Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Et hydroponisk co-dyrkningssystem til simultan og systematisk analyse af plante / mikrobe molekylære interaktioner og signalering

Published: July 22, 2017 doi: 10.3791/55955
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,3
1London Research and Development Centre, Agriculture & Agri-Food Canada, 2Department of Biology, University of Western Ontario, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Western Ontario

Summary

Det beskrevne hydroponiske kultiveringssystem understøtter intakte planter med metal mesh skærme og cocultivates dem med bakterier. Plantevæv, bakterier og udskillede molekyler kan derefter høstes separat for nedstrømsanalyser, samtidig med at molekylære reaktioner fra både planteværter og interaktive mikrober eller mikrobiomer kan undersøges.

Abstract

Et eksperimentelt design der efterligner naturlige plante-mikrobe interaktioner er meget vigtigt at afgrænse de komplekse plante-mikrobe signalering processer. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Giver et fremragende model system til at studere bakteriel patogenese og planteinteraktioner. Tidligere undersøgelser af plante- Agrobacterium- interaktioner har i vid udstrækning været afhængige af plantecelle suspensionskulturer, kunstig såring af planter eller kunstig induktion af mikrobielle virulensfaktorer eller plantebeskyttelse af syntetiske kemikalier. Disse metoder adskiller sig imidlertid fra den naturlige signalering i planta , hvor planter og mikrober genkender og reagerer på rumlig og tidsmæssig måde. Dette arbejde præsenterer et hydroponisk kultiveringssystem, hvor intakte planter understøttes af metal mesh skærme og kultiveres med Agrobacterium . I dette kultiveringssystem findes ingen syntetisk phytohormon eller kemikalie, der inducerer micrObial virulence eller planteforsvar er suppleret. Det hydroponiske kultiveringssystem ligner næsten naturlige plante-mikrobe interaktioner og signalering homeostase i planta . Planterødder kan adskilles fra mediet indeholdende Agrobacterium , og signalering og respons fra både værtsværterne og de interaktive mikrober kan undersøges samtidigt og systematisk. Ved et hvilket som helst tidspunkt / interval kan plantevæv eller bakterier høstes separat for forskellige "omics" -analyser, der demonstrerer effekten og effekten af ​​dette system. Det hydroponiske kultiveringssystem kan let tilpasses til at studere: 1) Gensidig signalering af forskellige plante-mikrobesystemer, 2) Signalering mellem en plantevært og flere mikrobielle arter ( dvs. mikrobielle konsortier eller mikrobiomer), 3) hvordan næringsstoffer og kemikalier er impliceret I plante-mikrobe signalering, og 4) hvordan mikrober interagerer med plante værter og bidrage til plantetolerance til biotiske oR abiotiske stress.

Introduction

Planteassocierede mikrober spiller vigtige roller inden for biogeokemisk cykling, bioremediering, afbødning af klimaændringer, plantevækst og sundhed og plantetolerance overfor biotiske og abiotiske påvirkninger. Mikroorganismer interagerer med planter både direkte gennem plantecellevægskontakt og indirekte via kemisk sekretion og signalering 1 , 2 , 3 . Som sessile organismer har planter udviklet direkte og indirekte mekanismer til at modstå infektion med patogener. Direkte forsvar omfatter strukturelle forsvar og udtryk for forsvarsproteiner, mens indirekte forsvar omfatter sekundær plantemetabolitproduktion og tiltrækningen af ​​organismer, der er antagonistiske for invaderende patogener 4 , 5 . Planteafledte rod-exudater, sekreter, slimhinder, mucigel og lysater ændrer rhizosfærens fysisk-kemiske egenskaber for at tiltrække eller afviseMikrober mod deres værter 6 . Den kemiske sammensætning af rodsekretion er artsspecifik og tjener derved som et selektivt filter, der tillader visse mikroorganismer, der er i stand til at genkende sådanne forbindelser for at blomstre i rhizosfæren 6 . Således kan kompatible mikrobielle arter stimuleres til at aktivere og forbedre deres foreninger, enten til fordel for eller skade for planteværten 1 .

Forståelse af plante-mikrobe interaktioner i rhizosfæren er nøglen til at forbedre planteproduktiviteten og økosystemets funktion, da størstedelen af ​​den mikrobielle og kemiske eksponering forekommer ved rodstrukturen og jord-luftgrænsefladen 2 , 6 , 7 , 8 . Undersøgelsen af ​​underjordiske plante-mikrobe-interaktioner og gensidige reaktioner har imidlertid været en udfordring på grund af dens fascinerende Kompleks og dynamisk natur og mangel på egnede eksperimentelle modeller med naturlig rodstruktur og plantemorfologi under tæt kontrollerbare vækstbetingelser. Som en af ​​de mest undersøgte fytopathogener inficerer Agrobacterium en bred vifte af planter med landbrugs- og gartnerisk betydning, herunder kirsebær, æble, pære, drue og rose 9 . Agrobacterium er en vigtig modelorganisme til forståelse af plantepatogeninteraktioner og er et kraftfuldt værktøj i plantetransformation og planteteknik 10 , 11 , 12 , 13 , 14 .

Molekylære plante- Agrobacterium- interaktioner er blevet undersøgt godt i flere årtier, og den nuværende forståelse af Agrobacterium- patogenicitet er omfattende 9 ,F.> 11 , 15 , 16. Agrobacteriumpatogenicitet er i høj grad tilskrevet dets evoluerede evner til at opfatte planteafledte signaler, hvilket resulterer i den fine modulering af dets virulensprogram og celle til celle kommunikation, såkaldt quorum sensing 17 . Agrobacterium virulence-programmet reguleres af flere signaler til rådighed i rhizosfæren og involverer to sæt 2-komponentsystemer, ChvG / I-systemet og VirA / G-systemet. Syrebetingelser i rhizosfæren aktiverer transkriptionen af chvG / I , virA / G , Og flere andre gener involveret i Agrobacterium- patogenicitet, herunder virE0 , virE1 , virH1 , virH2 og gener af type VI-sekretionssystemet (T6SS) 18. Plantafledte phenolforbindelser, herunder acetosyringon (4'-hydroxy-3 ', 5 '-dimethoxyacetophenon), aktiver V'enIrA / G 2-komponentsystem gennem phosphoryleringssignaleringsmekanismer 19 . VirA / G aktiverer derefter hele vir- regulonet, hvilket resulterer i overførsel og integration af et ~ 20 kb bakterielt DNA-fragment kaldet transfer DNA (T-DNA) fra dets tumorinducerende (Ti) plasmid i plantekernen 16 . T-DNA bærer gener ansvarlig for syntesen af ​​plantehormonerne indol-3-eddikesyre (IAA) ( iaaM og iaaH ) og cytokinin ( ipt ) og en gang udtrykt i planteceller produceres store mængder af disse phytohormoner. Dette resulterer i unormal vævsproliferation og udvikling af plantetumor, kendt som kronesygdom, hvilket er et kronisk og genopståeligt problem for planterne 9 , 11 , 20 . IAA virker også kollektivt med salicylsyre og gamma-aminobutyrsyre for at undertrykke Agrobacterium virulens eller for at reducere Agrobacteriu M quorum sensing (QS) 17 , 21 , 22 . For at imødegå denne undertrykkelse bærer T-DNA også gener for opinbiosyntese, som aktiverer Agrobacterium quorum-sensing for at fremme Agrobacterium- patogenicitet og tjener også som en næringsstofkilde for patogenet 22 , 23 .

På trods af en samlet dyb forståelse af Agrobacterium- planteinteraktioner og den resulterende T-DNA-overførsel til planteværten er de komplekse signaleringshændelser i den indledende fase af interaktionen mindre velkendte. Dette skyldes delvist begrænsningerne af konventionelle metoder til undersøgelse af Agrobacterium- plantesignalering. Plantecellesuspensionskulturer og kunstig stedsspecifik såring anvendes almindeligt til at studere molekylære plante-mikrobe interaktioner 24 ,Ef "> 26 , 27. Celleopslæmninger mangler imidlertid typisk plantemorfologi, især plantesuspensionsceller har ikke rotstrukturer og rodeksudater, som er meget vigtige for aktivering af mikrobiell kemotaxis og virulens 28 , 29. Vedligeholdelsen af ​​plantemorfologi Og rodstruktur er blevet behandlet af kunstigt sårende planter, hvilket letter lokalitetsspecifik infektion, hvilket resulterer i påvisning af inducerede planteforsvarrelaterede gener i direkte inficeret plantevæv 30 , 31. Imidlertid er kunstig såring signifikant forskellig fra patogeninfektion i naturen , Især da sår fører til akkumulering af jasmoninsyre (JA), som systematisk interfererer med naturlig plantesignalering og forsvar 26. Desuden anvendes syntetiske kemikalier typisk til kunstigt at fremkalde planteværtsresponserEller patogen virulens. Skønt tilskuddet af sådanne kemiske forbindelser, der reflekterer koncentrationer i planta, er muligt, tager sådanne tilskud ikke hensyn til diffusionen af ​​rod-exudater gradvist ind i den omgivende rhizosfære, hvilket frembringer en kemotaktisk gradient registreret af mikrober 28 , 32 . I betragtning af begrænsningerne af konventionelle fremgangsmåder til undersøgelse af plante-mikrobe-interaktioner kan nøjagtigheden og dybden af ​​de opnåede data være hæmmet og restriktive, og den viden, der genereres ud fra de konventionelle fremgangsmåder, kan ikke oversættes direkte i planta . Mange aspekter af plante- Agrobacterium- signalering er endnu ikke fuldt ud forstået, især i det tidlige stadium af interaktioner, når sygdomssymptomerne endnu ikke er udviklet.

For at ændre begrænsningerne ved konventionelle tilgange præsenterer dette arbejde en billig, tæt kontrollerbar og fleksibel hydroponisk cOdlingssystem, der giver forskere mulighed for at få dybere indsigt i de komplekse signal- og reaktionsveje ved begyndelsen af ​​molekylære plante-mikrobe interaktioner. Hydroponics har været meget anvendt til at studere plantenæringsstoffer, rod-ekssudater, vækstbetingelser og virkningerne af metallisk toksicitet på planterne 33 , 34 . Der er flere fordele ved hydroponiske modeller, herunder de små rumlige krav, tilgængeligheden af ​​forskellige plantevæv, den tætte kontrol af næringsstof / miljøforhold og bekæmpelse af skadegørere / sygdomme. Hydroponiske systemer er også mindre begrænsende for plantevækst i sammenligning med agar / phytoagar plating teknikker, der typisk begrænser vækst efter 2-3 uger. Det er vigtigt, at vedligeholdelsen af ​​helplantekonstruktioner letter den naturlige rodsekretion, der er nødvendig for mikrobiell kemotakse og virulensinduktion 8 , 29 . Systemet beskriverSeng her er enklere og mindre arbejdskrævende end alternativene 33 , 34 . Det bruger færre dele og kræver ikke andre værktøjer end standard saks. Den bruger metalnet (i modsætning til nylon 33 ) som en stærk støtte til plantevækst og en simpel metode til beluftning under sterile betingelser gennem omrystning for at understøtte mikrobiel vækst. Derudover kan systemet bruge metalnet af forskellige størrelser til at understøtte plantevækst, som rummer forskellige plantearter uden at begrænse bredden af ​​deres rødder.

I det hydroponiske kultiveringssystem, der præsenteres her, dyrkes planter i et sterilt hydroponisk system, hvor plantens rødder udskiller organiske forbindelser, der understøtter væksten af ​​podede bakterier. I dette kultiveringssystem suppleres ingen kunstige kemikalier, såsom plantehormoner, forsvarselektronik eller virulensfremkaldende kemikalier, hvilket afspejler den naturlige celleSignalerende homeostase under plante-mikrobe interaktioner. Med dette hydroponiske kultiveringssystem var det muligt at samtidigt bestemme genekspression i Arabidopsis thaliana Col-0 rodvæv efter infektion med Agrobacterium , såvel som aktiveringen af Agrobacterium- gener ved kultivering med Arabidopsis . Det blev yderligere påvist, at dette system er egnet til at studere Agrobacterium- vedhæftning til planterødder såvel som planterodssekretomprofilen ved kultivering (infektion) med Agrobacterium ( Figur 1 ).

figur 1
Figur 1: Oversigt over det hydroponiske kultiveringssystem med stikprøveanalyser. Planter dyrkes oven på masken (skud over masken), med rødderne nedsænket i hydroponisk medium, som derefter inokuleres med bakterier fEller kultivering. Plantevæv og bakterier separeres derefter til samtidige ekstraktioner og analyser. Dette tal er blevet ændret fra reference 35 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksperimentel planlægning

  1. Bestem eksperimentets specifikke mål.
  2. Læs hele protokollen nedenfor. Bestem hvilke sektioner der er relevante for de specifikke mål og om eventuelle ændringer skal foretages. Se nedenfor for eksempler.
    1. Overvej om forsøgene vil bruge A. thaliana planter og A. tumefaciens bakterier, som nedenfor, eller en anden plante-mikrobe kombination.
      BEMÆRK: Mens forskellige plantearter kan anvendes, kan plantens rødder tykkelse kræve en anden størrelse mesh (trin 3.3), og vækstparametrene (trin 3.10-3.11 og 4.4) og hydroponisk tankstørrelse og mediumvolumen (trin 4.2) kan også kræve justering ( figur 2 ). Mikrober kan let podes som rene kulturer, blandede arter (konsortier) eller fra miljøprøver (mikrobiomer), men eventuelle ændringer kan påvirke protokollen, især trin 4.5.
    2. OvervejTyper af eksperimenter, der vil blive brugt til at analysere prøverne.
      BEMÆRK: Fluorescensmikroskopi (trin 5) kræver organismer, der er mærket med en fluorescerende reporterkonstruktion.
  3. Design passende kontrol. Inkluder hydroponiske stridsvogne uden kimplanter, der inokuleres med kontrolbakterier og tanke med kontrolplanter, der ikke inokuleres med bakterier.
  4. Planlæg eksperimenter med passende antal frø og hydroponiske tanke. Overvej kontroller, biologiske replikater (mindst 3) og mængder væv, der kræves for alle analyser.
  5. Bestem den passende længde af kultivering for de eksperimentelle mål (trin 4.8).
  6. Gennemgå eventuelle trin nedenfor, efter behov.

Figur 2
Figur 2. Eksempler på andre planter, der kunne dyrkes i det hydroponiske system, understøttet af en P Latform af metal mesh. Kompatibilitet af et sæt metal masker til en række plantefrø og dyrkning. ( A ) Rustfrit stål type 304 svejsemesh 3 × 3 mesh × .047 "dia tråd til Vicia faba . ( B ) Rustfrit stål type 304 svejsemesh 4 × 4 mesh × .035" dia wire til Zea mays . ( C ) Rustfrit stål type 304 svejsemesh 4 × 4 mesh × .032 "dia tråd til Glycine max (sojabønne). ( D ) Rustfrit stål type 304 svejsemesh 6 × 6 mesh × .047" dia tråd til Raphanus sativus (vinter radise). ( E ) Rustfrit stål type 304 svejsemesh 6 × 6 mesh × .047 "dia tråd til Triticum spp. ( F ) Rustfrit stål type 304 svejsemesh 6 × 6 mesh × .035" dia tråd til Cucumis sativus . Dette tal er blevet ændret fra reference 35 .955fig2large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

2. Sterilisering af plantefrøoverflade

  1. Vortex (ved høj hastighed) ca. 200 frø af A. thaliana med 500 μl deioniseret vand i et mikrocentrifugerør. For plantearter med større frø, brug et stort rør for at lette overfladesteriliseringen.
  2. Centrifuger dette ved ca. 9.000 xg i 30 s i en bord-topmikrocentrifuge. Fjern vandet (supernatanten) ved hjælp af en pipette.
  3. Tilsæt 300 μL 2% natriumhypochlorit til frø og hvirvel. Forlad ved stuetemperatur i 1 min. For plantearter med større frø, brug større mængder til at dække frøene.
  4. Centrifuger ved ca. 9.000 xg i 30 s i en bord-topmikrocentrifuge. Fjern natriumhypochloritopløsningen ved hjælp af en pipette.
  5. Tilsæt 500 μL sterilt, deioniseret vand til frøene og hvirvelstrømmen. Centrifuge ved ca. 9.000 xg for30 s og fjern vandet ved hjælp af en steril pipette.
  6. Gentag trin 2.5 yderligere 4 gange.
  7. Tilsæt 500 μL 70% ethanol til frø og hvirvel. Forlad ved stuetemperatur i 1 min.
  8. Centrifuger ved ca. 9.000 xg i 30 s i en bord-topmikrocentrifuge. Fjern 70% ethanol ved hjælp af en pipette.
  9. Gentag trin 2.5 yderligere 5 gange.
  10. Resuspender de steriliserede frø i 500 μL sterilt, ultrapure vand.

3. Frøplantering og halvfast dyrkning af planter

  1. Tilbered halvfast Murashige og Skoog (MS) medium: 2.165 g / L MS basale salte; 10 g / l saccharose; 0,25 g / l MES; Og 59 ml / l B5 vitaminblanding, pH 5,75, med 4 g / l phytoagar.
  2. Autoklaver MS-mediet. Hæld 25 ml af det i hver steril dyb petriskål (100 x 25 mm 2 ).
  3. For hver petriskål skal du skære en 90 x 90 mm firkant af rustfrit stålnet.
    BEMÆRK: Den anbefalede maske til A. thaliana < / Em> har en karakter på 304 (standardkvalitet), maskestælling (antal huller pr. Lineær tommer) på 40 x 40 og en tråddiameter på 0,01 "(0,0254 cm). Der kræves en større mesh kvadrat for større hydropinholdige tanke Eller højere platforme.
  4. Bøj hjørnerne af hvert kvadratmaske lige så godt, at masken passer ind i Petri-pladen. Bøj hjørnerne i 90 ° vinkel til hovedparten af ​​masken for at tillade, at netværket bliver proppet op af hjørnerne, hvilket efterlader nok plads nedenfor til rotudvikling ( figur 3a ).
  5. Sæt de skærede kvadrater i et bægerglas, dække med aluminiumsfolie og steriliser ved autoklavering ved hjælp af en 30 minutters tørcyklus.
  6. Når mediet har størknet i petriskålene, og nettet er sterilt, anbringes hver steriliseret mesh kvadrat oven på det halvfaste medium, med de bøjede hjørner vendt nedad.
  7. Skub masken, så hjørnerne trænger igennem mediet, og hovedparten af ​​masken berører mediumets øverste overflade (> Figur 3b).
  8. Brug en 200 μL overføringspipette til at udarbejde individuelle overfladesteriliserede A. thaliana frø (frø vil forblive på toppen af ​​pipetten på grund af vakuumkraft) og forsigtigt overføre hvert frø oven på masken. Placer frøene, så de er anbragt passende til forsøgsbehov ( f.eks. 4 6 frø / plade).
  9. Tæt Petri-pladerne med låg, og placér et porøst kirurgisk tape rundt om kanterne.
  10. Stratificere frøene ved at placere hele petriskålen ved 4 ° C i 2 d i mørket ( fx indpakke tinfoil for at simulere mørket.)
  11. Dyrk frøene i petriskålen ved 22-24 ° C med en 16 h fotoperiode i 10-14 dage ( figur 3c ).

Figur 3
Figur 3: Hydroponic Plant-Microbe Cocultivation System. Venstre paNel repræsenterer et rutediagram, der beskriver de seks nøgle trin i samling og drift af det hydroponiske co-dyrkningssystem. Det højre panel viser de faktiske eksperimentelle materialer, udstyr og driftsprocedurer for det hydroponiske kultiveringssystem, når man studerer Arabidopsis-Agrobacterium- interaktioner. Inokuleringstrinnet og det sidste trin til plante- eller bakterieudtagning er nu vist. Dette tal er blevet ændret fra reference 35 . Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Hydroponic Cocultivation System

  1. Forbered væske Murashige og Skoog (MS) medium: 2.165 g / L MS basale salte, 10 g / L saccharose, 0,25 g / L MES og 59 ml / L B5 vitaminblanding, pH 5,75.
  2. Autoklaver mediet. Hæld 18 ml af det i hvert sterilt cylindrisk glas eller klar plastbeholder (krystalliseringsskål, 100 x 80 mm2) med sterile låg.
    BEMÆRK: Presteriliser beholderne og lågene ved at indpakke dem i aluminiumsfolie og autoklavering.
  3. I steriliseret strømningshætte skal du bruge sterile pincetter til forsigtigt at overføre hver mesh kvadrat med 10-14 dag gamle frøplanter fra det halvfaste medium til en hydroponisk cylindrisk tank ( figur 3d ). Tæt lågene på tankene ved hjælp af porøst kirurgisk tape.
  4. Dyrk kimplanterne på nettet i tanken i 72 timer ved 22-24 ° C, med et 16 h fotoperiode og ryste ved 50 omdr./min. Til beluftning ( Figur 3e ).
    BEMÆRK: Dette gør det muligt for planter at tilpasse sig det hydroponiske miljø før inokulation (kultivering) med mikroorganismer. Denne ventetid vil også tillade utilsigtet mikrobiell kontaminering at være tydelig før inokuleringen.
    1. Start næste trin dagen før slutningen af ​​inkubationsperioden.
  5. Dyrk A. tumefaciens i AB-medium(0,5% vægt / volumen gærekstrakt, 0,5% vægt / volumen trypton, 0,5% vægt / volumen sucrose, 50 mM MgSO4, pH 7,0) ved 28 ° C under omrystning natten over, indtil kulturen når en endelig optisk tæthed på 1,0 ved 600 Nm (OD 600 ), målt ved anvendelse af et spektrofotometer med uindtaget AB-medium som et emne.
    BEMÆRK: En OD 600 på 1,0 svarer til ca. 10 9 celler / ml.
  6. Vask A. tumefaciens tre gange i et lige volumen på 0,85% NaCl. Resuspenderes i et lige stort volumen sterilt dobbeltdestilleret vand.
  7. Før podningen undersøges tanken med kimplanter omhyggeligt for at sikre, at der ikke er nogen forurening; Mediet i de ukontaminerede tanke skal være klart og gennemsigtigt.
    1. Kassér enhver tank med overskyet væske (kontaminering) og nummer resten af ​​tanke. Prøve en lille mængde (20 μL) hydroponisk medium fra hver nummereret tank og få det på en petriskål fyldt med Luria bouillon (LB). inkuberSkålen ved 28 ° C.
  8. Tilsæt straks 50 μl af A. tumefaciens suspensionen (ca. 5 x 107 celler, beregnet fra OD 600 ) i hver nummereret hydroponisk tank. Cocultivate A. thaliana kimplanter og A. tumefaciens ved 22-24 ° C med et 16 h fotoperiode og ryste ved 50 omdr./min. ( Figur 3f ).
    1. Undersøg den plettet LB plade fra trin 4.7.1. Efter 12 og 28 h inkubation for at verificere tankernes sterilitet. Hvis der er nogen forurening, må du ikke bruge den tilsvarende nummererede tank (inokuleret med bakterier) til yderligere nedstrøms analyser.
  9. Om ønsket overvåger væksten af A. tumefaciens med jævne mellemrum ved at fjerne en prøve af medium fra tanken og måle OD 600 ved anvendelse af et spektrofotometer med medium fra en ikke-inokuleret kontrol som et emne ( figur 4 ).
    INGENTE: Plantesygdomssymptomer skal være tydelige efter 7 d ( figur 5 ).
  10. Separat A. thaliana rødder fra bakteriesuspensionen ved at løfte meshpladen; Tidspunktet for dette trin afhænger af downstream-processer. Se trin 5-8 for detaljer.
  11. Hvis der anvendes rødder til efterfølgende analyser, skylles rødderne hurtigt i dobbeltdestilleret vand. Hvis du bruger blad eller andet væv, skal du afskære vævet. For RNA analyser, fortsæt straks til trin 7.1.

Figur 4
Figur 4: Agrobacteriumvækst i det hydroponiske kultiveringssystem. Agrobacteriumvæksten i nærvær eller fravær af en plantevært ( Arabidopsis ) blev overvåget hver 4. time. Agrobacterium- celler blev dyrket i AB-medium O / N, vasket 3 gange med 0,85% NaCl og podet i det hydroponiske system med eller wUden arabidopsis samdyrkning, fra en indledende OD 600 på omkring 0,1. OD 600- værdierne er midlerne til tre biologiske replikater med standardafvigelser ( OD 600 på 1,0 = 1 x 10 9 celler / ml).

Figur 5
Figur 5: Repræsentative plantefænotyper og observerbare sygdomssymptomer under kultivering. Inden for 4 d efter podning er der ingen sygdomssymptomer synlige ( A ) sammenlignet med ikke-podede planter ( B ). Efter 7 d af Cocultivation (infektion) observeres sygdomssymptomer hos inficerede planter ( C ), mens ikke-podede planter forbliver sunde ( D ).

5. Fluorescensmikroskopi

  1. Brug A. tumefaciens med en reporterkonstruktion til et autofluorescerende protein tilCocultivation setup i trin 4.5 .
    BEMÆRK: En modificeret pJP2 plasmid udtrykker pCherry, et derivat af dsRed 36 , anvendes her.
  2. Efter en passende samdyrkning ( f.eks. 48 timer) i trin 4.8 adskilles individuelle sekundære rødder (hovedgrenens sidegrener) ved hjælp af steril saks.
  3. Skyl rødderne i dobbeltdestilleret vand for at fjerne løst bundet materiale. Sænk hver rod i 30 μl vand på et mikroskopglas og dæksel med en glasdæksel.
  4. Tæt kanterne på dækslet med neglelak for at forhindre dehydrering af rødderne.
  5. Visualiser fastgørelsen af A. tumefaciens til A. thaliana rødder ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
    BEMÆRK: Her anvendes et konfokalmikroskop med excitation fra en helium-neon (He-Ne) 543/594 nm laser til at visualisere pCherry-rød fluorescens ved 590-630 nm under et inverteret 63X vandlinsemål med en numerisk blænde på 1,4 (

Figur 6
Figur 6: Agrobacterium Root Attachment, bestemt af Confocal Microscopy. Det pCherry-røde fluorescensmærkede Agrobacterium blev visualiseret ved 590-630 nm med excitation fra en helium-neon (He-Ne) 543/594 nm laser. Visualisering blev udført under et inverteret 63X vandlinsemål med en numerisk blænde på 1,4. Skalestænger = 11 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Bakterielle transkriptionsanalyser

  1. Efter en passende samdyrkning ( f.eks. 8 timer) i trin 4.8, separeres rødderne fra det hydroponiske medium som i trin 4.9. Overfør 1,5 ml af det hydroponiske medium til en 1,5 ml mikroCentrifugerør og centrifuge ved 12.000 xg i 2 minutter for at pille cellerne.
  2. Fjern supernatanten. Overfør endnu 1,5 ml af det hydroponiske medium til det samme 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifuge ved 12.000 g i 2 minutter for at pille cellerne.
  3. Fjern supernatanten.
    BEMÆRK: Protokollen kan pauses her ved at indefryse prøverne ved -80 ° C indtil brug.
  4. Ekstraher RNA'et fra A. tumefaciens- cellerne ved anvendelse af standardmetoder 37 eller et egnet kommercielt RNA-isolerings- og oprensningssæt med DNase-behandling for at undgå DNA-forurening.
    BEMÆRK: Protokollen kan pauses her ved frysning af alikvoter af RNA ved -80 ° C indtil brug.
  5. Brug det isolerede RNA til forskellige analyser under anvendelse af standardmetoder, herunder følgende.
    1. Brug en kommerciel microarray ifølge producentens protokol til at registrere gensæt, der er differentielt udtrykt i cocultivated versus controlkultur.
    2. Brug kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (qRT-PCR) til at detektere ekspressionen af ​​specifikke gener eller at validere microarray data 38 .

7. Analyser af plantetransskription

  1. Efter en passende kultivering ( f.eks. 8 timer) i trin 4.8, separeres rødderne fra det hydroponiske medium som i trin 4.9 eller adskiller andre væv efter behov. Anbring omgående ca. 150 mg rødder eller andet plantevæv i flydende nitrogen.
    BEMÆRK: Protokollen kan pauses her ved at indefryse prøverne ved -80 ° C indtil brug.
  2. Slib de frosne prøver til et pulver i flydende kvælstof ved hjælp af en mørtel og pistle.
  3. Ekstraher RNA fra pulveret ved anvendelse af standardmetoder 39 eller et egnet kommercielt RNA-isolerings- og oprensningssæt med DNase-behandling for at undgå DNA-forurening.
    BEMÆRK: Protokollen kan pauses her ved at indefryse alikvoter af RNA på-80 ° C indtil brug.
  4. Brug det isolerede RNA til forskellige analyser under anvendelse af standardmetoder, herunder følgende.
    1. Brug en kommerciel microarray ifølge producentens protokol til at detektere gensæt, der er differentielt udtrykt i samdyrket versus kontrolplanter.
    2. Brug qRT-PCR til at detektere differentiel ekspression af specifikke gener eller at validere microarray data 38 .

8. Secretome Profilering

  1. Efter en passende samdyrkning ( fx 72 timer) i trin 4.8, adskilles rødderne fra det hydroponiske medium som i trin 4.9. Steriliser 18 ml hydroponisk medium ved at føre det gennem et 0,2 μm porfilter i 50 ml koniske rør.
  2. Frys prøverne ved -80 ° C / N.
  3. Løsn caps på 50 ml koniske rør og læg dem i en frysetørring i 36 timer. Fortsæt med at gemme eller behandle prøverne (som desBeskrevet nedenfor) til HPLC analyse og forbindelse detektion.
    BEMÆRK: Protokollen kan pauses her.
  4. Resuspender hver prøve i 5 ml dobbeltdestilleret vand i et forseglingsrør.
  5. Tilsæt 5 ml ethylacetat og bland ved at omvendte røret flere gange.
  6. Lad faserne adskilles ved stuetemperatur i 5 minutter.
  7. Overfør toppen (organisk fase) til en ny beholder ved pipettering. Om nødvendigt, pool flere organiske fraktioner.
  8. Tør under en mild strøm af nitrogengas (~ 45 min).
  9. Re-suspendere prøven i en passende opløsning til HPLC ( fx 100% methanol).
  10. Udfør HPLC i overensstemmelse med standardmetoder 40 .
  11. Påvise forbindelser ved passende midler.
    BEMÆRK: Elektrosprayioniserings-time-of-flight massespektrometri (ESI-TOF-MS) 40 anvendes her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vækst i det hydroponiske co-dyrkningssystem

Vækstkurven for A. tumefaciens C58 viste en signifikant forsinkelsesfase i den første 16 h kultivering, efterfulgt af en meget stabil vækst, når de blev dyrket med A. thaliana Col-0, op til en maksimal OD 600 på ca. 0,9 ved at starte ved 48 timer efter inokulering. Derimod observeredes i det væsentlige ingen bakteriel vækst i kontrolkulturen uden A. thaliana ( figur 4 ). Disse resultater tyder på, at plantebeskyttede kemiske forbindelser uden yderligere næringsstoffer kan tilvejebringe støtte til Agrobacterium- vækst i hydroponics-kultiveringssystemet. Den signifikante forsinkelsesfase i løbet af de første 16 h af kultivering kan tilskrives den ret komplekse værtopfattelse og gradvis rodsekretion ved kultivering med patogenet. </ P>

Kultiverede A. thaliana planter viste ingen sygdomssymptomer i de første 3 dage i forhold til kontrolplanter dyrket i fravær af A. tumefaciens ( Figur 5a , 5b ). Efter 5 dages kultivering blev forskellene gradvist synlige, og de mock-behandlede kontrolplanter var grønnere og sundere. Efter 7 dages kultivering med Agrobacterium viste plantevæv chlorosis og nekrose, såvel som tidlig blomstring ( Figur 5c, 5 d ). Tidlig blomstring i Arabidopsis er en generel konsekvens af infektion med en række fylogenetisk forskelligartede patogener 41 , 42 .

Mikroskopisk visualisering af Agrobacterium vedhæftning til plante rødder

A. tumefaciens mærket med pCherry-rød fluorescens lokaliseret til planterotstrukturen med en typisk stavlignende eller filamentform, ca. 0,5 μm i bredden og 3-5 μm i længden ( figur 6 ). De fleste bakterieceller blev lodret fæstnet til overfladen af ​​rodcellevæggen i overensstemmelse med tidligere fund, at Agrobacterium binder til cellevæggen på en polar måde 32 .

Disse resultater tyder på, at det hydroponiske kultiveringssystem kan bruges til at studere bakteriedynamik i planta , såsom vedhæftning til rodstrukturen og infektionsprocessen i realtid. Faktisk, i mangel af andre mikrober giver dette kultiveringssystem en støjfri platform til direkte observation af bakterieplantehæftning i planta . Aktivering af Agrobacterium virulens transkripter

Efter 8 timers kultivering blev A. tumefaciens- celler høstet for RNA-isolering, og transkriptionsniveauerne af de repræsentative virulensgener blev evalueret ved hjælp af qRT-PCR ( Figur 7 ). Ekspressionen af ​​virulensgenerne ropB, virA, virD1, virH1, virE0 og chvG blev signifikant opreguleret under samdyrkning med planteværten sammenlignet med kontrollen uden A. thaliana . Specifikt steg overfladen af ​​mRNA med 100% for chvG , med 70% for virD1 , med 94% for virA , med 40% for virE0 , med 330% for ropB og med 48% for virH1 .

Disse resultater tyder på, at uden supplemeNtation med syntetiske virulensinducerende kemikalier, plantersekreterende kemikalier i det hydroponiske kultiveringssystem er i stand til at aktivere Agrobacterium virulence programmering. Induktionen af Agrobacterium virulensgener er indicativ for Agrobacteria- responsen på planteafledte signaler i det hydroponiske kultiveringssystem. Det er meget interessant, at Agrobacterium ropB og chvG induceres ved kultivering med Arabidopsis, da tidligere undersøgelser har indikeret, at disse gener induceres af sure betingelser 18 , men ikke af acetosyringon, en velkendt virulensfremkaldende forbindelse 19 . Dette resultat antyder, at uidentificerede forbindelser fra Arabidopsis- rødder er i stand til at inducere ropB- og chvG- ekspression. Sådanne virulensfremkaldende kemikalier skal imidlertid identificeres yderligere.

Figur 7 Figur 7. Aktivering af Agrobacterium Virulence i Hydroponic Cocultivation System. MRNA-niveauerne af seks Agrobacterium virulensfaktorer blev målt kvantitativt ved hjælp af qRT-PCR. Overfladen af ​​virulensfaktor-transkripter blev normaliseret til den for 16S rRNA-transkriptionerne. Dataene repræsenterer middel ± standardafvigelse (fejlstænger) på 3 biologiske replikater, med P- værdier opnået ved elevens t-test.

Udtryk af planteafskrifter

QRT-PCR-analyse blev udført for fem gener, der tidligere blev vist at være differentielt udtrykt i A. thaliana (upublicerede data). Som forventet bekræftede qRT-PCR, at AGP 30 (AT2G33790) og NAS 1 (AT5G04950) blev nedreguleret (henholdsvis 97 og 89%), mens HSP21 (AT4G27670), PGIP 1 (AT5G06860) og ELIP 1 (AT3G22840) blev opreguleret (henholdsvis 3 800, 540 og 510%) i hver af de 3 replikater versus kontrollerne ( figur 8 ).

Figur 8
Figur 8: qRT-PCR af A. thaliana Root Transcripts. Overfladen af ​​hvert mRNA-transkript blev normaliseret til det for At ACTIN II transkripter. Dataene er gennemsnittet af 3 biologiske replikater ± standardafvigelsen (fejlstænger), med P- værdier opnået ved elevens t-test.

Ændringer i værtsafskærmningsprofiler

Rotafledte forbindelser har vist sig at variere stort set mellem plantearter 6 , 8 . RoOt exudater indbefatter molekylære signaler, der fremkalder forskellige signaleringsresponser under plante-mikrobe interaktioner 1 , 43 . Imidlertid er progressive forskelle i værtssekretionsprofiler over tid efter mikrobeinteraktion langt mindre forstået, bortset fra at rodsekreterede forbindelser er afgørende for tiltrækningen af ​​gavnlige bakterier 29 . Efter 72 timers kultivering med A. tumefaciens C58 blev forskelle i A. thaliana Col-0-sekretprofiler etableret ved anvendelse af positiv ion-mode LC-MS analyse og sammenligninger med ikke-podet A. thaliana Col-0 ( dvs. i fravær af Agrobacterium ). Et klart skift i sekretom blev observeret, idet nye forbindelser fremkom som følge af Agrobacterium- inokulation ( Figur 9 ). Samlet set blev 35 forbindelser forbedret forholdsvis i sekretomet af Agrobacterium- inokuleret planTs, mens 76 blev forøget i sekretomet for ikke-inokulerede planter ( figur 9 ). Sidstnævnte repræsenterer sandsynligvis forbindelser, som A. tumefaciens C58 ville støde på før infektion. Skønt disse forbindelser ikke blev identificeret, og differentieresekretionen af ​​specifikke rodafledte forbindelser ikke blev bestemt inden for rammerne af dette studie, demonstrerede sekretomeanalysen påviselige forskelle i værtssecretionsprofiler under anvendelse af dette hydroponiske kultiveringssystem.

Figur 9
Figur 9: A. thaliana Col-0 Root Secretome Analysis. Analyse af A. thaliana Col-0-sekretprofiler blev afsluttet i triplicat til mock-inokulerede og podede prøver. Peakområder for de 138 unikke massesignaler (forbindelser), der blev fundet i sekretionsprofilerne i hver behandlingsgruppe, blev gennemsnitligt, ogGennemsnitsværdierne blev anvendt til at beregne forskellen i overflod af hver forbindelse (mock-inoculated minus inoculated) for at visualisere forskelle i detekterbare forbindelser. Forbindelser med store negative forskelværdier var mere rigelige i sekretomet af podede planter, mens de med store positive forskelle var mere rigelige i sekretomet for mock-inokulerede planter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I betragtning af den gradvise karakter af rodsekretion forekommer koncentrationen af ​​virulensfremkaldende kemikalier produceret i planta og deres virkninger på dynamiske plante-mikrobe interaktioner i rumlige og temporale gradienter. I dette hydroponiske co-dyrkningssystem suppleres ingen syntetisk fytohormon eller kemikalie, som inducerer mikrobiell virulens eller plantebeskyttelse. I modsætning hertil skaber tilsætning af syntetiske kemikalier, såsom acetosyringon, en pludselig kunstig stigning i koncentrationer ved hjælp af konventionelle tilgange. Derfor efterligner dette hydroponiske kultiveringssystem i højere grad det naturlige miljø, hvor mikrober og værtsplanter genkender og reagerer i rumlige og tidsmæssige manerer.

Her var det muligt at påvise, at Agrobacterium virulensgener blev aktiveret ved samdyrkning med Arabidopsis . Dette tyder på, at naturlige planteafledte kemikalier inducerer Agrobacterium virulens. Fremtid eFfort er nødvendigt for at identificere disse kemikalier og for at verificere, om den virulensfremkaldende forbindelse acetosyringon er blandt dem. Derudover blev væsentlige ændringer i Arabidopsis rodgenekspression og sekretprofiler observeret ved kultivering med Agrobacterium , hvilket demonstrerede potentialet i det hydroponiske kultiveringssystem til undersøgelse af planteværtsresponser og sekretionsprofiler under plante-mikrobe-interaktioner. Faktisk kan man ved hjælp af den hydroponiske kultiveringsmetode undersøge genekspression og sekretoriske profiler af planteværter på ethvert tidspunkt, der fører op til og efter mikrobiel interaktion, hvilket vil bidrage til at belyse, hvordan disse transkriptionelle eller sekretiske ændringer letter eller afskrækker efterfølgende plante-mikrobe interaktioner .

Ud over at studere Arabidopsis - Agrobacterium- signalering kan det hydroponiske kultiveringssystem tilpasses til at studere andre vigtige plante-mikrobesystemer. Det kan bruges tilBelyser planteresponser på et bredt udvalg af patogene eller gavnlige mikroorganismer, der virker individuelt eller kollektivt, og for at studere mikrobiel binding og reaktioner på forskellige planteværter under relativt "naturlige" betingelser. Vedligeholdelsen af ​​typisk plantemorfologi er vigtig for at præcisere molekylære plante-mikrobe interaktioner. I tilfælde af andre bakterier, svampe eller herbivoriske patogener kan yderligere næringsstoffer suppleres for at understøtte mikrobiel vækst under dyrkningen.

Der er dog nogle parametre at overveje til dyrkning med forskellige plante-mikrobe systemer. Afhængigt af frøstørrelse og rodmorfologi kan metalnet med større huller og en større vækstbeholder være påkrævet for større frø og kimplanter for at sikre, at rodstrukturer udvikles fuldt ud under netoverfladen, og at skydevæv spredes over. Opsætningen kan også være nødvendigt at ændre til at omfatte en højere platform. Dette kunne opnås bY skærer et større kvadratmaske og bøjer det længere fra hjørnerne for at hæve meshoverfladen højere fra bunden af ​​beholderen eller ved at skære masken i form af et græsk kryds og bøje hver klap ved indrykningene. Selvfølgelig er der begrænsninger for hvert system, og den her præsenterede her, vil ikke være nyttig for større planter, der dyrkes i længere perioder ( fx moden majs). Endvidere kan nogle organismer kræve mere luftning end tilvejebringes ved omrystning ved anvendelse af dette system.

Det er ganske vist meget vanskeligt eller endog umuligt at designe et system i et laboratorium, som præcist og perfekt replikerer de dynamiske plante-mikrobe interaktioner, der forekommer i naturen. Selvom den hydroponiske kultivering mere tæt repræsenterer naturlige forhold i rhizosfæren, i det mindste konceptuelt, med intakte rodstrukturer og plantemorfologi, er der ingen jord- eller jordmikroorganismer i systemet. Dette system kan dog tilpassesAt opfylde forskellige behov, såsom at studere mikrobiomer i et kontrollerbart miljø og at lære, hvordan planter eller mikrober opfatter og reagerer på forskellige biotiske eller abiotiske stimuli. Dette hydroponiske kultiveringssystem kan også lette forståelsen af ​​mikrobiomer og deres funktioner i hydroponics eller økosystemer. Dette er meget vigtigt for sygdomsforvaltning og plantesundhed for den hydroponiske drivhusindustri eller for akvatiske økologi af planter og mikrober.

Derudover kan dette hydroponiske kultiveringssystem tilpasses til at studere bioremediering og til at belyse de relevante metaboliske processer og regulatoriske veje i mikrober eller planter. Desuden letter dette hydroponiske kultiveringssystem undersøgelse af virkningerne af allerede eksisterende (allelokemikalier) og / eller anvendte (syntetiske) næringsstoffer og kemiske signaler / forbindelser på mikrober eller planteværter 44 . Tilgængeligheden af ​​indirekte påvirkning af plantevæv ( dvs.0; Blad, skyde) i det hydroponiske kultiveringssystem giver mulighed for at udforske andre plante-defensive processer, såsom planteprimning, og hvordan disse signaler transduceres.

Den mest kritiske del af dette samdyrkningssystem er at forhindre forurening. Især overførsel af planter fra det halvfaste medium til tanken skal udføres meget omhyggeligt for at forhindre forurening af det hydropiske medium. Det er derfor nødvendigt, at dette eksperimentelle trin udføres under sterile forhold i et bio-sikkerhedskabinet, og eksperimenter skal vente 2-3 dage efter overførslen, før nogen mikroorganismer inokuleres til eksperimentet.

Sammenfattende forbedrer det hydroponiske kultiveringssystem forskellige begrænsninger af konventionelle fremgangsmåder ved at opretholde typisk plantemorfologi og integriteten af ​​planterotstrukturer gennem hele forsøgsprocessen. Desuden undgår systemet supplementatetPå syntetiske kemikalier, såsom plantehormoner eller forsvars- / virulensfremkaldende kemikalier. Således ligner den mere tæt på det naturlige miljø, hvor mikrober og værtsplanter genkender og reagerer i rumlige og tidsmæssige manerer. Dette kultiveringssystem kan tilpasses til at studere forskellige plante-mikrobesystemer i mere "naturlige" og håndterbare forhold, herunder med endofytiske eller epifytiske mikrober. Forskellige aspekter af interaktioner i planta , såsom patogenese, symbiose eller plantevækstfremme kan undersøges. Det hydroponiske kultiveringssystem kan give nyt indblik i de fysiologiske, biokemiske og molekylære reaktioner hos både planter og mikrober. På et hvilket som helst tidspunkt / interval eller vækststadium kan bakterier eller planter, der vokser i det hydroponiske dyrkningssystem, samples separat for forskellige "omics" -analyser, herunder plante- og mikrobielle transkriptomier, plante- og mikrobielle metabolomikker, plante- og mikrobiel-sekret og bioremediatipå. Desuden kan dette hydroponiske co-dyrkningssystem tilpasses til at studere vekselvirkningerne mellem planteværter og mikrobiomer i et kontrollerbart miljø. Sammenfattende eksemplificerer fordelene ved den hydroponiske kultivering et overordnet system til afdækning af molekylær plante-mikrobe interaktion og signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Brian Weselowski og Alexander W. Eastman for deres hjælp og nyttige diskussioner. Vi vil også gerne takke Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui og Greg Thorn for deres hjælp, nyttige diskussioner og kritisk læsning af manuskriptet. Denne forskning blev finansieret af Agriculture and Agri-Food Canada, Growing Forward-AgriFlex (RBPI nummer 2555) og Growing Forward II-projekt nummer 1670, som blev udført af forfatterne som en del af deres opgaver. Denne undersøgelse blev også delvist finansieret af Canadian Science and Engineering Research Council (NSERC) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 tildelt ZC Yuan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) Arabidopsis Biological Resource Centre CS7000 https://abrc.osu.edu/order-stocks
bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) University of Washington N/A
labeled bacteria in-house optional, depends on downstream analyses
vortex (various)
microcentrifuge tubes (various)
microcentrifuge (various)
5% sodium hypochlorite (various)
double distilled water (various)
autoclave (various)
micropipette  (various)
70% ethanol (various)
Murashige and Skoog (MS) basal salts Sigma-Aldrich M5524
sucrose (various)
MES (various)
B5 vitamin mix Sigma-Aldrich G1019
phytoagar (various)
Deep Petri dishes (various)
stainless steel mesh Ferrier Wire Goods Company Ltd N/A grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01
micropore tape, 1" 3M 1530-1
diurnal growth chamber (various)
cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm  Pyrex 3250 other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment
flow hood (various)
forcepts (various)
yeast extract (various)
tryptone (various)
MgSO4 (various)
shaking incubator (various)
spectrophotometer (various)
NaCl (various)
shaker (various)
scissors (various) optional, depends on downstream analyses
fluorescence microscope (various) optional, depends on downstream analyses
microscope slides and cover slips (various) optional, depends on downstream analyses
nail polish (various) optional, depends on downstream analyses
Bacterial RNA extraction kit (various) optional, depends on downstream analyses
plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) Qiagen 74903 or 74904 optional, depends on downstream analyses
material and equipment for qRT-PCR (various) optional, depends on downstream analyses
material and equipment for microarray analysis (various) optional, depends on downstream analyses
liquid nitrogen (various) optional, depends on downstream analyses
mortar and pestle (various) optional, depends on downstream analyses
0.2 µm pore filter (various) optional, depends on downstream analyses
50 mL conical tubes (various) optional, depends on downstream analyses
freeze dryer (various) optional, depends on downstream analyses
sealable test tubes (various) optional, depends on downstream analyses
ethyl acetate (various) optional, depends on downstream analyses
nitrogen gas (various) optional, depends on downstream analyses
material and equipment for HPLC (various) optional, depends on downstream analyses
material and equipment for ESI-TOF-MS (various) optional, depends on downstream analyses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
  2. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
  3. Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
  4. Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  5. Zhang, J., Zhou, J. -M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
  6. Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
  7. Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
  8. Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
  9. Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
  11. Binns, A. N., Costantino, P. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Springer International Publishing AG. Cham, Switzerland. (1998).
  12. Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. Lindsey, K. , Harwood Academic. Amsterdam, Netherlands. (1998).
  13. Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
  14. Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283 (1999).
  15. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  16. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiol. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  17. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322 (2014).
  18. Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
  19. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
  20. Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
  21. Yuan, Z. -C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
  22. Yuan, Z. -C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
  23. Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
  24. Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
  25. Veena,, Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
  26. León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J. Wound signalling in plants. J. Exp. Bot. 52 (354), 1-9 (2001).
  27. Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
  28. Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
  29. Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
  30. Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
  31. Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
  32. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252 (2014).
  33. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69 (2014).
  34. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4 (2013).
  35. Nathoo, N. Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , University of Western Ontario. (2015).
  36. Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  37. Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
  38. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  39. Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
  40. Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
  41. Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
  42. Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699 (2015).
  43. Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
  44. Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).

Tags

Molekylærbiologi udgave 125 molekylær plante-mikrobe interaktion, Hydroponics co-dyrkning plante stress respons patogenicitet bakterier mikrobiom
Et hydroponisk co-dyrkningssystem til simultan og systematisk analyse af plante / mikrobe molekylære interaktioner og signalering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nathoo, N., Bernards, M. A.,… More

Nathoo, N., Bernards, M. A., MacDonald, J., Yuan, Z. C. A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling. J. Vis. Exp. (125), e55955, doi:10.3791/55955 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter