Summary
Здесь мы описываем минимально инвазивной лапароскопической техники для последовательного отбора проб печени и брыжеечных лимфатических узлов (MLN) в макак, что позволяет увеличить частоту дискретизации, и уменьшает потенциал для хирургических осложнений, по сравнению с выполнением лапаротомии.
Abstract
В брыжеечных лимфатических узлов (MLN) и печень подвергаются воздействию микробов и микробных продуктов из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), что делает их уникальными иммунологически. Желудочно-кишечный тракт и связанные с ними МЛН сайты ранней вирусной репликации в вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ) инфекции и МЛН вероятно важные участки пласта, которые укрывают латентно инфицированные клетки даже после длительной антиретровирусной терапии (АРТ). Печени были показаны, играют важную роль в иммунной реакции на лентивирусы и, как представляется, играют важную роль в оформлении вируса из обращения. Приматы (NHP) модель для ВИЧ и синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) точно имитировать эти аспекты ВИЧ-инфекцию и последовательной продольной выборку первичных участков вирусной репликации и связанные с иммунными ответами в этой модели поможет выяснить важные события в инфекции, патогенез , а также влияние различных стратегий вмешательства на эти события. Теклор опубликованных методов образец печени и МЛН вместе включают основные операции и / или аутопсию, что ограничивает возможность исследовать эти важные сайты в последовательном режиме в том же животном. Ранее мы описали лапароскопический метод для сбора МЛН. Здесь мы описываем минимально инвазивную лапароскопическую технику для последовательной продольной выборки печени и MLN через те же двух мест портов, необходимых для сбора MLN. Использование одних и тех же двух портов сводит к минимуму воздействие на животных, так как не требуется никаких дополнительных разрезов. Эта методика может быть использована с повышенной частотой дискретизации по сравнению с основной абдоминальной хирургией и уменьшает потенциал для хирургических осложнений и связанная с ними местными и системными воспалительными реакциями, которые могли бы осложнить интерпретацию результатов. Эта процедура имеет потенциал для облегчения исследований с участием моделей NHP при одновременном повышении благосостояния животных.
Introduction
Желудочно - кишечный тракт (ЖКТ) является самой большой поверхностью слизистой оболочки тела и подвергается воздействию множества антигенов , полученных из пищи, патогенов и эндосимбиотических бактериальных сообществ , обычно упоминается как микробиом 1, 2. Брыжеечные лимфатические узлы (MLN) выравнивают желудочно-кишечный тракт и являются основным местом иммунной функции для стимулирования или воспалительные реакций толерогенных в направлении этих разнообразных антигенов. Физическая организация МЛН создает разобщенную систему , которая может реагировать на антигены локально , не вызывая системные реакции 3. Кроме того , кровь из водостоков GI тракта к печени путем воротной вены перед возвращением в оборот, и, таким образом , подвергается воздействию микробов и микробных продуктов , которые перемещал из желудочно - кишечного тракта в собственной пластинке слизистой оболочки и введенными в кровоток 4. Печени также функционирует в качестве вторичного лимфоидного органа ай имеет большое количество иммунных клеток, в том числе специализированных макрофагов, чтобы удалить микробы транслоцируется 5, 6. Таким образом, МЛН и печень являются основными иммунные органы подвергаются воздействию синантропных и патогенных бактерий из желудочно-кишечного тракта, а также среда антигенов из других источников, что делает их уникальными и важными с иммунологической точки зрения.
МЛН критические участки для оценки вирусологических и иммунологических эффектов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или патогенной обезьяний вирус иммунодефицита (SIV) инфекции, и, вероятно, участвуют в начале распространения ВИО следующего ректального вызова. Gut-ассоциированной лимфоидной ткани , как известно, является основным местом постоянной репликации ВИЧ, несмотря на эффективный контроль виремии современными антиретровирусной терапии (АРТ) 7. В SIV моделей инфекции, МЛН были показаны, являются важными резервуарами латентного вируса и могутбыть первичным резервуаром 8, 9. Печени также имеет важное значение в лентивирусов инфекции, о чем свидетельствует накопление SIV специфических CD8 + Т - клеток в печени макак во время острой инфекции SIV 10. Кроме того, она является основным органом , ответственным за очистку вируса из обращения 11.
ВИЧ и SIV - инфекции связаны с измененной GI микробиоты, нарушена целостность эпителия ЖКТ и повышение транслокации микробов и микробных продуктов из толстой кишки на периферию и обращения 12, 13. Эти процессы связаны с местной и системной активацией иммунной системы , а также повышенная заболеваемость и смертность у ВИЧ - инфицированные индивидуумов 14. В SIV - инфекции, транслоцируются бактерия была обнаружена в MLN 15, в то время как накопление микрофонаrobial продукты в печени было показано , что приводит к воспалению и повреждению органа 16. Таким образом, в контексте ВИЧ и SIV инфекций, то МЛН и печень могут быть весьма информативными для понимания воспалительных процессов, работающих на GI-резидентах бактерий.
Здесь мы представляем минимально инвазивной лапароскопической техники для последовательного отбора проб MLN и печени в отличных от человека приматов (NHPS). Показано, успешное выполнение этой методики на двух здоровых женщин макак (СУР), отбор проб каждого животного два раза, с 160 дней между каждой операцией. Мы продолжаем использовать эти образцы для оценки и сравнения ключевых лейкоцитов и лимфоцитов в популяции каждого органа с помощью проточной цитометрии, и демонстрируют весьма последовательные данные между двумя временными точками.
Protocol
Животных содержали и воспитывающихся в ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных международных (AAALACi) аккредитованных объектов, а также все процедуры на животных были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными по уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) из Университета штата Вашингтон и по Вашингтон, Национальный исследовательский центр Предстоятель.
1. Хирургическая подготовка, анестезии и анальгезии
- Седативный и индукционные
- Седативная макака с внутримышечной инъекцией 10 мг / кг кетамина и 0,015 мг / кг дексмедетомидина (в сочетании в одном шприце). Обеспечить отсутствие вывода рефлексов перед удалением из клетки.
- Интубации животного, и поддерживать животное в плоскости общей анестезии с использованием изофлурана (1,0 - 2,5%) и 100% кислорода. См ссылки для получения дополнительной информации относительно интубации и общей анестезии в макак 17,исх "> 18, 19.
- Обезболивание Поддержка и мониторинг
- Вставьте периферический венозный катетер и обеспечивают внутривенные изотонические жидкости (например, лактат Рингера раствор) со скоростью 5 мл / кг / ч в течение анестезии и хирургическое вмешательства. Применение стерильной глазной смазки, чтобы предотвратить сухость роговицы.
- Обеспечить обезболивание, например в виде композиции с замедленным высвобождением бупренорфина (0,2 мг / кг, подкожно).
Примечание: НПВС (например, мелоксики или кетопрофен), также может быть обеспечено во время анестезиологического восстановления, при условии, что экспериментальный протокол допускает введение NSAID и что животное нормотензивное и хорошо увлажненный во время анестезии. - Монитор глубины анестезии (например , челюсти тон), частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, ЭКГ, кровяное давление, пульс оксигенации, конец приливные CO 2, и температуру тела по всей анестезии и хирургического вмешательства.
Примечание: Когда живот интраназально, животное может hypoventilate.Обеспечение механической вентиляции , если частота дыхания уменьшается, или конец приливного СО 2 уровня выше 45 мм ртутного столба. - После операции, управлять Атипамезолом (0,15 мг / кг, внутримышечно) для разворота дексмедетомидина.
- Хирургическое Приготовление
- Выполните несколько клизмы теплой водой , чтобы уменьшить объем фекалий в толстой кишке , чтобы помочь визуализации и манипуляции кишечника во время процедуры 20.
- Используйте ножницы с числовым 40 лезвием для удаления волос из операционного поля. Бритье от реберного хребта до лобка и с левой стороны на правый фланг.
- Консервант подготовка операционного поля с использованием соответствующих антисептиков, такими как хлоргексидин-чередующихся спиртом или повидон-йод-спиртовыми скрабами.
- Поместите животное на операционном столе на его спинке, под углом на полпути между дорсальной и правой боковой лежачее. Свяжите руки и ноги веревкой в выдвинутом положении. Обеспечить окончательный chlorhexiобедать и алкоголь приготовительного когда животное перемещается в операционном и позиционируется для хирургии.
2. хирургия
Примечание: Для получения дополнительной информации о лапароскопии в мелких животных, см ссылка 21.
- Лапароскопическая Подготовка инструмента
- Драпируйте животное с стерильной фенестрированной драпировкой.
- С помощью нестерильного помощника, завернуть цифровую камеру с стерильной драпировкой камеры и подключите кабель к башне. Прикрепите жесткий объем к головке камеры.
- Присоедините стерильный свет кабель к жесткой рамке и подключите кабель к источнику света. Баланс белого камеры в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Закрепить стерильную инсуфлятор трубку к инсуффлятору.
- Лапароскопическая Вход
- Используя # 15 скальпель с, сделать ~ 5 мм ножевого разрез через кожу на глубину брюшной мускулатуры, приложениеroximately 1 - 2 см слева от пупка.
- Использование не доминантную руки, поднимите брюшную стенку краниальна к месту пробивающего разреза. С доминирующей рукой, поместите кончик иглы Вереша через разрез и угол кончик краниально.
Примечание: Угол проникновения иглы Вереша будет варьироваться в зависимости от состояния тела животного. Так, например, в жировой животного, игла Вереша необходимо будет вставлен почти перпендикулярно к брюшной стенке. В тонком животном, игла Вереша должна быть наклонена краниально, чтобы уменьшить риск контакта с внутренностями.- Удерживая вал (не концентратор) иглы Вереша, плотно толкать иглу, чтобы проникнуть через брюшную стенку в брюшную полость. Отчетливый «щелчок» и уменьшение сопротивления будет ощущаться как острый кончик проникает в брюшину и тупой кончик иглы пружин Вереша вперед в брюшную полость.
Примечание: Если игла проходит надлежащим образом в гое брюшной полости, будет небольшое сопротивление, когда она выдвигается и снимается 1 - 2 см.
- Удерживая вал (не концентратор) иглы Вереша, плотно толкать иглу, чтобы проникнуть через брюшную стенку в брюшную полость. Отчетливый «щелчок» и уменьшение сопротивления будет ощущаться как острый кончик проникает в брюшину и тупой кончик иглы пружин Вереша вперед в брюшную полость.
- Подключение инсуфлятор трубки СО 2 к игле и открыть запорный кран. Давление в брюшной полости не более чем на 10-12 мм рт.ст. для создания пневмоперитонеума.
Примечание: Живот достиг идеального вдувание, когда она расширилась симметрично и происходит потеря нормального резкого контура реберных краев. Давление должно обеспечить достаточное пространство для вставки канюли / троакара без риска контакта с внутренностями.
- Канюля Размещение
- После того, как живот полностью интраназален, сделать ~ 5 - 7 мм разрез с скальпелем # 15 через кожу левого краниального живота к брюшной мускулатуре ~ 2 - 4 см хвостовых до последнего ребра.
- Поместите 5 мм троакар-канюли сборку через разрез кожи и угла она ~ 45 - 60 градусов caudomedially. Проникнуть брюшную полость на глубину 1-2 см. Screж резьбовой канюли в брюшную полость путем поворота канюлю (~ 0,5 - 1 см) дополнительно на глубину 1,5 - 3 см, и удалить троакар.
- Удалите инсуфлятор трубку от иглы Вереша, выключить кран и удалить иглу. Подключение инсуфлятор трубки в канюлю и открыть запорный кран для поддержания пневмоперитонеума на уровне не более 10 - 12 мм рт.
- Вставьте жесткий объем через канюлю и в брюшную полость.
- Под визуализацией камеры, продолжают делать небольшой надрез с # 15 скальпелем через брюшную мускулатуру и брюшины на предыдущем разрезе кожи, используемый для введения иглы Вереша. Камера используются для визуализации брюшной стороны разреза, чтобы избежать сосудов и свести к минимуму кровотечения.
Примечание: Убедитесь, что разрез через мышцы и брюшина достаточно велик, чтобы облегчить ввод зонда и экстериоризации брыжейки (~ 0,5 см). Большее Разрез может потребоваться экстериоризоваться mesentчень у животных с повышенным содержанием жира брыжеечного. - Поместите животное в положении Тренделенбурга 21 с ногами повышенных примерно в 15 - 30 градусов выше головы. Это необязательно, но может облегчить доступ к брыжеечным лимфатическим узлам толстой кишки, как небольшой кишечному тракт будет двигаться к более черепному положению.
- Мезентериальная лимфатический узел Биопсия
- Под визуализацией камеры, вставьте твердый зонд через брюшной разрез, сделанный на этапе 2.3.5.
- Поместите зонд между сальником и кишечником и использовать радикальные движения, чтобы аккуратно смести сальник от кишечника, чтобы обеспечить визуализацию основной брыжейки. Продолжая использовать радикальные движения от хвостового к черепной части живота. Сальник может быть помещен в правой краниальной части живота, так что из операционного поля.
- Используйте зонд, чтобы переместить нисходящую ободочную кишку по направлению к левой или правой стенке брюшной полости. Это позволит лучше визуализировать тон брыжейки, чтобы помочь в поиске брыжеечных лимфатических узлов.
- С помощью зонда развертки через брыжейки, чтобы определить местонахождение брыжеечные лимфатические узлы вдоль толстой кишки и брыжеечных сосудов.
Примечание: Толстокишечные узлы проходят по брыжеечной границе толстой кишки, левые колика узлы могут быть найдены вблизи точек ветвления сосудов, а нижние узлы брыжейки могут быть найдены вдоль нижних брыжеечных сосудов. Брыжеечные лимфатические узлы хорошо видны у худых животных. Когда утопают в брыжеечном жире они часто придают слегка поднятый, блестящий внешний вид покрывающую брыжейке и могут быть более более сероватым цветом загара, то окружающим брыжеечной жир. Кроме того, брыжеечные лимфатические узлы, как правило, лежат вдоль лимфатических сосудов и брыжеечных сосудистой сети. - После того, как лимфатический узел идентифицируется, удалить зонд и вставить Мэриленд храповик щипцов в брюшную полость. Используйте пинцет, чтобы понять брыжейки смежны целевой узел. Потяните брыжейки к INCISion, и удалить сферу из канюли.
- Выключите инсуффлятор и оставьте канюли крана открыт для сброса давления на живот, чтобы облегчить экстериоризации брыжейки. Потяните брыжейки вне тела через разрез. После того, как выводило возьмитесь брыжейками с изогнутым кровоостанавливающими комариным или анатомическим пинцетом, чтобы обеспечить доступ через разрез.
- Определить лимфатический узел (ы) в пределах экстериоризированной брыжейки пальпации для тверже лимфатического узла и / или прямой визуализации Grayer цвета или узелкового появления лимфатического узла.
- После идентификации сделать небольшое отверстие (~ 3 - 5 мм) в брыжейке вблизи узла, используя изогнутые кровоостанавливающие зажимы. Бесплатные приложения к брыжейкам с помощью тупой диссекции с изогнутым кровоостанавливающими. Перевязывать сосудистый с 4-0 нерассасывающейся мононитью шва по мере необходимости. Используйте острое рассечение скальпеля, чтобы удалить лимфатический узел. Поместите узлы в Roswell Park Memorial института (RPMI) 1640 налед.
- Осмотрите выводили брыжейки кровотечения. Если кровотечение отмечено, обеспечивает соответствующий гемостаз окклюзии сосудов с кровоостанавливающими или лигатурами (4-0 неабсорбируемой мононить шовными), или путем использованием прижигания. Отпустите брыжейки и вдувать живот обратно до 10 - 12 мм рт.ст., чтобы брыжейки вернуться в брюшную полость.
- Повторите шаги 2.4.1 через 2.4.8, чтобы получить дополнительные биопсии лимфатических узлов.
- Биопсия печени
- Возвращает таблицу в горизонтальное положение.
- Поместите резьбовую канюлю в брюшную полость через разрез, ранее используемый для сбора биопсии лимфатического узла (разреза, сделанный на этапе 2.3.5). Убедитесь, что надрез достаточно большой (~ 5 - 7 мм), чтобы обеспечить размещение канюли без введения троакара. Вставьте жесткий объем через эту канюлю по направлению к краниальной брюшной полости и визуализировать черепной живот и печень.
- При визуализации камеры, вставьте биопсию пorceps через канюлю ранее размещенные в левой части живота (черепной разрез, сделанный на этапе 2.3.1).
- Для получения биопсии печени, место щипцов биопсии под выбранным краем лепестка печени с подвижной частью челюсти, обращенной к печени, откройте пинцет, и позволить запас, чтобы попасть в открытые челюсти. Убедитесь в том, что ни один сальник не между печенью и биопсийных щипцов. Отрегулируйте положение щипцов и закройте инструмент над требуемой областью выборки.
- Поддерживать давление в течение приблизительно 20 - 30 с, чтобы обеспечить гемостаз. С закрытого пинцетом, удалите образец осторожно потянув щипцы через канюлю. Это мягко разрывать биопсии из печени. Поместите биопсию печени в RPMI 1640 на льду.
Примечание: Размер биопсии печени составляет примерно 5 мм х 2 мм х 2 мм с помощью 5 мм биопсийных щипцов.
- Поддерживать давление в течение приблизительно 20 - 30 с, чтобы обеспечить гемостаз. С закрытого пинцетом, удалите образец осторожно потянув щипцы через канюлю. Это мягко разрывать биопсии из печени. Поместите биопсию печени в RPMI 1640 на льду.
- Изучите сайт биопсии для кровоизлияния с помощью визуализации камеры. Если наблюдается кровотечение, поместите солевой moistened стерильный ватный тампон через канюлю и оказать давление на место биопсии. В качестве альтернативы, упаковать участки биопсии стерильной гель пены, чтобы помочь гемостаза.
- Повторите шаги 2.5.3 через 2.5.5, чтобы получить дополнительные биопсии печени.
Примечание: Здесь, 3 биопсий на одно животное в процедуре были собраны, которая является достаточной для всех последующих анализов.
- Повязка
- Изучить брюшную полость кровотечения.
Примечание: Это не произошло до сих пор. Однако, если чрезмерное кровотечение отмечено, определить место кровотечения и обеспечить соответствующий гемостаз с помощью давления с стерильным ватным тампоном или использованием гелем пены. - Выключите инсуффлятор и откройте канюля краны. Слегка ручное давление на живот, чтобы полностью сбросить давление в брюшной полости. Удалите канюли.
- Закройте каждый из брюшных разрезов стена с 1 до 2 простых швов на сайт. Рекомендуется 4-0 рассасывающийся шовный.
- Выполните блок выплеска путем размещения 0,1-0,3 куб.см бупивакаина в каждом надрез для местной анестезии перед закрытием кожи.
- Закройте кожу 1 - 2 захороненных узловыми швами (рекомендуется 4-0 рассасывающийся шовный) для каждого сайта. Ткань клей может быть нанесен.
- Изучить брюшную полость кровотечения.
3. Биопсия печени Обработка и анализ лимфоцит
- Хранить несколько кусков ткани печени (около 0,5 мм х 0,5 мм х 0,5 мм в размере) в криоконсервации труб, в предпочтительном растворе для хранения РНК и 10% формалин для будущих молекулярных и гистологических анализов.
- Поместите оставшиеся биопсии печени в 50 мл среды RPMI 1640 с добавлением 1x пенициллина / стрептомицина, 40 мкг / мл коммерчески доступного раствора коллагеназы и 4 мкг / мл ДНКазы в стерильном 250 мл пластиковую чашку с крышкой. Перемешивает энергично с помощью магнитной мешалки и мешалкой в течение 1 ч при 37 ° С.
- Равномерно распределяют путем выливания переваренной ткани. Grинд расщепленной ткани (со стадии 3.1.1) в течение двух 70 мкм фильтров вписываться в двух 50 мл конических пробирок в суспензию отдельной клеток с использованием конца стерильных 5 мл шприца. Довести объем обеих труб до 50 мл в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1x пенициллина / стрептомицина (R10).
- Центрифуга клетки при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Слейте супернатант. Концентрат клеток в один 50 мл конической трубки путем суспендирования клеток из обоего труб в 5 мл R10 и объединения в один 50 мл конической пробирки. Доведите объем до 50 мл с помощью R10. Граф клеток с помощью гемоцитометра, чтобы определить клеточный выход.
- Центрифуга клетки при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют клетки в 1 мл R10, равномерно распределить на две 5 мл круглодонных полистироловых пробирок и довести объем каждой пробирки до 4 мл с R10, для ориентации> 500000 клеток в каждой пробирке.
- Центрифуга клетки при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Слейте эльupernatant и ресуспендируют осадок клеток в 4 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS). Центрифуга при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С.
- Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 100 мкл PBS на вортексе мягко. Добавить 1,5 мкл фиксируемой мертвой клетки пятно. Инкубирую при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавьте следующие неразбавленным поверхностные окрашивания антител в титрах, рекомендованных производителем: CD45-PerCP (клон D058-1283), CD3-PE-CF594 (клон SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (клон 2Н7), CD4-BV605 ( клон ОКТ4), CD8-BV570 (клон РПА-Т8), и CD14-BV785 (клон M5E2). Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 20 мин.
- Добавить 4 мл PBS и центрифуге при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 250 мкл 1% параформальдегида в PBS.
Внимание: параформальдегид является токсичным. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты. - Анализ клеточных популяций с использованием проточного цитометра как описано в ссылке 22.
Representative Results
Подробные методы обработки собранных лапароскопии MLN, а также клеточные выходы и частота лейкоцитов в этих органах были ранее сообщались , 13. На рисунке 1 показаны данные сотовой урожайности и жизнеспособности , сравнивающие MLN и биопсии печени , собранных в двух временных точках 160 дней за исключением двух здоровых женщин RMs с использованием этой лапароскопической техники. Мы обнаружили , что клеточный выход из MLN была значительно выше , чем из печени (р = 0,0021), в среднем 33,5 х 10 6 и 6,74 × 10 6 клеток , полученных, соответственно. Мертвые клетки Окрашивание и анализ методом проточной цитометрии показали, что> 90% клеток, выделенных из обоих органов были жизнеспособными.
С помощью проточной цитометрии, мы оценили и сравнили обилие лейкоцитов и лимфоцитов в MLN и печени. Представитель схемы стробирования для печени показана на
Рисунок 1. Общая Клеточная Выход (вверху) и Жизнеспособность клеток (снизу) от Серийно Собранный MLN и печени Биопсию. МЛН показали значительно более высокие урожаи клеток, чем делали печень. Тем не менее, оба образца типа представлены широкие ячейки для последующих анализов. Жизнеспособность клеток, измеренный методом cytom потокаetrically с использованием фиксируемых мертвые клетки амина пятно, показал, что оба образца типа, как правило, получали> 90% жизнеспособность клеток после диссоциации ткани. Столбики ошибок представляют стандартное отклонение между образцами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель проточной цитометрии Gating стратегии. Во-первых, агрегированные клетки были исключены, с последующим отбором только жизнеспособных клеток после окрашивания с использованием фиксируемых мертвых клеток амина пятно. Далее, CD45 + лейкоциты были выбраны, с последующим отбором CD3 + Т - клеток. Из популяции CD3 +, анализировали CD4 + и CD8 + Т - клетки. Из CD3 - населения, CD14 + и CD20 + клетки анализировали. Thi s стратегия стробирования была также использована для МЛН. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Поток цитометрии участки из MLN и печени двух животных Продольно. МЛН и образцы печени были собраны 160 дней друг от друга для обоих животных. (А). МЛН CD45 + клетки (лейкоциты); (Б) Печень CD45 + клетки (лейкоциты); (С) МЛН + CD3 + клеток (Т - клетки); (D) Печень клеток CD3 + (Т - клетки). Для обоих животных, то МЛН показали более высокие пропорции CD45 + и CD3 + клеток по сравнению с печенью. Через время, частоты этих популяций были одинаковы для обоих животных.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Частоты CD45 + клетки (слева) и различные лейкоцитарные и субпопуляции (справа) Через 23 индивидуальных выборок. В MLNs отображаются значительно большие частоты CD45 +, CD3 +, и CD4 + клеток, в то время как печень показали значительно более высокие частоты CD14 + лейкоцитов, демонстрируя уникальные функции каждого органа. Столбики ошибок представляют стандартное отклонение между образцами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Здесь мы демонстрируем минимально инвазивный метод для последовательного сбора МЛН и биопсии печени, которые имели показатель успеха 100% в этих и других животных, не описанных в данном исследовании. Кроме того, использование этого метода на одних и тех же животных во времени не было связано с какими-либо побочными эффектами. В самом деле, не было никаких осложнений в результате использования этой методики в других когорт животных, которые были инфицированы ВИО, обезьяний / вируса иммунодефицита человека (SHIV) или вируса Зика (неопубликованные данные). Кроме того, эта операция оказалась успешной, даже у животных, которые ранее подверглись крупной абдоминальной хирургии, а также в животных с тромбоцитопенией (неопубликованные данные). Мы показали, что эти образцы могут быть собраны через те же два порта путем изменения местоположения камеры при переключении из MLN в печени избежать необходимости в дополнительных надрезов. Факторы , влияющие на сбор МЛН уже сообщалось ранее 13.
Вся процедура обычно занимает 30 - 45 минут, чтобы закончить и осуществляется через два ~ 0,5 см надрезы. У тучных животных, это может быть необходимо, чтобы сделать больший разрез (~ 1 - 1,5 см), чтобы восстановить MLN через и может потребоваться дополнительное время для завершения. Животные с большим мезентериального жира часто требует значительного опыта в гifferentiate МЛН из окружающего жира. МЛН часто встречаются вдоль мезентериальных сосудов и, как представляется, более распространены вблизи точек ветвления в сосудах. Одним из важнейших аспектов этого метода является то, что она требует выбранный MLN, чтобы иметь достаточную подвижность в брыжейки, чтобы быть выводили через разрез брюшной стенки. В результате, этот метод не может быть использован для сбора МЛН близко к корню брыжейки. В связи с увеличением, это в разы легче идентифицировать МЛН с камерой, и захватывая в непосредственной близости от МЛН может помочь с расположением и идентификации узла после его выводили.
Использование положения Тренделенбурга не всегда может потребоваться для сбора МЛН, и если МЛН могут быть легко получены без использования позиции Тренделенбурга это может сделать биопсию печени легче, поскольку это позволит предотвратить органы от смещения краниально. Время от времени, после размещения в Тренделенбурга положение, печень смещается вверх к диафрагме и должен аккуратно манипулируют в исходное положение до сбора биопсии. По мере того как порт для размещения коллекции MLN находится слева, биопсия печени, как правило, взята из левой боковой и левой медиальной доли печени, поскольку они находятся ближе к канюле.
Собранные МЛН и биопсия печени при условии, урожаев широких клеток для различных последующих анализов и показала высокую жизнеспособность собранных клеток. Здесь клетки окрашивали для проточной цитометрии анализа лейкоцитов и лимфоцитов населения, а также основные различия между этими двумя важными иммунными органами были выяснены. Например, МЛН были высоко обогащены CD4 + Т - клетки по сравнению с печенью из - за важность MLN в качестве центральных точек для сбора и распространения адаптивных иммунных ответов, а также на важность CD4 + T для управления воспалительными и толерогенные ответы на среду антигенов, полученные из пищевого рациона и GI-резидентов микроорганизмовs = "Xref"> 24. Тем не менее, печень была значительно обогащенные для CD14 + лейкоцитов по сравнению с MLN. CD14 экспрессируется преимущественно на моноцитах и макрофагах и является ключевым компонентом рецепторного комплекса для бактериального липополисахарида (LPS) 25. Действительно, увеличение плазменной концентрации растворимого CD14 связаны с микробной транслокации и активации иммунной системы у ВИЧ и SIV патогенных инфекций 26. Таким образом, более высокие частоты CD14 + лейкоциты в печени , вероятно , является результатом большей бактериальной нагрузки в этом органе по сравнению с MLN.
Здесь мы демонстрируем быстрое и минимально инвазивной хирургической техники для последовательного сбора МЛН и биопсии печени, используя только две небольшие надрезы для лапароскопической записи, не привело к каким-либо неблагоприятных последствий. Эти образцы обеспечивают полезный путь для оценки ключевых процессов иммунологических, вирусологических и микробиологических, которые берут пнулисе в MLN и печени, которые являются отдельными и уникальными от системного иммунитета. Точно так же, биопсия печени имеет решающее значение для долгосрочной оценки последствий ВИЧ / SIV, лекарственной терапии, и транслокаций микробов, которые часто объединяются , чтобы вызвать существенное повреждение печени 16. Кроме того, поскольку МЛН печень и иммунные органы подвержены желудочно-кишечный микробиоценоз, способность оценивать иммунитет в этих органах через время обеспечивает отличную платформу для понимания той роли, которую играет микробиом в поддержании иммунного гомеостаза хозяина. Взятые вместе, оценка печени и МЛН имеет важное значение в контексте вакцин и терапевтических эффективностей, SIV вирусного клиренса резервуара и общего иммунитета слизистых оболочек. Возможность сбора этих образцов с помощью минимально инвазивного подхода означает, что существует меньший риск воспаления, связанные с процедурой, чем существует в настоящее время опубликованных методик и меньшим воздействием на физиологии животных. В фуры, мы будем оценивать потенциал, чтобы объединить коллекцию МЛН и печени с коллекцией селезенки через те же два места порта, чтобы обеспечить выборки другой важной и отдельной части иммунной системы, которая, как было показано, чтобы играть важную роль в ряд моделей заболеваний.
Disclosures
Авторы заявляют нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана номер гранта P51OD010425 NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 mL | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5 mm x 300 mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2 mm x 80 mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
- Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
- Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
- Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
- Shuai, Z., et al.
- Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
- Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
- North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
- Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
- Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
- Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
- Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
- Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
- Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
- Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , Elsevier. (2011).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , Academic Press. (2009).
- Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia. , Blackwell Publishing. (2007).
- Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , Elsevier. (2012).
- Fransson, B. A., Mayhew, P. D. Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , Wiley Blackwell. (2015).
- Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
- Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535 (2016).
- Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).
