 70% спирта. Персонал лаборатории исследования должны носить средства индивидуальной защиты, включая халаты, маски с глаз щиты и стерильные перчатки во время внутрисердечной инъекции. Жар тела мыши должна поддерживаться в течение процедуры.
- Создана ультразвуковой визуализации системы перед обезболивающим мыши. Для этого протокола используйте ультразвук машина, предназначенная для мыши эхокардиограммы.
- Включите питания и инициализации преобразователя (30 МГц) чтобы настроить новое исследование.
- Анестезировать мышь в камеру всасывание с помощью 3-4% изофлюрановая в 100% кислорода в размере 0,2 - 0,5 Л/мин поддерживать животных для всей процедуры с 2% изофлюрановая в 100% кислорода через носовой конус. Подтверждение правильного анестезии перед выполнением изображений путем защемления ног, прокатки мыши и наблюдения за отсутствие движения.
Примечание: Глазная мазь следует применять после индукции анестезии для предотвращения высыхания роговицы глаз. Передать наркотизированных мышей изображений машин (т.е. биолюминесценции съемочной системы и ультразвук), где они получат дозу поддержание анестезии изофлюрановая. Определить анестезии время начала и глубины анестезии, наблюдая за отсутствие реакции на щепотки на хвост и ног pad каждые 10 мин на весь срок анестезии. - Установить температуру визуализации таблицы и УЗИ гель до 37 ° C.
- Полностью удалить шерсть над грудной области наркотизированных мыши, используя крем удаления волос.
- Поместите курсор мыши на таблице изображений в лежачем положении и зафиксируйте верхних и нижних конечностей с клейкой лентой, чтобы избежать движения тела во время процедуры. Использовать монитор ЭКГ во время процедуры для всех мышей.
- Очистить кожу области грудной клетки, с помощью 10% повидон и йода тампоном, а затем тампоном этанол 70%. Применить толстый слой геля в область грудной клетки мыши.
- Подключить датчик в держатель и скорректировать свою позицию до тех пор, пока ясно видны на поле зрения левого желудочка.
- Нагрузки 150 мкл суспензии клеток transduced МСК (2 x 10-6 использования в 150 мкл стерильных PBS) в 1-мл шприц с 28-G иглы и закрепите шприц в соответствующий держатель. Чтобы визуализировать пульсирующей крови, держите столбиком небольшой воздух в шприц. Во избежание слипания, приостановить клетки перед инъекцией.
- Заранее шприц к грудной клетки мыши, отрегулировать иглой траектории с помощью ультразвука руководством и введите левого желудочка.
- После указания УЗИ, проникают иглу шприца через межреберное пространство и в левый желудочек мыши.
Примечание: Кончик иглы шприца должна быть отчетливо видна в левого желудочка на ультразвуковое изображение. Правильное размещение должны быть далее подтверждены оттока свежие артериальной крови в шприц. Это признаки успешной вставки. - Инъекционные суспензии клеток МСК очень медленно более 2 мин, применяя нежный pressure.
- После инъекции взвешенных клеток, аккуратно снять иглу, счищают гель для УЗИ и отпустите кнопку мыши от ограничений ленты.
- Место животного в новой, чистой клетке с разогретой pad.
Примечание: После завершения процедуры, теплой среде должна быть представлена мышей до выздоровления. Следует избегать перегрева, поскольку периферической вазодилатации компромиссы восстановления. Мышей следует внимательно контролироваться и держал изолированы от других мышей до их полного восстановления, свидетельствует их способность поддерживать грудной recumbency. - Мониторинг животного до тех пор, пока они достичь полного выздоровления от наркоза и ежедневно до конца эксперимента.
3. Биолюминесценции (BLI) изображений использования
- изображение мышей 24 ч после инъекции внутрисердечной в биолюминесценции изображений системы. Начало в vivo визуализации программного обеспечения. Инициализировать системе визуализации и открыть новое исследование.
- В панели управления, задайте параметры обработки изображений, нажав " последовательность установки. " в режиме изображений, выберите " люминесценции " и " фотография. " задать время экспозиции от 0.5 s до 10 мин равным биннинга " среднего " и F / стоп " 1. " установить фильтр возбуждения " блок " и фильтра выбросов " открыть. " присвоено поле зрения " C " для двух мышей. Добавить последовательность установки мастера изображений, нажав на панели управления приобретение.
- Включите насос кислорода и набор изофлюрановая до 2,5% в зале индукции и носовой конус внутри машины.
- Придать и.п. мыши с 300 мкл D-Люциферин (12,5 мг/мл).
- Поместите курсор мыши в камере индукции анестезии.
- После 2-3 мин, передача мышь в в естественных условиях imaging камеры, с его головой в носовой конус на многообразии анестезии. Применение оптических мазь для защиты глаз во время визуализации. Чтобы изображение несколько мышей, используйте черный свет дефлектор для предотвращения отражения света на прилегающих мышей.
- Нажмите " приобретают " кнопка начать получение изображения 10 мин после инъекции D-люциферин.
- Повторите шаги 3.3-3.5 для изображения больше мышей.
- После изображения в естественных условиях приобретения усыпить мышей с CO 2 ингаляции следуют шейки матки вывих, чтобы подтвердить смерть. Выполните анализ ex vivo.
- Если после 20 минут проводится анализ ex vivo, повторять инъекции Люциферин (шаг 3.3) перед жертвуя мышей; BLI сигнал может уменьшить 20 мин после инъекции люциферин.
- Вскрыть мышей, чтобы удалить весь желудочно-кишечного тракта (т.е., от желудка до прямой кишки), брыжеечный лимфоузлов (млн.), легких, селезенке и печени. Поместите их в чашках Петри с помощью щипцов и ножницы 2 , 4.
- Место Петри, содержащие explanted органов в тепловизионной камере и приобрести BLI изображений на шаги 3.1-3.6.
- После приобретения изображений, explanted органы передать образец формы, содержащие оптимального раскроя температуры (OCT) соединения. Cryofreeze формы на-80 ° C с использованием сухого льда. Выполняют иммуногистохимии с использованием антител анти Люцифераза на замороженные разделы для подтверждения наличия использования 16.
- Для количественной оценки интенсивности света, используйте региона интерес (ROI) инструмент в инструмент Палитра 16 , 19. Выберите фрейм, ROI и переместить его в область на изображении. Нажмите кнопку " измерения ROI " и сохранить данные в формате файла SEQ. Экспорт данных в txt-файл и использовать статистическое программное обеспечение для выполнения основных статистических тестов для количественной оценки 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает, что использования могут быть преобразованы с тройной репортером в высокой эффективности, сохраняя их свойств стволовых клеток. Transduced использования могут быть визуализированы в реальном времени BLI (рис. 1 c, рис. 3). Этот роман, УЗИ руководствуясь инъекций использования в левый желудочек SAMP мышей обеспечивает очень высокий уровень успеха инъекции, что позволяет для быстрого восстановления мышей с минимальными заболеваемости и смертности (рис. 2). Среднее время для инъекций один мышь с использования составляет примерно 10 минут, и меньше, чем 8-9% заболеваемости и смертности были замечены с этой техникой. Основная причина смертности является инсульта и тампонада сердца от геморрагического Экссудативный перикардит. Ex vivo проведен анализ 24 часа после того, как администрация внутрисердечной (внутри артериальные) МСК подтверждает, что этот маршрут администрации результатов в самонаведения использования воспаление тонкой кишки SAMP мышей, в отличие от воспаления бесплатно контроль мышей (рис. 3 c и D). Кроме того использования, как правило, чтобы не остаться в тонком кишечнике воспаления бесплатно AKR мышей и начать накопление или получать оказавшихся в легких (рисунок 3B).
Рисунок 1 . использования могут быть преобразованы с высокой эффективностью для визуализации In Vivo и с хранения стволовых клеток свойств. (A) микроскопических изображений transduced использования. Успешное трансдукции человека MSCs, как определяется выражением mRFP оценены с проточной цитометрии BLI (C)и (B) . Transduced использования сохраняют свойства стволовых клеток, что подтверждается дифференциация анализов, которые демонстрируют способность transduced использования дифференцироваться в хрящевые клетки, адипоциты и остеобластов. Для функционального анализа керамические кубов гидроксиапатита/Трикальцийфосфат фосфат матрицы были имплантированы подкожно с ослабленным иммунитетом CB17-Prkdc SCID мышей для демонстрации использования способность образовывать внематочная доноров кости (D). Масштаб баров в A = 500 мкм. Шкала баров в C указывают единицы BLI (103 /steradian фотоны/s/см2). Масштаб баров в D = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Инструменты для УЗИ руководствуясь инъекций. (A) панорамный вид инструментов: сердца ультразвуковой визуализации системы (Красная площадь), датчик установлен в держатель подходящий, шприц держателя и операционный стол с ураном для анестезии (зеленый квадрат) и Ингаляционная анестезия машины с камерой индукции (желтый квадрат). (B) ультразвуковое изображение иглой шприца: внутри левого желудочка (Желтые стрелки) отчетливо виден кончик иглы (красная стрелка). (C) отток свежие артериальной крови в шприц подтверждает успешное включение иглу шприца в левый желудочек до МСК администрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . использования Localize для тонкой кишки после Intracardiac/внутри-arterial администрации в SAMP мышей. Представитель изображения 3-4 мышей/группы, отображаются Усыпленных 24 ч после инъекции и от трех независимых экспериментов. В естественных условиях биолюминесценции изображений демонстрирует наличие использования в SAMP и AKR мышей 24 ч после инъекции (A). Анализ ex vivo в SAMP мышей показывает, что использования преференциально локализовать в тонкой кишке (т.е. месте воспаления) (D), в то время как они, как правило, не оставаться в тонком кишечнике воспаления бесплатно управления AKR (C)мышах. В самом деле после первого прохождения артериальной, использования начать больше накапливается в легких AKR мышей, в отличие от SAMP мышей (B). Часть использования также может быть обнаружен в селезенке, печени и легких SAMP и AKR мышей (B, C, D). Шкала индикатора указывают единицы BLI (103 /steradian фотоны/s/см2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование описывает Роман технику для УЗИ руководствуясь внутрисердечной инъекций использования в малых кишечного мыши модели экспериментальной CD. Эта техника имеет очень высокий показатель выживания и успеха, как траектории игла может быть скорректирована основан на реальном времени, с высоким разрешением изображения мыши левого желудочка, предоставляемый УЗИ. Преимуществом доставки для левого желудочка является использования затем распределяются внутри arterially и обойти венозное кровообращение, таким образом избегая агрегации клеток в легких. Ранее катетеризация сонной артерии для внутри артериальная доставка была использована для вставки MSCs16,21. Сонная катетеризация метод предполагает хирургии подвергать сонной артерии для того, чтобы поместить катетер внутри артерии. Катетер продвигается к аорты для переливания клеток. Катетер впоследствии удаляется и сонной артерии лигируют. Этот роман технику для УЗИ руководствуясь инъекций MSCs в левом желудочке, по сравнению с сонной артерии катетеризации, является менее инвазивным, гораздо быстрее (около 10 мин/мышь против 60 мин/мышь) и имеет меньше заболеваемости и смертности (< 10% против 30%). Клинические перевод мыши УЗИ руководствуясь внутрисердечной инъекции использования человеческих клинических испытаний будет через катетеризация превосходной верхней брыжеечной артерии (в настоящее время выполняются для лечения хронической ишемии верхней брыжеечной и неразрешимыми желудочно-кишечное кровотечение) доставить использования больными тонкой кишки.
Существует несколько соображений относительно изменения и устранение неполадок УЗИ руководствуясь внутрисердечной инъекции использования в левом желудочке мышей. Одним из важнейших аспектов процедуры является овладение использование ультразвука для инъекционной иглы в левого желудочка. Как эксперт обратной связи процедуры, практики и надлежащей профессиональной подготовки являются важными компонентами для успешного выполнения этой процедуры. Плохой метод может привести к тампонада сердца от геморрагического Экссудативный перикардит и к смерти. Чтобы свести к минимуму глыба ячеек и риск эмболизации мозга (то есть, инсульт), важно Ресуспензируйте использования перед каждой инъекцией. Прежде чем выполнять эту процедуру, важно проконсультироваться с ветеринаром, отвечает за местные исследования животных фонда получать консультации экспертов. Убедитесь, что руководящие принципы для безопасного и эффективного использования животных следует свести к минимуму непреднамеренные травмы для мышей.
Для изучения накопление использования после инъекции в мышей, использования были успешно преобразованы с тройной репортер, с высокой эффективностью. Дифференциация анализы выполняются продемонстрировал способность transduced использования дифференцироваться в хрящевые клетки, адипоциты и остеоциты18. Остеогенные функционального анализа керамические кубики гидроксиапатита/Трикальцийфосфат фосфат матрицы были имплантированы подкожно с ослабленным иммунитетом SCID мышей и продемонстрировал способность использования сформировать внематочная доноров костного17,18 . Эти различия и функциональных анализов показывают, что transduced использования сохраняют свои свойства стволовых клеток. Результаты этого исследования показывают, что transduced использования, используемых для внутрисердечной инъекций в SAMP мышей локализовать в тонком кишечнике, которая является сайт воспаления в SAMP мышей. Кишечные воспаления бесплатно AKR мышей, только меньшинство использования локализованных на кишечнике 24 ч после инъекции, подразумевая, что, в отсутствие воспаления, использования не остаются в кишечнике. Эти данные — в соответствии с несколькими другими исследованиями, которые показали способность MSCs для миграции и привить на месте травмы, как сердце в острый инфаркт миокарда22 и раненых BM в излучения ранения ног16. Как в других заболеваний, при местном применении MSCs толстой травмы модели показал эффективность в улучшении воспаление23. В модель перфтороктановой сульфоновой кислоты (ТНБ) 2,4,6-trinitrobonzene колит в крыс Хаяси et al. вводят BM-производные MSCs в подслизистой толстой кишки крыс, окрестности подвергается ТНБ и продемонстрировал ускоренного лечения колита23 .
В недавнем исследовании Manieri et al. использовали Роман технику при помощи эндоскопа инъекции толстой MSCs в дистальной части толстой кишки, сайт толстой травмы, простагландин недостаточным мышей и показал их эффективность в деле предотвращения формирования проникающее язвы5. SAMP представляет собой модель малого кишечного воспаления, и эти мышей не развиваются спонтанное воспаления в их кишки. Наша лаборатория разработала и проверены Эндоскопический метод для оценки и количественного определения воспаление кишечника и развития опухоли у мышей. Однако Эндоскопические приборы не способны достичь тонкой кишки в живой мыши24. Скоринговая система может использоваться только как терминал метод для оценки воспаления в SAMP мышей после эвтаназии. Таким образом Эндоскопический метод не подходит для местного применения МСК в SAMP модели. Используя этот роман технику инъекций, может быть достигнуто расширение локализации MSCs в тонкой кишке. Ли увеличение локализации для воспаление тонкой кишки будет переводить на увеличение эффективности не известен и будет в центре внимания будущих исследований. Помимо модели SAMP УЗИ руководствуясь инъекций MSCs будет полезным методом для использования в других моделях малых кишечного воспаления, такие как TNFΔRE6 мышиных модель экспериментальной CD расширенной локализации.
BLI чувствителен и удобный метод, который может использоваться поочередно для отслеживания использования в естественных условиях, но он не позволяет точную количественную оценку МСК самонаведения. Преимуществом использования тройной репортер преобразованы использования мышей является, что фермент ТТК в тройной репортер позволяет больше количественных позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) изображений19. Сочетание высоко количественных PET изображений (с зондом радиоиндикаторных) с (предоставление локализации) компьютерная томография (КТ) сканирования позволяет количественную оценку числа прижившимися использования на объекте больной, как отсчеты гамма пропорциональны количество жизнеспособных использования помечены с ТТК гена. Точное количественное определение МСК локализации может помочь определить процент использования самонаведения и терапевтической эффективности и будет в центре внимания будущих исследований.
Эта техника, несмотря на многие преимущества, имеет некоторые ограничения: i требование для дорогих сердца ультразвуковой визуализации системы для мышей, ii) смертности и заболеваемости, связанный с нутрисердечным инъекции и iii неспособность использоваться для Медленная инфузия (т.е.m > часов) клеток и других молекул. Несмотря на эти ограничения она имеет множество преимуществ перед текущей технику катетеризации сонной артерии для внутри артериальной инъекций использования, как отмечалось выше.
В заключение результаты этого исследования демонстрируют эффективность и удобство метода УЗИ руководствуясь инъекций для улучшения локализации использования на сайт воспаления в SAMP модели экспериментальной CD. Будущие исследования будет определять, если увеличение самонаведения использования, внутри артериальная доставка может привести к увеличению терапевтическую эффективность в модели малого кишечного воспаления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Maneesh Dave поддерживается грант Министерства обороны PR141774 и крона и колит фонда карьеры развития премию Америки. Лаборатория Фабио Cominelli поддерживается NIH предоставляет DK042191 (ФК), DK055812 (ФК), DK091222 (ФК) и DK07948 (ФК). Лаборатория Арнольд Caplan частично поддерживается Дэвид л и е. Вирджиния Болдуин фонд. Финансирующие учреждения имели никакой роли в анализ исследования или написания манускрипта. Его содержание отвечают исключительно авторов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
