Summary
Murina studier i modeller av kolon inflammation har visat att en liten andel (1-5%) av mesenkymala stamceller (MSC) injiceras intravenöst eller intraperitonealt hem till den inflammera kolon1,2. Denna studie visar att ultraljud-guidad intrakardiellt injektioner av MSCs resultera i ökad lokalisering till tarmen.
Abstract
Crohns sjukdom (CD) är en vanlig kronisk inflammatorisk sjukdom i små och stora tarmar. Murina och mänsklig mesenkymala stamceller (MSC) har immunsuppressiva potentialen och har visat att undertrycka inflammation i musmodeller av tarminflammation, även om administreringsvägen kan begränsa deras homing och effektivitet 1 , 3 , 4 , 5. lokala tillämpningen av MSCs kolon skada modeller har visat större effekt på ameliorating inflammation i tjocktarmen. Det finns dock bristen på uppgifter om tekniker för att förbättra localizationen av mänsklig benmärg-derived MSCs (hMSCs) till tunntarmen, platsen för inflammation i SAMP-1/YitFc (SAMP) modellen av experimentella Crohns sjukdom. Detta arbete beskriver en ny teknik för ultraljud-guidad intrakardiellt injektion av hMSCs i SAMP möss, en välkarakteriserad spontana modell av kronisk tarminflammation. Sex - och åldersmatchade, inflammation-fri AKR/J (AKR) möss användes som kontroller. För att analysera biodistribution och lokaliseringen, var hMSCs sensorik med ett lentivirus som innehåller en trippel reporter. Trippel reportern bestod av firefly luciferas (fl), för självlysande avbildning; monomer röd fluorescerande protein (mrfp), för cell sortering; och trunkerade herpes simplex virus tymidinkinas (ttk), för positronemissionstomografi (PET) imaging. Resultaten av denna studie visar att 24 h efter intrakardiellt kan hMSCs lokalisera i tunntarmen av SAMP möss i motsats till inflammation-fri AKR möss. Denna roman, ultraljud-guidad injektion av hMSCs i vänster kammare av SAMP möss säkerställer en hög framgång på cell leverans, vilket möjliggör snabb indrivning av möss med minimal sjuklighet och dödlighet. Denna teknik kan vara en användbar metod för förbättrad lokalisering av MSCs i andra modeller av små-intestinal inflammation, till exempel TNFΔRE6. Framtida studier kommer att avgöra om ökad lokalisering av hMSCs av Intra-arteriell leverans kan leda till ökad terapeutisk effekt.
Introduction
Crohns sjukdom (CD) är en vanlig kronisk inflammatorisk sjukdom i små och stora tarmar och är tänkt att resultera från ett olämpligt svar värd immunsystemet till intestinala mikroberna7,8. Nyligen genomförda studier har visat att både murina och mänsklig mesenkymala stamceller (MSC) kan dämpa inflammation i musmodeller av tarminflammation1,3,4,5. I området i närheten finns det flera pågående kliniska prövningar som använder mänskliga MSCs härrör från benmärgen eller fettvävnad för att behandla patienter med inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), vilket inkluderar CD9. Två vägar för MSC terapi har använts i dessa kliniska prövningar: en involverar systemisk infusionen (dvs, intravenöst) av MSCs för luminala IBD (inklusive CD), och den andra innebär lokaliserade ansökan/injektion av stamceller i fistel tarmkanalen hos patienter med perianal CD. I en nyligen meta-analys av MSC terapi för IBD, systemisk (dvs. intravenös) MSC terapi för luminala IBD (inklusive CD) var effektiv i upp till 40% (95% CI: 7-79%) av patienterna, medan effekten var mycket högre, på 61% (95% CI: 36-85%), när MSCs skulle injiceras lokalt i den sjuka CD fistel9. En senaste fas III multicenter randomiserad placebo-kontrollerad studie av allogena fett stamceller injiceras direkt i perianal fistel CD patienter visade statistiskt signifikanta kliniska och radiologiska tecken på perianala fistlar healing, bekräftar resultaten av en metaanalys10. Skälen till den låga effekten av MSC terapi ges intravenöst för luminala CD har studerats otillräckligt, men en anledning kan vara de otillräckliga homing av MSCs till platsen för inflammation. Murina studier i modeller av kolon inflammation har visat att de återstående MSCs filtreras av lungorna (första-passage-effekten)1,2 bara en liten andel av MSCs (1-5%) injiceras intravenöst nå inflammerade tjocktarmen; ,5,11,12. Flera murina forskningsstudier har därför använt sträckan intraperitoneal (IP) för MSC administration i djurmodeller av kolit4. De har emellertid också visat att endast en bråkdel av celler nå och engraft tjocktarmen och att effekten är relaterat till utsöndringen av lösliga parakrin faktorer, såsom tumörnekrosfaktor-inducerbara gen 6 protein (GTS-6)2. MSC mekanismen av immunsuppression och läkning innebär en öppen strategi som involverar parakrin; cell närhet-oberoende faktorer, som GTS-6; och cell närhet-beroende faktorer, liksom programmerad död-ligand 1 (PD-L1); eller ojämna 1. Därför, MSC lokalisering till platsen av inflammation kan resultera i ökad effekt9,13. I själva verket visade en nyligen genomförd studie att MSCs direkt implanteras på platsen för kolon skada resulterade i helande genom att utsöndra angiogenes-främja vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). Däremot, noterades en minimal läkande effekt efter intravenös injektion5. För att öka deras localization till platsen av inflammation (dvs. tunntarmen i SAMP möss), utvecklades detta ultraljud-guidad intrakardiellt injektionsteknik för MSC administration i vänster kammare. Bild-guidad injektion säkerställer en korrekt injektion, vilket leder till en högre frekvens av framgång och till minskad sjuklighet och dödlighet. Dessutom levererar en injektion av MSCs i vänster kammare dem till arteriell cirkulation, där de kan nå inflammerade tunntarmen innan att bli instängd i lungorna.
I denna studie användes mänsklig benmärg-derived MSCs (hMSCs) injektionsvätska i SAMP-1/YitFc (SAMP) murina modellen CD14. SAMP är en välkarakteriserad spontana murina modell av kronisk inflammation som utvecklar små-tarminflammation med nästan 100% penetrans14. Inflammation utvecklar svar på mikrofloran i avsaknad av någon kemisk, immunologiska eller genetisk manipulation och liknar mänskliga CD11. Sex - och åldersmatchade inflammation-fri AKR/J (AKR) möss, föräldrakontroll möss av SAMP, användes i denna studie.
HMSCs var isolerade och expanderat i laboratoriet från benmärgen (BM) produktproverna normal, oidentifierade givare efter informerat samtycke använda validerats och tidigare publicerade protokoll15,16. Efter isolering och expansion, MSC förmågan i osteogent, adipogena, och chondrogenic differentiering utvärderades i laboratorium av flera analyser15. Osteogena funktionella analysen utfördes av implantera keramiska kuber av hydroxyapatit/trikalciumfosfat fosfat matris som innehåller hMSCs subkutant i nedsatt immunförsvar CB17-Prkdc SCID möss17. Kub analysen visar osteogenesis och kondrogenes potentiella och anses vara det ultimata testet för att utvärdera enskilda MSC preparat17. För att visualisera hMSCs i vivo efter injektion, användes lentivirus för att transduce hMSCs med trippel reporter gen konstruktion som består av firefly luciferas (fl), monomer röd fluorescerande protein (mRFP) och herpes simplex virus tymidinkinas (ttk ), driven av en modifierad myeloproliferativa sarkom virus (mnd) arrangören18. Den firefly luciferas i trippel reportern är ett enzym som gömslen injicerade luciferin till oxyluciferin i hMSCs och producerar fotoner/vitt ljus. Detta upptäcks av känsliga kostnad – tillsammans enhet (CCD) kameran (Mareld) i en in-vivo optisk imaging system, som gör att visualisering av levande hMSCs i möss. Mareld imaging (BLI) är en känslig teknik som kan användas seriellt för att spåra celler och för ex vivo analys. Användning av en stark mnd promotor driver kontinuerlig uttrycket av den tredubbla fusion reporter gen bygga och möjliggör avbildning av injicerade hMSCs i mer än 16 veckor19. HMSCs är svåra att transduce och har en låg transduktion effektivitet. Med en optimerad protokollet, hMSCs transduktion effektiviteten förbättrades och transgenens uttryck var förbättrad18. Använder mRFP uttryck (en av generna som trippel reporter) på flödescytometri, visades förmågan att transduce hMSCs med en hög verkningsgrad på upp till 83%. Differentiering-analyser och i vivo kub analyser visat den transduced hMSCs förmåga att differentieras till kondrocyter, adipocyter och osteocyter17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla möss experiment och förfaranden i studien var godkänd av Case Western Reserve University ' s institutionella djur vård och användning kommittén. Förfaranden som genomfördes i föreningen för bedömning och ackreditering av laboratorier djurvård (AAALAC) ackrediterade anläggning. BM var aspirerade under ett universitet sjukhus institutionella Review Board-godkända protokoll på stamceller core anläggning vid Case Western Reserve University efter informerat samtycke.
1. kultur och transduktion av mänsklig benmärg-derived mesenkymala stamceller (hMSCs)
Obs: isolering av hMSCs beskrivs i detalj i tidigare publikationer 15 , 20.
- Kultur isolerade hMSCs i Dulbecco ' s modifierade Eagle Medium-låg glukos (DMEM-LG) medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS). Odla cellerna vid 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO 2 i T175 kolvar med 25 mL odlingsmedium. Ersätta mediet var 3-4 dagar. På dag 14, utföra primära passage av hMSCs.
- När cellerna nå 80% sammanflödet, helt ta bort det gamla mediet och försiktigt tvätta cellerna med 5 mL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS; för 75 cm vävnadsodling kolvar).
- Ta bort PBS från kolven och Lägg 4 mL av 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA). Ställ kolven igen i inkubatorn vid 37 ° C i 5-10 min. Håll exponeringstiden så kort som möjligt.
- När flertalet celler har blivit väl avrundad eller har lossnat från kultur skålen, stoppa reaktionen genom att lägga till en volym av nötkreatur kalvserum lika med halva volymen av trypsin.
- Överför cellsuspensionen till en lämplig storlek centrifugrör. Centrifugera cellerna vid 400 x g i 5 min och ta sedan försiktigt bort supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 5 mL medium (DMEM-LG + 10% FBS) och räkna cellerna med en hemocytometer.
Obs: Vid denna punkt, cellerna kan subkultiveras eller sensorik med trippel reporter.
- Utföra transduktion av hMSCs med trippel reporter.
- Utsäde 1,5 x 10 6 celler i en T175 kolv. Odla cellerna i 25 mL odlingsmedium vid 37 ° C, 95%, luftfuktighet och 5% CO 2. Vänta 24 h för cellerna att bifoga.
- Göra ett virus cocktail i 15 mL rör, som beskrivs i referens 18.
- Tina lentivirus vid 37 ° C i ett vatten bad. Tillsätt 160 µL av en 5 mg/mL proteamine sulfat lösning i Dulbecco ' s ändrad Eagle Medium (DMEM) till 8 mL odlingsmedium (DMEM-LG + 10% FBS) för en slutlig koncentration på 100 µg/mL. Virvel för 3 s. Lägg en virus multiplicity av infektion (MOI) av 5 (1: a gången tinade) .
- Bort mediet från cell kultur kolven (steg 1.2.1) och lägga den virus cocktailen till cellerna. Inkubera i 10 h på 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO 2.
- Lägga till 4 mL 100 µg/mL proteamine sulfat i 4 mL DMEM-LG + 10% FBS och inkubera i en ytterligare 14 h.
- Stoppa transduktion efter 24 h ersätts med 25 mL av medium (DMEM-LG + 10% FBS).
- Bekräfta transduktion effektivitet genom att utvärdera mRFP uttryck av flöde flödescytometri 18.
Obs: Här, hMSCs som var sensorik med över 65% effektivitet användes. - Utöka cellerna genom att ersätta med 25 mL av färskt medium (DMEM-LG + 10% FBS) två gånger i veckan. Odla cellerna vid 37 ° C, 95%, luftfuktighet och 5% CO 2. Passagen celler när de når 80% sammanflödet.
- När önskat antal celler är nådd, utföra trypsinization per steg 1.1.2 - 1.1.4.
- Räkna cellerna och upphäva dem i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (1 x) i slutliga koncentration 1 x 10 6 celler/75 µL. hålla cellerna på is för transport till ultraljudsmaskinen. För experiment, använda hMSCs från passage nummer 2-5.
2. Ultraljud-guidad intrakardiellt injektion av hMSCs in i vänster kammare
Obs: Använd SAMP1/YitFc med etablerade små-intestinal inflammation och och kön-åldersmatchade AKR/J möss för experiment. Upprätthålla de SAMP och AKR möss särskilda villkor patogenfria, mata dem standard laboratorium chow och hålla dem på 12-h ljus/mörk cykler. Ultraljud-guidad hjärt injektioner utfördes här, i en dedikerad patogenfria ekokardiografi rum ligger i CWRU djur forskningsanläggning som var sanerad med ett desinfektionsmedel och sköljas med 70% alkohol. Laboratoriepersonal forskning måste bära skyddsutrustning, inklusive kappor, ansiktsmasker med ögat sköldar och sterila handskar under intrakardiellt injektionerna. Kroppsvärmen hos musen måste upprätthållas under hela förfarandets.
- Ställa in Ultraljudet imaging system innan anesthetizing musen. För detta protokoll, använda ultraljudsmaskinen utformad för mus ekokardiogram.
- Slå på kraft och initiera givaren (30 MHz) för att ställa in den nya studien.
- Söva musen i en induktion kammare med 3-4% isofluran i 100% syre vid en frekvens av 0,2 - 0,5 L/min. behålla djuret för hela förfarandet med 2% isofluran i 100% syre via en Kona. Bekräfta rätt anesthetization innan du utför bildbehandling genom att nypa tån, rullande musen, och observera avsaknad av rörelse.
Obs: Oftalmologiska salva appliceras på ögonen efter induktion av anestesi att förebygga korneal torkning. Överföra de sövda möss till imaging maskiner (dvs, Mareld bildsystem och ultraljud), där de får en underhållsdos av bedövningsmedel isofluran. Bestämma anestesi starttid och djup anestesi genom att observera en brist på reaktion mot nypor på svansen och foten pad varje 10 min för hela anestesi. - Ställa in temperaturen av imaging tabell och ultraljud gel till 37 ° C.
- Helt ta bort pälsen över bröstkorgen sövda musen använder hårborttagningskräm.
- Placera musen på tabellen imaging i ryggläge och säkra både de övre och nedre extremiteterna med tejp för att undvika kroppsrörelse under förfarandet. Använda en EKG-monitor under förfarandet för alla möss.
- Rengör huden på bröstkorgen området med en 10% povidon/Jod Svabb följt av en 70% etanol svabb. Applicera ett tjockt lager av gel till området thorax musklick.
- Montera givaren i hållaren och justera dess position tills vänster kammare syns tydligt på synfältet.
- Belastning 150 µL av sensorik hMSC cellsuspension (2 x 10 6 hMSCs i 150 µL sterilt PBS) i en 1 mL spruta med ett 28-G nål och säkra sprutan till lämpliga innehavaren. För att visualisera pulserande blod, hålla en liten luft kolumn i sprutan. Tillfälligt upphäva cellerna före injektion för att undvika klumpar,.
- Förväg sprutan mot mus bröstkorgen, justera nålen banan med hjälp av ultraljud vägledning och ange vänster kammare.
- Efter vägledningen av ultraljud, tränga in sprutans nål genom interkostalrummet och in i vänster kammare av musen.
Obs: Spruta kanylspetsen ska synas tydligt i vänster hjärtkammare på ultraljud bild. Lämplig placering bör bekräftas ytterligare av färska arteriellt blod utflöde i sprutan. Dessa är tecken på en lyckad isättning. - Injicera hMSC cellsuspensionen mycket långsamt över 2 min, tillämpa mild prePress.
- Efter injektion av suspenderade celler, försiktigt dra ut injektionsnålen, rensa bort i ultraljud gel, och släpp musen från tejp begränsningar.
- Placera djuret i en ny, ren bur med en förvärmd pad.
Obs: Efter slutförandet av förfarandet, en varm miljö bör ges till möss tills återhämtning. Överhettning bör undvikas, eftersom Perifer vasodilatation äventyrar återhämtningen. Mössen bör övervakas noggrant och hålls isolerade från andra möss tills deras full återhämtning, indikeras av deras förmåga att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. - Övervaka djuret tills de uppnår fullständig återhämtning från anestesi och dagligen fram till slutet av experimentet.
3. Mareld (BLI) avbildning av hMSCs
- bild mössen 24 h efter intrakardiellt injektionen i Mareld imaging system. Starta i vivo imaging programvara. Initialisera bildgivande systemet och öppna en ny studie.
- I Kontrollpanelen ange parametrarna imaging genom att klicka " sekvens inställningar. " i imaging-läge, Välj " luminiscens " och " fotografi. " ange exponering från 0,5 s till 10 min. Ange den binning till " medium " och F / stop till " 1. " anger excitationsfilter " block " och filtret utsläpp till " öppna. " inställt synfältet " C " för två möss. Lägg sekvens setup guiden genom att klicka på förvärvet Kontrollpanelen.
- Slå på syre pump och uppsättning av isofluran till 2,5% i både induktion kammaren och näsan konen inuti maskinen.
- Injicera mus i.p. med 300 µL av D-Luciferin (12,5 mg/mL).
- Placera musen i anestesi induktion kammaren.
- Efter 2-3 min, föra musen till den i vivo imaging kammare, med huvudet i näsan konen på anestesi grenröret. Tillämpa optiska salva för att skydda ögonen under imaging. För att bild flera möss, använda svart ljus baffel för att förhindra reflektion av ljus på intilliggande möss.
- Klicka på den " förvärva " knappen för att starta bild förvärv 10 min efter injektion D-Luciferin.
- Upprepa steg 3,3-3,5 för att bild fler möss.
- Efter i vivo bild förvärv, eutanasi möss av CO 2 inandning följt av cervikal dislokation, bekräfta död. Utför analysen ex vivo.
- Om ex vivo analysen utförs efter 20 min, upprepa luciferin injektionen (steg 3.3) innan att offra möss; BLI signalen kan minska 20 min efter injektionen luciferin.
- Dissekera möss för att ta bort de hela mag-tarmkanalen (dvs. från magen till rektum), mesenteriska lymfkörteln (MUSD), lungor, mjälte och lever. Placera dem i petriskålar med pincett och sax 2 , 4.
- Placera petriskål innehållande explanterad organen i imaging kammaren och förvärva BLI bilder per steg 3.1-3.6.
- Efter bild förvärv, överföra explanterad organ till preparatet formar som innehåller optimala skärtemperatur (ULT) förening. Cryofreeze formarna vid-80 ° C med torris. Utföra immunhistokemi med anti luciferas antikropp på frusna snitt för att bekräfta förekomsten av hMSCs 16.
- För kvantifiering av ljusintensitet, använda regionen av intresse (ROI) verktyg i verktyget palett 16 , 19. Välj den ROI ram och flytta den till regionen av intresse på bilden. Klicka på " avkastningen mätning " och spara data i SEQ-format. Exportera data som en .txt-fil och använda statistisk programvara för att utföra grundläggande statistiska tester för kvantifiering 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar att hMSCs kan vara sensorik med trippel reporter på en högeffektiv, bevara deras stamceller egenskaper. Sensorik hMSCs kan visualiseras i realtid av BLI (figur 1 c, figur 3). Denna roman, ultraljud-guidad injektion av hMSCs in i vänster kammare av SAMP möss garanterar en mycket hög framgång på injektion, vilket möjliggör snabb indrivning av möss med minimal sjuklighet och dödlighet (figur 2). Den genomsnittliga tiden för att injicera en mus med hMSCs är ca 10 min, och mindre än 8-9% sjuklighet och dödlighet observerades med denna teknik. Den viktigaste orsaken till mortalitet är stroke och hjärttamponad från hemorragisk perikardiell utgjutning. Ex vivo analys utförs 24 h efter intrakardiellt (intraarteriell) administrering av hMSC bekräftar att denna väg av administration resultat i homing av hMSCs till inflammerad tunntarmen av SAMP möss, i motsats till inflammation-gratis styra möss (figur 3 c och D). Dessutom tenderar hMSCs att inte bo i tunntarmen av inflammation-fri AKR möss och börja ackumulera eller att fastna i lungorna (figur 3B).
Figur 1 . hMSCs kan vara sensorik med en hög verkningsgrad för In Vivo visualisering och med bibehållande av Stem Cellegenskaper. (A) mikroskopisk bild av sensorik hMSCs. Framgångsrika transduktion av mänskliga MSCs, som bestäms av mRFP uttryck utvärderas med flödescytometri BLI (C)och (B) . Sensorik hMSCs behålla stamceller egenskaper, vilket bekräftas av differentiering-analyser som visar sensorik hMSCs förmåga att differentieras till kondrocyter, adipocyter och osteoblaster. För en funktionell analys, var keramiska kuber av hydroxyapatit/trikalciumfosfat fosfat matrix implanteras subkutant i nedsatt immunförsvar CB17-Prkdc SCID möss att demonstrera hMSCs förmåga att bilda ektopisk givare ben (D). Skala barer i A = 500 µm. skala barer i C ange måttenheter BLI (103 fotoner/s/cm2/steradian). Skala barer i D = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Instrument för ultraljud-guidad injektion. (A) panoramautsikt över instrumenten: ekokardiografi imaging system (Röda torget), givaren monterad i träffande innehavaren, spruta innehavaren och operationsbord med noskon för anestesi (Grön fyrkant), och inandning anestesi maskin med induktion kammare (gul fyrkant). (B) ultraljud bild av sprutans nål: nålspetsen (röd pil) är tydligt synlig i den vänstra ventrikeln (gula pilar). (C) färska arteriellt blod utflöde i sprutan bekräftar framgångsrika införandet av sprutans nål in i vänster kammare före hMSC administrering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . hMSCs lokalisera till tunntarmen efter Intracardiac/intra-net-arterial Administration i SAMP möss. Representativa bilder av 3-4 möss/grupp, euthanized 24 h efter injektion och från tre oberoende experiment visas. In vivo Mareld imaging visar förekomsten av hMSCs i SAMP och AKR möss 24 h efter injektion (A). Ex vivo analys i SAMP möss visar att hMSCs prioriterat lokalisera till tunntarmen (dvs platsen för inflammationen) (D), medan de tenderar att inte bo i tunntarmen av inflammation-fri kontroll AKR möss (C). I själva verket efter första arteriell passagen, hMSCs börja ackumulera mer i lungorna av AKR möss, i motsats till SAMP möss (B). En bråkdel av hMSCs kan också upptäckas i mjälten, levern och lungorna av SAMP och AKR möss (B, C, D). Skala staplarna visar enheter av BLI (103 fotoner/s/cm2/steradian). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie beskriver en ny teknik för ultraljud-guidad intrakardiellt injektion av hMSCs i en liten-tarm musmodell av experimentella CD. Denna teknik har mycket hög överlevnad och framgång, som banan för nålen kan justeras baserat på realtid, högupplösta bilder av musen vänster kammare, som tillhandahålls av Ultraljudet. Fördelen med leverans till vänster kammare är att hMSCs distribueras inom arterially och kringgå venösa cirkulationen, därmed undvika sammanläggning av celler i lungorna. Tidigare användes halspulsådern kateterisering för intra-arteriell leverans att injicera MSCs16,21. Den halspulsådern kateterisering metoden innebär operation för att avslöja halspulsådern för att placera en kateter inuti artär. Katetern är avancerade mot aortabågen för transfusion av celler. Katetern avlägsnas därefter och halspulsådern sammanskrivna. Denna nya teknik för ultraljud-guidad injektion av MSCs i vänster hjärtkammare, jämfört med halspulsådern kateterisering, är mindre invasiva, är mycket snabbare (ca 10 min/mus kontra 60 min/mus), och har mindre sjuklighet och dödlighet (< 10% jämfört med 30%). Den kliniska översättningen av mus ultraljud-guidad intrakardiellt injektion av hMSCs till kliniska prövningar skulle vara genom kateterisering av den överlägsna mesenterica artären (för närvarande utförs för behandling av kronisk mesenterica ischemi och svårlösta gastrointestinal blödning) att leverera hMSCs till sjuka tunntarmen.
I området i närheten finns det flera överväganden angående modifieringar och felsökning av intrakardiellt ultraljud-guidad injektion av hMSCs i vänster kammare av möss. En kritisk aspekt av förfarandet är att behärska användningen av ultraljud att styra injektionsnålen i vänster kammare. Liksom varje förfarande, ordentlig utbildning, praktik och expert feedback är viktiga komponenter för att kunna utföra denna procedur. Dålig teknik kan leda till hjärttamponad från hemorragisk perikardiell utgjutning och till döden. För att minimera cell klumpar och risken för embolisering till hjärnan (dvs, stroke), är det viktigt att resuspendera hMSCs före varje injektion. Innan genomförandet av detta förfarande, är det viktigt att konsultera en veterinär som ansvarar för den lokala djur forskningsanläggningen att få expertråd. Säkerställa att riktlinjer för säker och effektiv användning av djur följs för att minimera oavsiktlig skada till möss.
För att undersöka biodistribution av hMSCs efter injektionen i möss, var hMSCs framgångsrikt sensorik med trippel reporter, med hög verkningsgrad. Differentiering-analyser utförs visat sensorik hMSCs förmåga att differentieras till kondrocyter, adipocyter och osteocyter18. För osteogent funktionella analysen, keramiska kuber av hydroxyapatit/trikalciumfosfat fosfat matrix var implanteras subkutant hos immunsupprimerade SCID möss och visat hMSCs förmåga att bilda ektopisk givare ben17,18 . Dessa differentiering och funktionella analyser visar att sensorik hMSCs behåller sina stamceller egenskaper. Resultaten av denna studie visar att sensorik hMSCs används för intrakardiellt injektion i SAMP möss lokalisera till tunntarmen, som är platsen för inflammationen i SAMP möss. I intestinal inflammation-fri AKR möss, bara en minoritet av hMSCs lokaliserad till tarmarna 24 h efter injektionen, vilket innebär att, i avsaknad av inflammation, förblir hMSCs inte i tarmen. Dessa data är i överensstämmelse med flera andra studier som har visat förmåga MSCs att migrera och engraft på platsen för skadan, som hjärtat i akut hjärtinfarkt22 och den skadade BM i en strålning-skadade benet16. Som i andra sjukdomar, har den lokala tillämpningen av MSCs kolon skada modeller visat effekt på ameliorating inflammation23. I en 2,4,6-trinitrobonzene sulfonsyra (TNBS) modell av kolit hos råttor accelererade Hayashi et al. injiceras BM-derived MSCs i submucosa av råtta kolon, omger området utsätts för TNBS, och visat läkning av kolit23 .
En färsk studie av Manieri et al. används ny teknik av endoskop-assisted injektion av kolon MSCs i distala kolon, platsen för kolon skada, i prostaglandin-brist möss och visade sin effektivitet att förebygga bildandet av penetrerande sår5. SAMP är en modell av små-tarminflammation och mössen utvecklar inte spontana inflammation i deras kolon. Vårt laboratorium har utvecklats och validerats en endoskopisk metod för bedömning och kvantifiering av kolon inflammation och tumörutveckling hos möss. Endoskopisk utrustning omfattas dock inte kunna nå tunntarmen i en levande mus24. Poängsystem kan endast användas som terminal metod för bedömning av inflammation i SAMP möss efter dödshjälp. Den endoskopiska metoden passar därför inte för den lokala tillämpningen av MSCs i SAMP-modellen. Genom att använda denna nya teknik för injektion, kan förbättrad lokalisering av MSCs till tunntarmen uppnås. Om ökad lokaliseringen till inflammerad tunntarmen kommer att leda till ökad effektivitet är inte känt och kommer att vara i fokus för framtida studier. Förutom den SAMP modellen, skulle ultraljud-guidad injektion av MSCs vara en användbar metod för förbättrad lokalisering av hMSCs i andra modeller av små intestinal inflammation, till exempel TNFΔRE6 murina modellen av experimentella CD.
BLI är känslig och bekväm teknik som kan användas seriellt att spåra hMSCs i vivo, men det tillåter inte för exakt kvantifiering av hMSC homing. En fördel med den tredubbla reporter-sensorik hMSCs hos möss är att de enzym ttk i trippel reportern tillåter mer kvantitativa positronemissionstomografi (PET) imaging19. Att kombinera mycket kvantitativ PET imaging (med en radiotracer sond) med en datortomografi (CT) scan (förutsatt att lokalisering) möjliggör en kvantitativ uppskattning av antalet rekonstituerades hMSCs på webbplatsen för sjuka som gamma räkningarna är proportionell mot den antal den livskraftiga hMSCs märkt med ttk genen. Exakt kvantifiering av hMSC lokalisering kan hjälpa till att bestämma procentandelen av hMSCs homing och terapeutisk effekt och kommer att vara i fokus för framtida studier.
Denna teknik, trots dess många fördelar, har vissa begränsningar: i) kravet på en dyr ekokardiografi imaging system för möss, ii) dödlighet och sjuklighet som är associerad med intrakardiellt injektion, och iii) oförmåga att användas för den långsam infusion (dvs.m > över timmar) av celler och andra molekyler. Trots dessa begränsningar har det många fördelar över den aktuella tekniken av halspulsådern kateterisering för intra-arteriell injektion av hMSCs, som framhållits ovan.
Sammanfattningsvis visar resultaten av denna studie effektivitet och bekvämlighet av ultraljud-guidad injektionsteknik att förbättra lokalisering av hMSCs till platsen för inflammation i SAMP modellen av experimentella CD. Framtida studier kommer att avgöra om den ökade homing av hMSCs av Intra-arteriell leverans kan leda till ökad terapeutisk effekt i modeller av små-och tarminflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Maneesh Dave stöds försvarsdepartementet grant PR141774 och Crohns kolit Foundation of America karriär utveckling Award. Laboratoriet för Fabio Cominelli stöds av NIH beviljar DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) och DK07948 (FC). Laboratoriet för Arnold Caplan stöds delvis av L. David och E. Virginia Baldwin stiftelse. Finansiärerna hade ingen roll i studien analys eller skrivandet av manuskriptet. Dess innehåll ansvarar enbart för författarna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
