Summary
Murino in modelli di infiammazione colica hanno dimostrato che una piccola percentuale (1-5%) di cellule staminali mesenchimali (MSC) iniettato per via endovenosa o intraperitonealmente ospita il colon infiammato1,2. Questo studio indica che le iniezioni intracardiache ultrasuono-guida di MSCs provocare maggiore localizzazione all'intestino.
Abstract
Morbo di Crohn (CD) è una comune malattia infiammatoria cronica del piccolo e grande intestino. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) murine ed umane hanno potenziale immunosopressivo e sono state indicate per sopprimere l'infiammazione in modelli murini di infiammazione intestinale, anche se la via di somministrazione può limitare loro homing ed efficacia 1 , 3 , 4 , 5. l'applicazione locale di MSCs per modelli di lesione colica ha mostrato una maggiore efficacia al miglioramento dell'infiammazione del colon. Tuttavia, c'è scarsità di dati sulle tecniche per migliorare la localizzazione di MSCs derivate da midollo osseo umano (hMSCs) all'intestino tenue, il sito di infiammazione nel modello SAMP-1/YitFc (SAMP) del morbo di Crohn sperimentale. Questo lavoro descrive una nuova tecnica per l'iniezione intracardiaco ultrasuono-guida di hMSCs in topi SAMP, un modello ben caratterizzato spontaneo di infiammazione intestinale cronica. Sesso ed età-abbinato, senza infiammazione AKR/J (AKR) topi sono stati usati come controlli. Per analizzare la biodistribuzione e la localizzazione, hMSCs erano trasdotte con un lentivirus contenente un reporter triplo. Il reporter triplo consisteva di luciferasi di lucciola (fl), per l'imaging bioluminescenti; proteina fluorescente rossa monomerica (mrfp), per l'ordinamento delle cellule; e troncato herpes simplex virus timidina chinasi (ttk), per l'imaging di tomografia a emissione di positroni (PET). I risultati di questo studio mostrano che 24 h dopo la somministrazione intracardiaca, hMSCs localizzare nell'intestino tenue dei topi SAMP al contrario di topi AKR senza infiammazione. Questo romanzo, iniezione ultrasuono-guida di hMSCs nel ventricolo sinistro dei topi SAMP garantisce un alto tasso di successo di consegna cella, consentendo il rapido recupero dei topi con la mortalità e la morbosità minima. Questa tecnica potrebbe essere un metodo utile per la localizzazione avanzata delle MSC in altri modelli di infiammazione piccolo-intestinale, quali TNFΔRE6. Gli studi futuri determinerà se la maggiore localizzazione di hMSCs di consegna intra-arteriosa può portare a una maggiore efficacia terapeutica.
Introduction
Morbo di Crohn (CD) è una comune malattia infiammatoria cronica del piccolo e grande intestino ed è pensato per derivare da un'inadeguata risposta del sistema immunitario dell'ospite a microbi intestinali7,8. Recenti studi hanno dimostrato che cellule staminali mesenchimali (MSCs) sia murine ed umane possono sopprimere l'infiammazione in modelli murini di infiammazione intestinale1,3,4,5. Non ci sono più studi clinici in corso che utilizzano MSCs umane derivate da midollo osseo o tessuto adiposo per il trattamento di pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), che include CD9. Due percorsi per la terapia di MSC sono stati utilizzati in questi studi clinici: uno riguarda l'infusione sistemica (cioè, per via endovenosa) di MSCs per IBD luminal (incluso CD) e l'altro prevede l'applicazione localizzata/iniezione di cellule staminali in fistola tratto di pazienti con CD perianale. In una recente meta-analisi della terapia MSC per IBD, sistemico (cioè, per via endovenosa) terapia MSC per IBD luminal (incluso CD) era efficace in fino a 40% (IC 95%: 7-79%) dei pazienti, mentre l'efficacia era molto più alto, al 61% (95% CI: 36-85%), quando MSCs sono stati iniettati localmente nel malato CD fistola9. Uno studio multicentrico di fase recente III randomizzato controllato verso placebo di cellule staminali allogeniche adipose iniettato direttamente nella fistola perianale di CD pazienti hanno mostrato statisticamente significativa prova clinica e radiologica delle fistole perianali, guarigione, che confermano i risultati delle meta-analisi10. Le ragioni per la bassa efficacia della terapia MSC data per via endovenosa per CD luminal è stato adeguatamente studiato, ma uno dei motivi potrebbe essere l'homing inadeguata delle MSCs al sito di infiammazione. Murino in modelli di infiammazione colica hanno dimostrato che solo una piccola percentuale di cellule staminali mesenchimali (1-5%) iniettato per via endovenosa raggiungono il colon infiammato; MSCs rimanenti vengono filtrati dai polmoni (effetto di primo passaggio)1,2 ,5,11,12. Più studi di ricerca murino quindi usato la via intraperitoneale (i.p.) per la somministrazione di MSC in modelli animali di colite4. Tuttavia, essi hanno anche dimostrato che solo una piccola frazione delle cellule di raggiungere e attecchire il colon e che l'efficacia è collegata alla secrezione di fattori paracrini solubili, come proteina di fattore di necrosi tumorale-inducible gene 6 (TSG-6)2. Il meccanismo MSC di immunosoppressione e guarigione comporta un approccio multipronged che coinvolge paracrina; fattori di prossimità-indipendente delle cellule, come STG-6; e fattori di prossimità-dipendente, cellulare come programmato la morte-legante 1 (PD-L1); o Jagged 1. Localizzazione di MSC al sito di infiammazione può pertanto efficacia aumentata9,13. Infatti, un recente studio ha mostrato che MSCs impiantati direttamente presso il sito della lesione colica provocato la guarigione secernendo promuovere l'angiogenesi endoteliali fattore di crescita vascolare (VEGF). D'altra parte, un effetto di guarigione minimo è stato notato dopo iniezione endovenosa5. Per aumentare la loro localizzazione al sito di infiammazione (cioè, il piccolo intestino in topi SAMP), è stata sviluppata questa tecnica di iniezione intracardiaca ultrasuono-guida per l'amministrazione di MSC nel ventricolo sinistro. Immagine-guida iniezione assicura un'iniezione precisa, che conduce ad un più alto tasso di successo e diminuita morbilità e mortalità. Inoltre, l'iniezione di cellule staminali mesenchimali nel ventricolo di sinistra li recapita alla circolazione arteriosa, dove si possono raggiungere il piccolo intestino infiammato prima di diventare intrappolati nei polmoni.
In questo studio, MSCs derivate da midollo osseo umano (hMSCs) sono stati usati per l'iniezione nel modello murino di SAMP-1/YitFc (SAMP) di CD14. SAMP è un modello murino spontaneo ben caratterizzato di infiammazione cronica che si sviluppa l'infiammazione di piccolo intestino con quasi 100% penetranza14. L'infiammazione si sviluppa in risposta alla microflora in assenza di qualsiasi manipolazione chimica, immunologici o genetici e umana CD11è molto simile. Pari età e del sesso senza infiammazione AKR/J (AKR) topi, topi di controllo parentale di SAMP, sono stati usati in questo studio.
Il hMSCs sono stati isolati e ampliato in laboratorio da campioni di midollo osseo (BM) ottenuti da donatori normali, non identificati dopo consenso informato utilizzando validati e pubblicati in precedenza protocolli15,16. Dopo isolamento ed espansione, la capacità MSC in osteogenica, adipogenico, differenziazione chondrogenic è stata valutata in laboratorio da più saggi15. L'analisi funzionale osteogenico è stato effettuato impiantando cubi in ceramica di idrossiapatite/tricalcio fosfato matrice contenente hMSCs sottocute in immunocompromised di topi SCID CB17-Prkdc17. Il dosaggio di cubo dimostra osteogenesi e Condrogenesi potenziali ed è considerato la prova definitiva per la valutazione individuale MSC preparazioni17. Per visualizzare hMSCs in vivo dopo l'iniezione, è stato utilizzato lentivirus trasduce hMSCs con costruzione di gene reporter triple che consiste di luciferasi di lucciola (fl), la proteina fluorescente rossa monomerica (mRFP) e chinasi della timidina virale di simplex di erpete (ttk ), guidato da un modificate myeloproliferative sarcoma virus (mnd) promotore18. La luciferasi di lucciola al reporter triple sono un enzima che luciferina iniettato copritrici a ossiluciferina in hMSCs e produce luce fotoni/bianco. Questo è rilevato dalla telecamera sensibile charge coupled device (CCD) (bioluminescenza) in un in vivo optical imaging sistema, consentendo la visualizzazione di live hMSCs in topi. Bioluminescenza imaging (BLI) è una tecnica sensibile che può essere utilizzata in serie per tenere traccia delle cellule e per l'analisi ex vivo . L'uso di un promotore forte mnd spinge l'espressione continua della costruzione di gene reporter triple fusion e consente l'imaging delle hMSCs iniettato per più di 16 settimane19. Il hMSCs sono difficili da trasdurre e hanno un'efficienza di trasduzione basso. Utilizzando un protocollo ottimizzato, è stata migliorata l'efficienza di trasduzione hMSCs e l'espressione del transgene è stata rafforzata18. Utilizzando mRFP espressione (uno dei geni reporter triple) in citometria a flusso, è stata dimostrata la capacità di trasdurre hMSCs con un'alta efficienza di fino a 83%. In vivo cubo dosaggi e saggi di differenziazione ha dimostrato la capacità di differenziarsi in condrociti, adipociti e osteociti17il hMSCs trasdotte.
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Protocol
tutti i topi esperimenti e procedure nello studio sono state approvate dalla Case Western Reserve University ' s istituzionale Animal Care e Comitato di uso. Le procedure sono state condotte in collaborazione per la valutazione e accreditamento di cura degli animali di laboratorio (AAALAC) accreditato presso la struttura. Il BM è stato aspirato nell'ambito di un protocollo approvato Università ospedali Institutional Review Board presso l'impianto di nucleo delle cellule staminali presso Case Western Reserve University dopo consenso informato.
1. cultura e trasduzione del midollo osseo umano-derivato di cellule staminali mesenchimali (hMSCs)
Nota: l'isolamento delle hMSCs è descritto in dettaglio in precedenti pubblicazioni 15 , 20.
- Cultura isolato hMSCs in Dulbecco ' medium di glucosio (DMEM-LG) s per volta Eagle medio-bassa supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS). Le cellule a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2 in T175 boccette con 25 mL di terreno di crescita della coltura. Sostituire il mezzo ogni 3-4 giorni. Il giorno 14, eseguire il passaggio primario delle hMSCs.
- Quando le cellule raggiunge 80% confluenza, rimuovere completamente il vecchio mezzo e lavare delicatamente le cellule con 5 mL di soluzione fisiologica sterile tampone fosfato (PBS; per matracci di cultura del tessuto-75cm).
- Rimuovere il PBS dalla beuta e aggiungere 4 mL di acido di 0,25% tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA). Posto il pallone indietro nell'incubatore a 37 ° C per 5-10 minuti mantenere il tempo di esposizione più breve possibile.
- Quando la maggior parte delle cellule è diventati ben arrotondata o staccato dalla piastra di coltura, arrestare la reazione aggiungendo un volume di siero di vitello pari alla metà del volume di tripsina.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta per centrifuga dimensioni del caso. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti e poi rimuovere con attenzione il sovranatante.
- Risospendere le cellule in 5 mL di terreno (DMEM-LG + 10% FBS) e contare le celle con un emocitometro.
Nota: A questo punto, le cellule possono essere una subcoltura o trasdotte con tripla reporter.
- Eseguire la trasduzione delle hMSCs con tripla reporter.
- Seme 1.5 x 10 6 cellule nel una T175 boccetta. Coltura le cellule in 25 mL di medium di crescita a 37 ° C, 95%, umidità e 5% CO 2. Attendere 24 ore per le cellule di allegare.
- Fare un virus cocktail in provette da 15 mL, come descritto nel riferimento 18.
Bagno
- lentivirus di disgelo a 37 ° C in acqua. Aggiungere 160 µ l di una soluzione di solfato di proteamine 5 mg/mL in Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) a 8 mL di terreno di coltura (DMEM-LG + 10% FBS) per una concentrazione finale di 100 µ g/mL. Vortexare per 3 s. Aggiungi una molteplicità di virus dell'infezione (MOI) di 5 (1a volta scongelato) .
- Rimuovere il mezzo nel matraccio di cultura cellulare (punto 1.2.1) e aggiungere il cocktail di virus alle cellule. Incubare per 10 h a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2.
- Aggiungere 4 mL di solfato di proteamine 100 µ g/mL in 4 mL di DMEM-LG + 10% FBS e incubare per un ulteriore 14 h.
- Interrompere la trasduzione dopo 24 h sostituendo con 25 mL di medium (DMEM-LG + 10% FBS).
- Conferma efficienza di trasduzione valutando mRFP espressione di flusso cytometry 18.
Nota: Qui, hMSCs che erano trasdotte con oltre il 65% sono stati usati efficienza. - Espandere le cellule sostituendo con 25 mL di terreno nuovo (DMEM-LG + 10% FBS) due volte a settimana. Coltura le cellule a 37 ° C, 95%, umidità e 5% CO 2. Cellule del passaggio dopo raggiungono la confluenza di 80%.
- Una volta raggiunto il numero di celle desiderato, eseguire trypsinization per fasi 1.1.2 - 1.1.4.
- Contare le celle e sospenderle in PBS sterile (1x) della concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule/75 µ l. mantenere le cellule sul ghiaccio per il trasporto alla macchina ad ultrasuoni. Per esperimenti, utilizzare hMSCs dai numeri di passaggio 2-5.
2. Ultrasuono-guida iniezione intracardiaca di hMSCs nel ventricolo di sinistra
Nota: uso SAMP1/YitFc con topi piccolo-intestinale stabiliti della AKR/J di infiammazione e genere-abbinato e di età per gli esperimenti. Mantenere i topi SAMP e AKR esenti da patogeni in specifiche condizioni, dar loro da mangiare cibo del laboratorio standard e tenerli su cicli di luce/buio di 12 h. Qui, le iniezioni cardiache ultrasuono-guida sono state effettuate in una sala dedicata ecografia cardiaca esenti da patogeni che si trova nella struttura di ricerca animale CWRU che era disinfettata con un disinfettante e risciacquata con alcool al 70%. Personale di ricerca del laboratorio devono indossare indumenti protettivi, inclusi abiti, maschere per il viso con occhio scudi e guanti sterili durante le iniezioni intracardiache. Il calore del corpo del mouse deve essere mantenuto per tutta la durata della procedura.
- Ha istituito il sistema di imaging prima anestetizzando il mouse a ultrasuoni. Per questo protocollo, è necessario utilizzare la macchina di ultrasuono progettata per ecocardiogramma del mouse.
- Accendere il potere e inizializzare il trasduttore (30 MHz) per impostare il nuovo studio.
- Anestetizzare il mouse in una camera di induzione utilizzando 3-4% isoflurane in ossigeno 100% ad una velocità di 0,2 - 0,5 L/min. mantenere l'animale per l'intera procedura con isoflurano 2% a 100% ossigeno tramite un cono di naso. Confermare amputate corretto prima di eseguire la formazione immagine pizzicando la punta, rotolamento il mouse e osservando l'assenza di movimento.
Nota: Unguento oftalmico deve essere applicato agli occhi dopo l'induzione dell'anestesia per evitare l'essiccazione corneale. Trasferire i topi anestetizzati per le macchine di formazione immagine (cioè, sistema di imaging bioluminescenza ed ecografia), dove riceveranno una dose di mantenimento di anestetica isoflurane. Determinare l'anestesia ora di inizio e la profondità dell'anestesia osservando una mancanza di reazione a pizzichi sulla coda e piedi pad ogni 10 min per tutta la durata dell'anestesia. - Impostare la temperatura del gel di ultrasuono e tabella imaging a 37 ° C.
- Rimuovere completamente la pelliccia sopra la zona del torace del mouse anestetizzato usando la crema depilatoria.
- Posizionare il mouse sul tavolo imaging in posizione supina e sicuro sia degli arti superiori e inferiori con nastro adesivo per evitare il movimento del corpo durante la procedura. Utilizzare un monitor di elettrocardiogramma durante la procedura per tutti i topi.
- Pulire la pelle della zona torace usando un tampone di iodio di povidone 10% seguito da un tampone di etanolo 70%. Applicare uno spesso strato di gel per la zona del torace del mouse.
- Montare il trasduttore nel supporto e regolare la sua posizione fino a quando il ventricolo sinistro è chiaramente visibile il campo visivo.
- Carico 150 µ l della sospensione di cellule trasdotte hMSC (2 x 10 6 hMSCs in 150 µ l di PBS sterile) in una siringa da 1 mL con un 28-G dell'ago e fissare la siringa di supporto adeguato. Per visualizzare il pulsante sangue, mantenere una colonna d'aria nella siringa. Per evitare grumi, sospendere le cellule prima dell'iniezione.
- Avanzare la siringa verso il torace del mouse, regolare la traiettoria dell'ago utilizzando la guida ecografica e immettere il ventricolo sinistro.
- Seguendo la Guida di formazione immagine di ultrasuono, penetrare l'ago della siringa attraverso lo spazio intercostale e nel ventricolo di sinistra del mouse.
Nota: La punta dell'ago della siringa deve essere chiaramente visibile nel ventricolo sinistro sull'immagine ultrasonographic. Posizionamento corretto dovrebbe essere ulteriormente confermato dal deflusso di sangue arterioso fresco nella siringa. Questi sono segni di un esito positivo inserimento. - Iniettare la sospensione cellulare hMSC molto lentamente in 2 minuti, l'applicazione pre dolcessure.
- Dopo l'iniezione di cellule sospese, delicatamente ritirare l'ago, pulire il gel per ultrasuoni e rilasciare il mouse dai vincoli nastro.
- Metti l'animale in una gabbia nuova, pulita con un pad preriscaldato.
Nota: Dopo il completamento della procedura, un ambiente caldo dovrebbe essere fornito ai topi fino al recupero. Sovra-riscaldamento dovrebbe essere evitato, poiché vasodilatazione periferica compromette il recupero. I topi dovrebbero essere strettamente monitorati e mantenuti isolati da altri topi fino al loro completo recupero, indicato dalla loro capacità di mantenere decubito sternale. - Monitorare l'animale fino al raggiungimento di completo recupero dall'anestesia e tutti i giorni fino alla fine dell'esperimento.
3. Imaging di bioluminescenza (BLI) di hMSCs
- immagine topi 24 h dopo l'iniezione intracardiaca nella bioluminescenza sistema di imaging. Avviare lo in vivo imaging software. Inizializzare il sistema di imaging e aprire un nuovo studio.
- Nel pannello di controllo, impostare i parametri di imaging facendo " sequenza setup. " In modalità di imaging, selezionare " luminescenza " e " fotografia. " impostare i tempi di esposizione da 0,5 s per 10 min. impostare il binning " medio " e la F / stop a " 1. " impostare il filtro di eccitazione " blocco " e il filtro di emissione a " Apri. " impostato il campo visivo " C " per due topi. Aggiungere il programma di installazione di sequenza guidata immagine facendo clic su pannello di controllo di acquisizione.
- Accendere la pompa di ossigeno e impostare l'isoflurano al 2,5% nella camera di induzione e il cono di naso all'interno della macchina.
- Iniettare il mouse i.p. con 300 µ l di D-luciferina (12,5 mg/mL).
- Posizionare il mouse nella camera di induzione di anestesia.
- Dopo 2-3 min, trasferire il mouse lo in vivo imaging camera, con la sua testa nel cono di naso sul collettore di anestesia. Applicare l'unguento ottico per proteggere gli occhi durante la formazione immagine. Per realizzare l'immagine più mouse, utilizzare deflettore luce nera per impedire la riflessione della luce sui topi adiacenti.
- Scegliere la " acquisire " pulsante per avviare l'acquisizione di immagini 10 min dopo l'iniezione di D-luciferina.
- Ripetere i passaggi da 3,3-3,5 per realizzare l'immagine più topi.
- Dopo l'in vivo acquisizione dell'immagine, eutanasia i topi da inalazione di CO 2 seguita da dislocazione cervicale, per confermare la morte. Eseguire l'analisi ex vivo.
- Se viene eseguita l'analisi ex vivo dopo 20 min, ripetere l'iniezione di luciferina (punto 3.3) prima di sacrificare i topi; il segnale BLI può diminuire 20 min dopo l'iniezione di luciferina.
- Sezionare i topi per rimuovere tutto il tratto gastrointestinale (cioè, dallo stomaco al retto), linfonodo mesenterico (MLN), polmoni, milza e fegato. Metterli in capsule di Petri con pinze e le forbici 2 , 4.
- Porre la capsula di petri contenente gli organi espiantati nella camera di imaging e di acquisire immagini BLI per passaggi 3.1-3.6.
- Dopo l'acquisizione di immagini, trasferire gli organi espiantati per stampi di campione contenente composti di temperatura di taglio ottimale (OCT). Per congelatore gli stampi a-80 ° C utilizzando ghiaccio secco. Eseguire immunoistochimica utilizzando anticorpi anti-luciferasi sulle sezioni congelate per confermare la presenza di hMSCs 16.
- Per la quantificazione dell'intensità della luce, utilizzare l'area di strumento di interesse (ROI) a strumento tavolozza 16 , 19. Selezionate la cornice ROI e spostarlo in regione di interesse sull'immagine. Fare clic su " misurazione del ROI " e salvare i dati nel formato di file SEQ. Esportare i dati come un file. txt e utilizzare software statistico per eseguire prove di statistiche base per quantificazione 16.
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Representative Results
La figura 1 Mostra che hMSCs può essere trasdotte con il reporter triplo ad alta efficienza, preservando la loro proprietà di cellule staminali. Trasdotte hMSCs possono essere visualizzate in tempo reale da BLI (Figura 1, Figura 3). Questo romanzo, iniezione ultrasuono-guida di hMSCs ventricolo sinistro dei topi SAMP garantisce un tasso di successo molto alta dell'iniezione, consentendo il rapido recupero dei topi con minima morbilità e mortalità (Figura 2). Il tempo medio per l'iniezione di un mouse con hMSCs è circa 10 min, e meno di 8-9% morbosità e la mortalità sono stati osservati con questa tecnica. La ragione principale per la mortalità è tratto e la tamponatura cardiaca da effusione pericardica emorragica. L'analisi ex vivo eseguita 24 h dopo la somministrazione intracardiaca (intra-arteriosa) di hMSC conferma che questa rotta di risultati di amministrazione nell'homing delle hMSCs al piccolo intestino infiammato di topi SAMP, al contrario di infiammazione-libero topi (Figura 3 e D) di controllo. Inoltre, hMSCs tendono a non rimanere nell'intestino tenue dei topi AKR senza infiammazione e iniziare ad accumulare o rimanere intrappolati nei polmoni (Figura 3B).
Figura 1 . hMSCs può essere trasdotte con un'ad alta efficienza per la visualizzazione In Vivo e con la conservazione di cellule staminali proprietà. (A) immagine microscopica di hMSCs trasdotte. Trasduzione del successo delle MSC umane, come determinato da mRFP espressione valutata con citometria a flusso BLI (C)e (B) . Trasdotte hMSCs mantengono le proprietà delle cellule staminali, come confermato dalle analisi di differenziazione che dimostrano la capacità di differenziarsi in condrociti, adipociti e osteoblasti hMSCs trasdotte. Per un'analisi funzionale, i cubetti di ceramica di idrossiapatite/tricalcio fosfato matrice sono stati impiantati sottocute in topi SCID CB17-Prkdc immunocompromessi per dimostrare la capacità di hMSCs di formare osso ectopico donatore (D). Scala bar nell'A = 500 µm. barre della scala in C indicano unità di BLI (103 fotoni/s/cm2/steradian). Scala bar in D = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Strumenti per l'iniezione ecoguidato. (A) una vista panoramica degli strumenti: ecografia cardiaca sistema (Piazza rossa), trasduttore montato in un apposito supporto, titolare di siringa e tavolo chirurgico con punta conica per la macchina di anestesia di anestesia (quadrato verde) e l'inalazione di imaging con camera di induzione (quadrato giallo). (B) immagine Ultrasonographic dell'ago della siringa: la punta dell'ago (freccia rossa) è chiaramente visibile all'interno del ventricolo sinistro (frecce gialle). (C) il deflusso di sangue arterioso fresco nella siringa conferma l'esito positivo inserimento dell'ago della siringa nel ventricolo di sinistra prima della somministrazione di hMSC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . hMSCs Localize al piccolo intestino dopo somministrazione Intracardiac/Intra-arterial in topi SAMP. Immagini rappresentative dei topi/gruppo di 3-4, eutanasizzati 24 h dopo l'iniezione e da tre esperimenti indipendenti sono mostrati. In vivo imaging bioluminescenza dimostra la presenza di hMSCs in SAMP e AKR topi 24 h dopo l'iniezione (A). Ex vivo l'analisi nei topi di SAMP dimostra che hMSCs si localizzano preferenzialmente il piccolo intestino (cioè, il sito di infiammazione) (D), considerando che essi tendono a non rimanere nell'intestino tenue di controllo privo di infiammazione AKR topi (C). In realtà, dopo il primo passaggio arterioso, hMSCs iniziare ad accumulare più nei polmoni dei topi AKR, al contrario di topi SAMP (B). Una frazione di hMSCs possa essere individuata anche nella milza, fegato e polmoni di topi SAMP e AKR (B, C, D). Le barre di scala indicano unità di BLI (103 fotoni/s/cm2/steradian). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo studio descrive una nuova tecnica per l'iniezione intracardiaco ultrasuono-guida di hMSCs in un modello murino di piccolo intestino di CD sperimentale. Questa tecnica è molto alto tasso di sopravvivenza e di successo, come la traiettoria dell'ago può essere regolata in base in tempo reale immagini ad alta risoluzione del ventricolo sinistro del mouse, fornito dall'ecografia. Il vantaggio di consegna per il ventricolo sinistro è che hMSCs vengono poi distribuiti intra-arterialmente e bypassare la circolazione venosa, evitando così l'aggregazione delle cellule nei polmoni. In precedenza, cateterizzazione dell'arteria carotica per consegna intra-arteriosa è stata usata per iniettare MSCs16,21. Il metodo di cateterizzazione carotidea comporta un intervento chirurgico per esporre la carotide al fine di posizionare un catetere all'interno dell'arteria. Il catetere viene fatto avanzare verso l'arco aortico per la trasfusione delle cellule. Successivamente viene rimosso il catetere e l'arteria carotica legata. Questa tecnica novella per l'iniezione di cellule staminali mesenchimali nel ventricolo sinistro, rispetto alla cateterizzazione dell'arteria carotica, ultrasuono-guida è meno invasiva, è molto più veloce (circa 10 min/mouse contro 60 min/mouse) e ha meno morbosità e mortalità (< 10% rispetto al 30%). La traslazione clinica l'iniezione intracardiaco ultrasuono-guida del mouse di hMSCs per test clinici umani sarebbe attraverso il cateterismo dell'arteria mesenterica superiore (attualmente effettuato per il trattamento di ischemia mesenterica cronica e spurgo gastrointestinale insolubile) per consegnare hMSCs al piccolo intestino malato.
Ci sono diverse considerazioni per quanto riguarda le modifiche e la risoluzione dei problemi dell'iniezione intracardiaco ultrasuono-guida di hMSCs nel ventricolo sinistro dei topi. Un aspetto critico della procedura è padroneggiare l'uso degli ultrasuoni per guidare l'ago per iniezione nel ventricolo di sinistra. Come qualsiasi procedura, un'adeguata formazione, pratica e feedback esperto sono componenti importanti per eseguire correttamente questa procedura. Scarsa tecnica può portare alla tamponatura cardiaca da effusione pericardica emorragica e alla morte. Per minimizzare l'agglutinamento delle cellule e il rischio di embolizzazione al cervello (cioè, colpo), è essenziale per risospendere il hMSCs prima di ogni iniezione. Prima di implementare questa procedura, è importante consultare il veterinario responsabile del centro di ricerca animale locale per ricevere consulenza. Assicurarsi che le linee guida per l'uso sicuro ed efficace degli animali sono seguite per minimizzare il danno accidentale ai topi.
Per esaminare la biodistribuzione di hMSCs dopo l'iniezione nei topi, hMSCs erano con successo trasdotte con tripla reporter, con alta efficienza. Analisi di differenziazione eseguite hanno dimostrato la capacità di differenziarsi in condrociti, adipociti e osteociti18hMSCs trasdotte. Per l'analisi funzionale osteogenica, i cubetti di ceramica di idrossiapatite/tricalcio fosfato matrice sono stati impiantati sottocute in topi SCID immunocompromessi e dimostrato la capacità di hMSCs per formare donatore ectopica dell'osso17,18 . Questi differenziazione e saggi funzionali dimostrano che trasdotte hMSCs mantengono le proprietà delle cellule staminali. I risultati di questo studio mostrano che trasdotte hMSCs utilizzato per iniezione intracardiaca in topi SAMP localizzare all'intestino tenue, che è il sito di infiammazione nei topi SAMP. Negli intestinale infiammazione-AKR topi senza, solo una minoranza di hMSCs localizzate agli intestini 24 h dopo l'iniezione, che implica che, in assenza di infiammazione, hMSCs non rimangono nell'intestino. I dati sono in concordanza con diversi altri studi che hanno dimostrato la capacità delle MSC di migrare e attecchire presso il sito della ferita, come il cuore nell'infarto miocardico acuto22 e la BM ferito a una gamba ferita di radiazione16. Come in altre malattie, l'applicazione locale di MSCs per modelli di lesione colica ha mostrato efficacia al miglioramento dell'infiammazione23. In un modello di acido solfonico (TNBS) 2, 4,6-trinitrobonzene di colite in ratti, Hayashi et al. iniettato MSCs BM-derivato della sottomucosa del colon del ratto, che circondano l'area esposta al TNBS e dimostrato accelerato la guarigione della colite23 .
Un recente studio di Manieri et al utilizzato una tecnica novella di iniezione endoscopio-aiutata di colica MSCs nel colon distale, il sito della lesione colica, in topi carenti di prostaglandina e ha mostrato la loro efficacia nel prevenire la formazione di penetrante ulcere5. SAMP è un modello di infiammazione del piccolo intestino, e questi topi non sviluppano infiammazione spontanea nei loro due punti. Il nostro laboratorio ha sviluppato e convalidato un metodo endoscopico per la valutazione e quantificazione di infiammazione colica e lo sviluppo del tumore nei topi. Tuttavia, i dispositivi endoscopici non sono in grado di raggiungere l'intestino tenue in un topo vivo24. Il sistema di punteggio è utilizzabile solo come terminale metodo per la valutazione dell'infiammazione nei topi SAMP dopo l'eutanasia. Di conseguenza, il metodo endoscopico non è adatto per l'applicazione locale di MSCs nel modello SAMP. Utilizzando questa nuova tecnica di iniezione, è possibile localizzazione avanzata di MSCs al piccolo intestino. Se la localizzazione aumentata al piccolo intestino infiammato si tradurrà in una maggiore efficacia non è noto e sarà al centro di studi futuri. Oltre al modello SAMP, l'iniezione di cellule staminali mesenchimali ultrasuono-guida sarebbe un metodo utile per la localizzazione avanzata delle hMSCs in altri modelli di piccola infiammazione intestinale, quali il modello murino di6 TNFΔRE di CD sperimentale.
BLI è un sensibile e conveniente tecnica che può essere utilizzato in serie per tenere traccia hMSCs in vivo, ma non consente la quantificazione precisa di hMSC homing. Un vantaggio di utilizzare la tripla hMSCs trasdotte reporter in topi è che l'enzima ttk al reporter triple permette più quantitativa tomografia ad emissione (PET) imaging19. Combinando altamente quantitativa imaging PET (con una sonda del radiotraccitore) con un'esplorazione di tomografia computata (CT) (fornendo localizzazione) consente una stima quantitativa del numero di engrafted hMSCs presso il sito di malati, come i conteggi di gamma sono proporzionali al numero dei hMSCs praticabile etichettati con il gene ttk. Esatta quantificazione della hMSC localizzazione può contribuire a determinare la percentuale di hMSCs homing ed efficacia terapeutica e sarà al centro di studi futuri.
Questa tecnica, nonostante i suoi molti vantaggi, ha alcune limitazioni: i) il requisito per un'ecografia cardiaca costoso imaging sistema per topi, ii) la mortalità e la morbosità connessa con iniezione intracardiaca e iii) l'impossibilità di essere utilizzato per la infusione lenta (cioè,m > oltre ore) di cellule e di altre molecole. Nonostante queste limitazioni, ha molti vantaggi sopra l'attuale tecnica di cateterizzazione dell'arteria carotica per l'iniezione intra-arteriosa di hMSCs, come evidenziato sopra.
In conclusione, i risultati di questo studio dimostrano l'efficacia e la convenienza della tecnica di iniezione ultrasuono-guida per migliorare la localizzazione di hMSCs al sito di infiammazione nel modello SAMP di CD sperimentale. Gli studi futuri determinerà se l'homing aumentata delle hMSCs di consegna intra-arteriosa può portare a una maggiore efficacia terapeutica in modelli di infiammazione del piccolo intestino.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Maneesh Dave è supportato dal dipartimento della difesa grant PR141774 e il Crohn e la colite Foundation di America Career Development Award. Il laboratorio di Fabio Cominelli è supportato da NIH concede DK042191 (F.C.), DK055812 (F.C.), DK091222 (F.C.) e DK07948 (F.C.). Il laboratorio di Arnold Caplan è sostenuto in parte da David L. ed E. Virginia Baldwin Foundation. Le agenzie di finanziamento non avevano alcun ruolo nell'analisi di studio di scrittura del manoscritto. Suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
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