Summary
Lymfkliertest studies in modellen van Colon ontsteking hebben aangetoond dat een klein percentage (1-5%) van mesenchymale stamcellen (MSC) intraveneus geïnjecteerd of intraperitoneally de thuisbasis van de ontstoken dubbele punt1,2. Deze studie toont aan dat echografie-geleide intracardiac injecties van MSCs in verhoogde localization voor de darm resulteren.
Abstract
Ziekte van Crohn (CD) is een gemeenschappelijk chronische ontstekingsziekte van de kleine en grote darmen. Lymfkliertest en menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs) immunosuppressieve potentieel hebben en is aangetoond dat het onderdrukken van ontsteking in muismodellen van darmontstekingen, hoewel de wijze van toediening hun homing en effectiviteit 1 beperken kan , 3 , 4 , 5. lokale toepassing voor MSCs tot Colon schade modellen is gebleken dat grotere werkzaamheid bij de verbetering van de ontsteking in de dikke darm. Echter, er is schaarste van gegevens over technieken ter verbetering van de lokalisatie van menselijke beenmerg-afgeleide MSCs (hMSCs) naar de dunne darm, de site van ontsteking in het SAMP-1/YitFc (SAMP) model van experimentele Crohn's disease. Dit werk beschrijft een nieuwe techniek voor de echografie-geleide intracardiac injectie van hMSCs in SAMP muizen, een goed gekarakteriseerd spontane model van chronische darmontstekingen. Geslacht en leeftijd-zoekwoorden, ontsteking-vrije AKR/J (AKR) muizen werden gebruikt als besturingselementen. Als u wilt analyseren het ook en de lokalisatie, hMSCs waren getransduceerde met een lentivirus met een drievoudige reporter. De drievoudige verslaggever bestond uit firefly luciferase (fl), voor bioluminescente imaging; Monomere rood fluorescerende eiwit (mrfp), voor het sorteren van de cel; en afgekapte herpes simplex virus thymidinekinase (ttk), voor positron emissie tomografie (PET) imaging. De resultaten van deze studie tonen dat 24u na de intracardiac toediening, hMSCs lokaliseren in de dunne darm van SAMP muizen in tegenstelling tot ontsteking-vrije AKR muizen. Deze roman, echografie-geleide injectie van hMSCs in het linkerventrikel van SAMP muizen zorgt voor een hoog slagingspercentage van levering van de cel, waardoor voor het snelle herstel van muizen met minimale morbiditeit en mortaliteit. Deze techniek zou een handige methode voor de verbeterde lokalisatie van MSCs in andere modellen van kleine-darmontstekingen, zoals TNFΔRE,6. Toekomstige studies zal bepalen als de verhoogde lokalisatie van hMSCs door intra-arteriële levering tot verhoogde therapeutische werking leiden kan.
Introduction
Ziekte van Crohn (CD) is een gemeenschappelijk chronische ontstekingsziekte van de kleine en grote darmen en wordt beschouwd als het resultaat zijn van een ongepaste reactie van het immuunsysteem van de gastheer intestinale microben7,8. Recente studies hebben aangetoond dat zowel menselijke als lymfkliertest mesenchymale stamcellen (MSCs) ontsteking in muismodellen van darmontstekingen1,,3,,4,5kunt onderdrukken. Er zijn meerdere lopende klinische proeven die gebruikmaken van menselijke MSCs afgeleid van beenmerg of adipeus weefsel voor de behandeling van patiënten met inflammatoire darmziekte (IBD), waarin CD9. Twee routes voor MSC therapie zijn gebruikt in deze klinische tests: een gaat de systemische infusie (dat wil zeggen, intraveneus) van MSCs voor luminal IBD (inclusief CD), en anderzijds impliceert de gelokaliseerde toepassing/injectie van stamcellen in de fistel darmkanaal van patiënten met perianal CD. In een recente meta-analyse van MSC therapie voor IBD, systemische (dat wil zeggen, intraveneuze) MSC therapie voor luminal IBD (inclusief CD) is doeltreffend bij maximaal 40% (95% CI: 7-79%) van de patiënten, terwijl de werkzaamheid veel hoger, op 61 was % (95% CI: 36-85%), wanneer de MSCs lokaal waren in de zieke CD fistel9geïnjecteerd. Een recente fase III multicentrische gerandomiseerde placebo-gecontroleerde trial van allogene obesitas stamcellen geïnjecteerd rechtstreeks in de perianal fistel van CD patiënten toonde statistisch significante klinische en radiologische bewijs van perianal fistulae genezing, bevestigen de bevindingen van de meta-analyse-10. De redenen voor de lage werkzaamheid van MSC therapie intraveneus gegeven voor luminal CD onvoldoende is onderzocht kan, maar één reden de ontoereikende homing van MSCs op de site van ontsteking. Lymfkliertest studies in modellen van Colon ontsteking hebben aangetoond dat slechts een klein percentage van de MSCs (1-5%) intraveneus geïnjecteerd bereiken de ontstoken darm; de resterende MSCs worden gefilterd door de longen (first-pass effect)1,2 ,5,11,12. Meerdere lymfkliertest onderzoeken hebben daarom de intraperitoneaal route (i.p.) gebruikt voor MSC beheer in diermodellen voor colitis4. Zij hebben echter ook aangetoond dat slechts een klein deel van de cellen bereiken en engraft van de dikke darm en dat de werkzaamheid is gerelateerd aan de secretie van oplosbare paracrine factoren, zoals Tumornecrosefactor-afleidbare gene 6 protein (TSG-6)2. Het MSC-mechanisme van immuunsuppressie en genezing impliceert een meervoudige aanpak waarbij paracrine; cel nabijheid-onafhankelijke factoren, zoals de GTS-6; en cel nabijheid-afhankelijke factoren, zoals geprogrammeerd dood-ligand 1 (PD-L1); of gekartelde 1. Daarom, MSC lokalisatie naar de site van ontsteking kan resulteren in hogere werkzaamheid9,13. In feite, toonde een recente studie dat MSCs direct ingeplant op de site van Colon schade geleid tot genezing door afscheidende angiogenese-bevordering van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF). Aan de andere kant, is een minimale genezend effect na intraveneuze injectie5geconstateerd. Het vergroten van hun lokalisatie naar de site van ontsteking (dat wil zeggen, de dunne darm in SAMP muizen), werd deze echografie-geleide intracardiac injectietechniek voor MSC toediening in het linkerventrikel ontwikkeld. Image-guided injectie garandeert een nauwkeurige injectie, die leidt tot een hoger tarief van succes en daalde naar morbiditeit en mortaliteit. Bovendien, de injectie van MSCs in het linkerventrikel aflevert arteriële circulatie, waar ze de ontstoken dunne darm voordat steeds gevangen in de longen kunnen bereiken.
In deze studie, werden menselijke beenmerg-afgeleide MSCs (hMSCs) gebruikt voor injectie in het SAMP-1/YitFc (SAMP) lymfkliertest model van CD14. SAMP is een goed gekarakteriseerd spontane lymfkliertest model van chronische ontsteking die kleine-intestinale ontsteking met bijna 100% doordringendheid14ontwikkelt. De ontsteking ontwikkelt in reactie op de microflora in het ontbreken van elke chemische, immunologische en genetische manipulatie en veel overeenkomsten vertoont met menselijke CD11. Geslacht en leeftijd-zoekwoorden ontsteking-vrije AKR/J (AKR) muizen, de muizen ouderlijk toezicht voor SAMP, werden gebruikt in deze studie.
De hMSCs waren geïsoleerd en uitgebreid in het laboratorium van het beenmerg (BM) monsters van normale, niet-geïdentificeerde donors verlangde nadat geïnformeerde toestemming gebruik gevalideerd en eerder gepubliceerd protocollen15,16. Na isolatie en expansie, de mogelijkheid van de MSC in osteogenic, adipogenic, en chondrogenic differentiatie in het laboratorium door meerdere testen15werd geëvalueerd. De osteogenic functionele test werd uitgevoerd door het implanteren van keramische kubussen van hydroxyapatiet/tricalciumfosfaat fosfaat matrix met hMSCs subcutaan van immuungecompromitteerde CB17-Prkdc SCID muizen17. De kubus assay toont osteogenesis en potentiële chondrogenesis en wordt beschouwd als de ultieme test voor het beoordelen van individuele MSC preparaten17. Om te visualiseren hMSCs in vivo na injectie, was lentivirus gewend transduce hMSCs met drievoudige reporter gene constructie die uit de firefly luciferase (fl), monomere rood fluorescerende eiwitten (mRFP) en herpes simplex virale thymidinekinase (ttk bestaat ), aangedreven door een gewijzigde myeloproliferatieve Sarcoom virus (mnd) promotor18. De firefly luciferase in de triple verslaggever is een enzym dat luciferine zet ingespoten om oxyluciferine in hMSCs en fotonen/wit licht produceert. Dit wordt gedetecteerd door de gevoelige charge - coupled apparaat (CCD) camera (bioluminescentie) in een in vivo optisch imaging systeem, waardoor de visualisatie van levende hMSCs bij muizen. Bioluminescentie imaging (BLI) is een gevoelige techniek die serieel kan worden gebruikt voor het bijhouden van de cellen en voor ex vivo analyse. Het gebruik van een sterke mnd promotor rijdt de continue uitdrukking voor de triple fusion reporter gene construct en zorgt voor de beeldvorming van geïnjecteerd hMSCs voor meer dan 16 weken19. De hMSCs zijn moeilijk te transduce en hebben een lage transductie rendement. Met behulp van een geoptimaliseerde protocol, de efficiëntie van de transductie hMSCs werd verbeterd en de expressie transgenic verbeterde18was. Met behulp van mRFP expressie (een van de triple reporter genen) op stroom cytometry, werd de mogelijkheid om transduce van hMSCs met een hoge efficiëntie tot 83% aangetoond. Differentiatie testen en in vivo kubus vitrotests aangetoond dat het vermogen van de getransduceerde hMSCs om te differentiëren in de chondrocyten, adipocytes en osteocytes17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle muizen experimenten en procedures in de studie werden goedgekeurd door de Case Western Reserve University ' s institutionele Animal Care en gebruik Comité. De procedures werden uitgevoerd in associatie voor beoordeling en erkenning van Laboratory Animal Care (AAALAC) geaccrediteerde faciliteit. De BM was aanzuiging onder een universitaire ziekenhuizen institutionele Review Board-goedgekeurde protocol op de cel van de stam kern faciliteit aan de Case Western Reserve University na de geïnformeerde toestemming.
1. cultuur en transductie van menselijke beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (hMSCs)
Opmerking: de isolatie van de hMSCs is in detail beschreven in eerdere publicaties 15 , 20.
- Cultuur geïsoleerd hMSCs in Dulbecco ' s laag bewerkt Eagle glucose (DMEM-LG) medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS). Cultuur van de cellen bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO 2 in T175 flacons met 25 mL van groeimedium. Vervang het medium om 3-4 dagen. Op dag 14, de primaire passage van hMSCs uit te voeren.
- Wanneer de cellen bereiken 80% samenvloeiing, het oude medium volledig te verwijderen en voorzichtig wassen de cellen met 5 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; voor 75 cm weefselkweek kolven).
- Verwijderen van de PBS uit de kolf en voeg 4 mL 0,25% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA). Plaats de erlenmeyer terug in de incubator bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten de tijd van blootstelling zo kort mogelijk houden.
- Wanneer de meerderheid van de cellen goed-rond gemaakte zijn geworden of hebben losgemaakt van de cultuur-schotel, zet de reactie stop door het toevoegen van een volume van boviene kalfsserum gelijk is aan de helft van het volume van de trypsine.
- De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis nodig-grootte. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder daarna voorzichtig het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 5 mL medium (DMEM-LG + 10% FBS) en tellen van de cellen met een hemocytometer.
Opmerking: Op dit punt, de cellen worden overgeënt of getransduceerde met drievoudige verslaggever.
- Uitvoeren van de transductie van hMSCs met drievoudige verslaggever.
- Zaad 1.5 x 10 6 cellen in een T175 kolf. Cultuur van de cellen in 25 mL groeimedium bij 37 ° C, 95%, vochtigheid en 5% CO 2. Wacht 24 uur voor de cellen koppelen.
- Maken een virus cocktail in 15 mL buizen, zoals beschreven in referentie 18.
- Dooi lentivirus bij 37 ° C in een water bad. Voeg 160 µL van een oplossing van 5 mg/mL proteamine sulfaat in Dulbecco ' s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) 8 ml gestolde voedingsbodem (DMEM-LG + 10% FBS) voor een definitieve concentratie van 100 µg/mL. Vortex voor 3 s. toevoegen de multipliciteit van een virus infectie (MOI) van 5 (1e keer ontdooid) .
- Het medium verwijderen uit de cel cultuur kolf (stap 1.2.1) en het virus cocktail aan de cellen toevoegen. Incubeer gedurende 10 uur bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO 2.
- 4 mL 100 µg/mL proteamine sulfaat toevoegen in 4 mL DMEM-LG + 10% FBS en incubeer gedurende een extra 14 h.
- De signaaltransductie na 24 h stoppen door te vervangen met 25 mL van medium (DMEM-LG + 10% FBS).
- Bevestigen transductie efficiëntie door evaluatie van mRFP expressie door stroom cytometry 18.
Opmerking: Hier, hMSCs die getransduceerde waren met meer dan 65% efficiëntie dienden. - De cellen uit te breiden door te vervangen door 25 mL verse voedingsbodem (DMEM-LG + 10% FBS) tweemaal per week. Cultuur van de cellen bij 37 ° C, 95%, vochtigheid en 5% CO 2. Passage van de cellen nadat ze 80% samenvloeiing bereiken.
- Zodra het gewenste aantal cellen wordt bereikt, voeren trypsinebehandeling per stappen 1.1.2 - 1.1.4.
- Cellen tellen en ze op te schorten in steriele PBS (1 x) in de uiteindelijke concentratie van 1 x 10 6 cellen/75 µL. Houd de cellen op het ijs voor vervoer naar de echografie machine. Gebruik voor experimenten, hMSCs van passage nummers 2-5.
2. Echografie-geleide Intracardiac injectie van hMSCs in de linker ventrikel
Opmerking: gebruik SAMP1/YitFc met gevestigde kleine-intestinale ontsteking en leeftijd - en gender-matched AKR/J muizen voor de experimenten. Onderhouden van de SAMP en AKR muizen onder de voorwaarden van specifieke pathogenen vrije, voeden ze standaard laboratorium chow en houd ze op 12 uur licht/donker cyclus. Hier, werden de echografie-geleide cardiale injecties uitgevoerd in een toegewijde pathogenen vrije cardiale echografie kamer gelegen in de CWRU dierlijke onderzoeksfaciliteit, die was ontsmet met een ontsmettingsmiddel en gespoeld met 70% alcohol. Laboratorium onderzoek personeel moeten het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van toga's, gezichtsmaskers met oog schilden en steriele handschoenen tijdens de intracardiac injecties. De lichaamswarmte van de muis moet worden gehandhaafd voor de duur van de procedure.
- Instellen in de echografie imaging systeem vóór de anesthetizing van de muis. Gebruik de echografie machine ontworpen voor muis echocardiogram voor dit protocol.
- Zet de macht en initialiseren de transducer (30 MHz) de nieuwe studie instellen.
- Anesthetize van de muis in een zaal van de inductie 3-4% Isofluraan met 100% zuurstof met een snelheid van 0,2 - 0,5 L/min. handhaven het dier voor de hele procedure met 2% Isofluraan in 100% zuurstof via een neus kegel. Bevestigen van juiste afstomping voordat u imaging rollen door te knijpen de teen, de muis, en gebrek aan beweging observeren.
Opmerking: Ophthalmic zalf moet worden toegepast op de ogen na de inductie van de anesthesie om te voorkomen dat het drogen van het hoornvlies. De narcose muizen aan de beeldvorming machines (d.w.z., bioluminescentie imaging systeem en echografie), overdragen, waar ze een onderhoudsdosis van verdoving Isofluraan ontvangt. Bepalen van de narcose start tijd en de diepte van de verdoving door het observeren van een gebrek aan reactie op snuifjes op de staart en voet pad elke 10 min voor de gehele duur van de verdoving. - De temperatuur van de beeldvorming tabel en ultrageluid-gel ingesteld op 37 ° C.
- Volledig verwijderen van de vacht over het gebied van de thorax van de narcose muis gebruiken haar verwijdering room.
- Plaatst u de muisaanwijzer op de imaging tafel in liggende positie en beveiligen van zowel de bovenste en onderste ledematen met plakband om te voorkomen dat lichaamsbeweging tijdens de procedure. Een elektrocardiogram monitor gebruiken tijdens de procedure voor alle muizen.
- Reinigen van de huid van de borstkas gebied met behulp van een 10% Povidon/jodium doekje gevolgd door een doekje van 70% ethanol. Toepassing van een dikke laag gel op het gebied van de thorax van de muis.
- Monteren van de transducer in de houder en haar positie aanpassen totdat het linkerventrikel duidelijk zichtbaar zijn op het gezichtsveld is.
- Laden 150 µL celsuspensie getransduceerde hMSC (2 x 10 6 hMSCs in 150 µL van steriele PBS) in een injectiespuit 1 mL met een 28-G naald en de spuit om de juiste houder veilig. Om te visualiseren pulserende bloed, door een kleine lucht-kolom in de spuit te houden. Voorkom samendoen, schorten de cellen vóór de injectie.
- De spuit naar de muis thorax verder aanpassen van het traject van de naald met behulp van de echografie begeleiding en voer het linkerventrikel.
- De naald van de spuit via de intercostale ruimte en in het linkerventrikel van de muis na de begeleiding van de echografie beeldvorming, doordringen.
Opmerking: De spuit naald tip moet duidelijk zichtbaar in het linkerventrikel op de ultrasonographic afbeelding. Juiste plaatsing moet verder worden bevestigd door vers arteriële bloed uitstroom in de spuit. Dit zijn de tekenen van een succesvolle invoeging. - Injecteren de celsuspensie hMSC heel langzaam meer dan 2 min, zachte pre toe te passenssure.
- Na de injectie van zwevende cellen, voorzichtig terugtrekken van de naald, schoon uit de ultrageluid-gel, en laat de muisknop los van de beperkingen van de tape.
- Plaats het dier in een nieuwe, schone kooi met een voorverwarmde zeem.
Opmerking: Na de voltooiing van de procedure, een warme omgeving moet worden gegeven aan de muizen tot herstel. Oververhit moet worden vermeden, omdat perifere vasodilatatie het herstel compromissen. De muizen moeten worden nauwlettend gevolgd en hield geïsoleerd van andere muizen tot hun volledige herstel, aangegeven door hun vermogen om sternale lighouding. - Volgen het dier totdat zij volledig herstel van de narcose en dagelijks tot het einde van het experiment bereiken.
3. Bioluminescentie (BLI) beeldvorming van hMSCs
- Image de muizen 24u na de intracardiac injectie in de Bioluminescentie imaging systeem. Start de in vivo imaging-software. Initialiseren van de imaging systeem en open een nieuwe studie.
- In het Configuratiescherm van de imaging parameters instellen door te klikken op " volgorde setup. " In de grafische modus, selecteer " luminescentie " en " foto. " stelt u de blootstelling tijden van 0,5 s tot 10 min. de weggooien ingesteld op " medium " en de F / stop te " 1. " de excitatie-filter ingesteld op " blok " en het filter van de emissie naar " open. " het gezichtsveld ingesteld op " C " voor twee muizen. De reeks setup aan de wizard installatiekopie toevoegen door te klikken op het bedieningspaneel van de acquisitie.
- De luchtpomp en stelt de Isofluraan tot 2,5% in zowel de inductie-zaal en de neus kegel binnen de machine inschakelen.
- De muis i.p. injecteren met 300 µL van D-luciferine (12,5 mg/mL).
- Plaatst u de muisaanwijzer in de anesthesie-inductie-zaal.
- Na 2-3 min, breng de muis in de in vivo imaging kamer, met zijn hoofd in de neus op de variëteit van de verdoving. Toepassing van optische zalf ter bescherming van de ogen tijdens de beeldvorming. Naar image meerdere muizen, zwart licht klankbord te gebruiken om te voorkomen dat de weerkaatsing van het licht naar aangrenzende muizen.
- Klik op de " verwerven " knop voor voorsprong naar de Beeldacquisitie 10 min na injectie van de D-luciferine.
- Herhaal stap 3.3-3.5 naar image meer muizen.
- Na de in vivo image aquisition, euthanaseren de muizen bij CO 2 inademing gevolgd door cervicale dislocatie, ter bevestiging van de dood. De ex vivo-analyses uit te voeren.
- Als de analyse ex vivo wordt uitgevoerd na 20 min, herhaalt u de luciferine injectie (stap 3.3) voordat het opofferen van de muizen, het signaal BLI 20 min kan afnemen na de injectie luciferine.
- Ontleden de muizen om te verwijderen van de hele gastro-intestinale tractus (dat wil zeggen, van de maag tot en met het rectum), mesenterische lymfeklieren (MLN), longen, milt en lever. Plaats ze in petrischalen met behulp van Tang en schaar 2 , 4.
- Plaats de petrischaal met de transplanteren orgels in de beeldvorming kamer en verwerven BLI beelden per stappen 3.1-3.6.
- Na de overname beeld overbrengen in het transplanteren organen specimen mallen met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde. Cryofreeze de mallen op-80 ° C, met behulp van droogijs. Uitvoeren van immunohistochemistry met behulp van anti-luciferase antilichaam op bevroren secties ter bevestiging van de aanwezigheid van hMSCs 16.
- Gebruiken voor de kwantificering van de lichtintensiteit, de regio van belang (ROI) instrument in het hulpprogramma palet 16 , 19. Selecteer het frame van de ROI en verplaatsen naar regio van belang op de afbeelding. Klik op " ROI meting " en sla de gegevens in SEQ-bestandsindeling. De gegevens exporteren als een txt-bestand en het gebruik van statistische software voor uit te voeren statistische basistests kwantificering 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont dat de hMSCs kan worden transduced met de triple verslaggever bij een hoge efficiëntie, behoud van de eigenschappen van de cel van de stam. Getransduceerde hMSCs kunnen worden gevisualiseerd in real-time door BLI (Figuur 1 c, Figuur 3). Deze roman, echografie-geleide injectie van hMSCs in het linkerventrikel van SAMP muizen zorgt voor een zeer hoog slagingspercentage van injectie, waardoor voor het snelle herstel van de muizen met minimale morbiditeit en mortaliteit (Figuur 2). De gemiddelde tijd voor het injecteren van een muis met hMSCs is ongeveer 10 minuten, en minder dan 8-9% morbiditeit en mortaliteit werden waargenomen met deze techniek. De belangrijkste reden voor de sterfte is beroerte en cardiale tamponade van hemorragische pericardvocht effusie. De ex vivo analyse uitgevoerd 24u nadat de intracardiac (intra-arteriële) beheer van hMSC heeft bevestigd dat deze route van toediening resultaten in de homing van hMSCs aan de ontstoken kleine darm SAMP muizen, in tegenstelling tot ontsteking-gratis controle van muizen (Figuur 3 c en D). Bovendien, de neiging van de hMSCs niet te blijven in de dunne darm ontsteking-vrije AKR muizen en start accumuleren of krijgen gevangen in de longen (figuur 3B).
Figuur 1 . hMSCs kan worden Transduced met een hoge efficiëntie voor In Vivo visualisatie en met de retentie van stamcel eigenschappen. (A) microscopische opname van getransduceerde hMSCs. Succesvolle transductie van menselijke MSCs, zoals bepaald door mRFP expressie geëvalueerd stroom cytometry (B) en BLI (C). Getransduceerde hMSCs behouden stamcel eigenschappen, zoals bevestigd door differentiatie testen die blijk geven van het vermogen van getransduceerde hMSCs te onderscheiden in de chondrocyten, adipocytes en botcellen. Voor een functionele assay, waren de keramische kubussen van hydroxyapatiet/tricalciumfosfaat fosfaat matrix subcutaan geïmplanteerd bij immuungecompromitteerde CB17-Prkdc SCID muizen om aan te tonen van het vermogen van hMSCs om vormen van ectopische donor bot (D). Schaal bars in A = 500 µm. schaal staven in C geven eenheden van BLI (103 fotonen/s/cm2/steradian). Schaal bars in D = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Instrumenten voor echografie-geleide injectie. (A) een panoramisch uitzicht van de instrumenten: cardiale echografie imaging systeem (rood vierkant), transducer gemonteerd in toepasselijk houder, spuit houder en chirurgische tabel met neuskegel voor anesthesie (groene vierkantje), en inademing verdoving machine met inductie kamer (geel vierkant). (B) Ultrasonographic beeld van de spuit-naald: de naald tip (rode pijl) is duidelijk zichtbaar in het linkerventrikel (gele pijlen). (C) vers arteriële bloed uitstroom in de spuit bevestigt het succesvolle inbrengen van de naald van de spuit in het linkerventrikel vóór de toediening van de hMSC. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . hMSCs Lokaliseer aan de dunne darm na Intracardiac/Intra-arterial toediening in SAMP muizen. Representatieve beelden van muizen/groep 3-4, euthanized 24 h na injectie en uit drie onafhankelijke experimenten worden weergegeven. In vivo bioluminescentie imaging toont de aanwezigheid van hMSCs in SAMP en AKR muizen 24u na injectie (A). Ex vivo analyse in SAMP muizen blijkt dat hMSCs bij voorkeur naar de dunne darm (dat wil zeggen, de site van ontsteking lokaliseren) (D), terwijl ze de neiging om niet blijven in de dunne darm ontsteking-gratis controle AKR muizen (C). In feite, na de eerste arteriële passage, hMSCs beginnen meer zich ophopen in de longen van de AKR muizen, in tegenstelling tot SAMP muizen (B). Een fractie van hMSCs kan ook worden gedetecteerd in de milt, de lever en de longen van SAMP en AKR muizen (B, C, D). De schaal staven geven eenheden van BLI (103 fotonen/s/cm2/steradian). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie beschrijft een nieuwe techniek voor de echografie-geleide intracardiac injectie van hMSCs in een kleine-intestinale muismodel van experimentele CD. Deze techniek is zeer hoog tarief van overleving en succes, als het traject van de naald kan worden aangepast op basis van real-time, hoge resolutie beelden van de muis linker ventrikel, geboden door de echografie. Het voordeel van de levering aan het linkerventrikel is dat hMSCs worden vervolgens verdeeld tijdens arterially en veneuze circulatie, dus het vermijden van de samenvoeging van cellen in de longen te mijden. Eerder, halsslagader catheterisatie voor intra-arteriële levering werd gebruikt voor het injecteren van MSCs16,21. Bij deze methode carotis catheterisatie wordt operatie aan de halsslagader bloot om een katheter in de ader. De katheter is gevorderd op de weg naar de aortaboog voor transfusie van cellen. De katheter wordt daarna verwijderd en de halsslagader afgebonden. Deze nieuwe techniek voor de echografie-geleide injectie van MSCs in het linkerventrikel, in vergelijking met de halsslagader catheterisatie, minder invasieve is, is veel sneller (ongeveer 10 min/muis tegenover 60 min/muis), en heeft minder morbiditeit en mortaliteit (< 10% versus 30%). De klinische vertaling van de muis echografie-geleide intracardiac injectie van hMSCs menselijke klinische proeven zou door de catheterisatie van de superieure mesenterische slagader (momenteel worden uitgevoerd voor de behandeling van chronische mesenterische ischemie en hardnekkige gastro-intestinale bloedingen) te hMSCs leveren aan de zieke dunne darm.
Er zijn verscheidene overwegingen met betrekking tot wijzigingen en probleemoplossing van de echografie-geleide intracardiac injectie van hMSCs in het linkerventrikel van muizen. Een kritisch aspect van de procedure is het beheersen van het gebruik van de echografie bij de injectie-naald in het linkerventrikel. Zoals elke procedure, juiste opleiding, ervaring en deskundige feedback zijn belangrijke onderdelen met succes het uitvoeren van deze procedure. Slechte techniek kan leiden tot cardiale tamponade van hemorragische pericardvocht effusie en tot de dood. Om te minimaliseren het samendoen van de cel en het risico van embolisatie kan leiden naar hersenen (dat wil zeggen, lijn), is het essentieel om resuspendeer de hMSCs voorafgaand aan elke injectie. Voordat u deze procedure implementeert, is het belangrijk om te raadplegen van de dierenarts die belast is met de lokale dierlijke onderzoeksfaciliteit deskundig advies ontvangen. Ervoor zorgen dat de richtsnoeren voor een veilig en doeltreffend gebruik van dieren worden gevolgd om te minimaliseren van onbedoelde schade aan de muizen.
Om te onderzoeken de ook van hMSCs na de injectie bij muizen, hMSCs werden met succes getransduceerde met drievoudige verslaggever, met een hoog rendement. Differentiatie testen uitgevoerd de capaciteit aangetoond van getransduceerde hMSCs om te differentiëren in osteocytes18, chondrocyten en adipocytes. Voor de osteogenic functionele assay, de keramische kubussen van hydroxyapatiet/tricalciumfosfaat fosfaat matrix subcutaan bij immuungecompromitteerde SCID muizen werden geïmplanteerd en blijk gegeven van het vermogen van hMSCs om vormen van ectopische donor bot17,18 . Deze differentiatie en functionele tests tonen aan dat getransduceerde hMSCs hun eigenschappen van de cel van de stam behouden. De resultaten van deze studie blijkt dat getransduceerde hMSCs gebruikt voor intracardiac injectie in SAMP muizen lokaliseren naar de dunne darm, dat de site van ontsteking in het SAMP-muizen is. In de intestinale ontsteking-vrije AKR muizen, slechts een minderheid van hMSCs gelokaliseerd aan de darmen 24u na injectie, hetgeen impliceert dat, bij gebrek aan ontsteking, blijven hMSCs niet in de darm. Deze gegevens zijn in overeenstemming met meerdere andere studies die hebben aangetoond dat het vermogen van de MSCs migreren en engraft op de site van de schade, zoals het hart in acuut myocardinfarct22 en de gewonde BM in een straling-gewond been16. Net als in andere ziekten, is de lokale toepassing van MSCs tot Colon schade modellen gebleken werkzaamheid op de verbetering van de ontsteking23. In een 2,4,6-trinitrobonzene sulfonzuur (TNBS) model van colitis bij ratten versnelde Hayashi et al. BM afkomstige MSCs geïnjecteerd in de submucosa van het colon rat, rondom het gebied blootgesteld aan TNBS, en aangetoond genezing van de colitis23 .
Een recente studie van Manieri et al. een nieuwe techniek van endoscoop-bijgewoonde injectie van Colon MSCs gebruikt in de distale dikke darm, de site van Colon schade, en met de prostaglandine-deficiënte muizen en toonde hun effectiviteit bij het voorkomen van de vorming van indringende zweren5. SAMP is een model uit kleine-darmontstekingen, en ontwikkelen deze muizen geen spontane ontstekingen in hun dikke darm. Ons laboratorium is ontwikkeld en gevalideerd een Endoscopische methode voor de beoordeling en de kwantificering van Colon ontsteking en tumor ontwikkeling in muizen. Endoscopische apparaten zijn echter niet kunnen bereiken van de dunne darm in een levende muis24. Het scoresysteem kan alleen worden gebruikt als terminal methode voor de beoordeling van de ontsteking in de SAMP muizen na euthanasie. De Endoscopische methode is daarom niet geschikt voor de lokale toepassing voor MSCs in het SAMP-model. Met behulp van deze nieuwe techniek van injectie, kan verbeterde lokalisatie van MSCs aan de dunne darm worden bereikt. Of de verhoogde localization voor de ontstoken dunne darm in grotere werkzaamheid vertalen zal is niet bekend en zal de focus van toekomstige studies. Naast het SAMP-model zou de echografie-geleide injectie van MSCs een handige methode voor de verbeterde lokalisatie van hMSCs in andere modellen van kleine darmontstekingen, zoals het TNFΔRE6 lymfkliertest model van experimentele CD.
BLI is een gevoelige en handige techniek die serieel kan worden gebruikt voor het bijhouden van hMSCs in vivo, maar het niet mogelijk is om de precieze kwantificering van hMSC homing. Een voordeel van het gebruik van de triple verslaggever-getransduceerde hMSCs in muizen is dat de ttk enzym in de triple verslaggever voor meer kwantitatieve positron emissie tomografie (PET zorgt)19imaging. Zeer kwantitatieve PET imaging (met een radiotracer-sonde) combineren met een computertomografie (CT) scan (mits lokalisatie) zorgt voor een kwantitatieve schatting van het aantal werk hMSCs op de zieke site, zoals de gamma graven in verhouding staan tot de nummer van de haalbare hMSCs aangeduid met het ttk-gen. Precieze kwantificering van hMSC lokalisatie zal kan helpen om te bepalen van het percentage hMSCs homing en therapeutische werking en de focus van toekomstige studies.
Deze techniek, ondanks de vele voordelen, kent een aantal beperkingen: i) het vereiste van een dure cardiale echografie imaging systeem voor muizen, ii) de mortaliteit en morbiditeit geassocieerd met intracardiac injectie, en iii) het onvermogen om te worden gebruikt voor de trage infusie (dat wil zeggen,m > uur) van cellen en andere moleculen. Ondanks deze beperkingen heeft vele voordelen boven de huidige techniek van halsslagader catheterisatie voor de intra-arteriële injectie van hMSCs, zoals hierboven.
Kortom, tonen de resultaten van deze studie de effectiviteit en het gemak van de injectietechniek met echografie-geleide, ter verbetering van de lokalisatie van de hMSCs op de site van ontsteking in het SAMP-model van experimentele CD. Toekomstige studies zal bepalen als de verhoogde homing van hMSCs door intra-arteriële levering tot hogere therapeutische werkzaamheid in modellen van kleine-darmontstekingen leiden kan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Maneesh Dave wordt ondersteund door het ministerie van defensie grant PR141774 en de ziekte van Crohn en Colitis Foundation of America carrière ontwikkeling Award. Het laboratorium van Fabio Cominelli wordt ondersteund door de NIH grants DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) en DK07948 (FC). Het laboratorium van Arnold Caplan wordt gedeeltelijk ondersteund door de L. David en E. Virginia Boudewijn Stichting. De financieringsinstanties had geen rol in de analyse van de studie of het schrijven van het manuscript. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
