Summary
Det beskrivna hydroponiska odlingssystemet stöder intakta växter med metallnätskärmar och samverkar dem med bakterier. Växtvävnad, bakterier och utsöndrade molekyler kan sedan skördas separat för nedströmsanalyser samtidigt som molekylära reaktioner hos både växtvärdar och interaktiva mikrober eller mikrobiomer kan undersökas.
Abstract
En experimentell design som efterliknar naturliga växtmikro-interaktioner är väldigt viktigt för att avgränsa de komplexa processerna för växtmikro signalering. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Ger ett utmärkt modellsystem för att studera bakteriell patogenes och växelverkan. Tidigare studier av växt -Agrobacterium- interaktioner har i stor utsträckning åberopats på växtcellssuspensionskulturer, den artificiella sårningen av växter eller den artificiella induktionen av mikrobiella virulensfaktorer eller växtskydd med syntetiska kemikalier. Emellertid skiljer sig dessa metoder från den naturliga signalen i plantan , där växter och mikrober känner igen och svarar på rumsligt och temporärt sätt. Detta arbete presenterar ett hydroponiskt odlingssystem där intakta växter stöds av metallnätskärmar och odlas med Agrobacterium . I detta odlingssystem är ingen syntetisk fytohormon eller kemikalie som inducerar micrObial virulence eller växtförsvar kompletteras. Det hydroponiska kultiveringssystemet liknar väsentligen naturliga växtmikro-interaktioner och signalerande homeostas i plantan . Växtrötter kan separeras från mediet innehållande Agrobacterium , och signaleringen och svaren hos både växtvärdarna och de interaktiva mikroberna kan undersökas samtidigt och systematiskt. Vid en given tidpunkt / intervall kan växtvävnader eller bakterier skördas separat för olika "omics" -analyser som visar effekten och effekten av detta system. Det hydroponiska kultiveringssystemet kan enkelt anpassas för att studera: 1) Gensidig signalering av olika växtmikrobiosystem, 2) Signalering mellan en växt värd och flera mikrobiella arter ( dvs mikrobiella konsortier eller mikrobiomer), 3) Hur näringsämnen och kemikalier är inblandade I växtmikro signalering, och 4) hur mikrober interagerar med växtvärdar och bidrar till växt tolerans mot biotiska oR abiotiska påfrestningar.
Introduction
Växtassocierade mikrober spelar viktiga roller inom biogeokemisk cykling, bioremediering, minskning av klimatförändringar, växttillväxt och hälsa och växt tolerans mot biotiska och abiotiska påfrestningar. Mikroorganismer interagerar med växter både direkt genom växtcellsväggkontakt och indirekt via kemisk utsöndring och signalering 1 , 2 , 3 . Som sessila organismer har växter utvecklat direkta och indirekta mekanismer för att motstå infektion med patogener. Direkta försvar inkluderar strukturella försvar och uttryck av försvarproteiner, medan indirekta försvar inkluderar sekundär växtmetabolitproduktion och attraktion av organismer som är antagonistiska mot invaderande patogener 4 , 5 . Växthärdiga rotutsprutningar, sekret, mukilager, mucigel och lysater förändrar rhizosfärens fysikalisk-kemiska egenskaper för att locka till sig eller avvisaMikrober mot sina värdar 6 . Den kemiska sammansättningen av rotsekretion är artsspecifik och tjänar därigenom som ett selektivt filter som tillåter vissa mikroorganismer som kan känna igen sådana föreningar för att blomstra i rhizosfären 6 . Således kan kompatibla mikrobiella arter stimuleras för att aktivera och förbättra deras föreningar, antingen till fördel eller nackdel för växtvärden 1 .
Förstå växelmikroskopiska interaktioner i rhizosfären är nyckeln till att förbättra växtproduktiviteten och ekosystemets funktion, eftersom en majoritet av den mikrobiella och kemiska exponeringen förekommer vid rotstrukturen och markluftsgränssnittet 2 , 6 , 7 , 8 . Undersökningen av underjordiska växt-mikrobi-interaktioner och ömsesidiga svar har dock varit en utmaning på grund av dess intrigerande Komplex och dynamisk natur och bristen på lämpliga experimentella modeller med naturlig rotstruktur och växtmorfologi under tätt kontrollerbara tillväxtförhållanden. Som ett av de mest studerade fytopathogenerna infekterar Agrobacterium ett brett sortiment av växter med jordbruks- och trädgårdsbeteende, inklusive körsbär, äpple, päron, druva och ros 9 . Agrobacterium är en viktig modellorganisme för förståelse av växtpatogen-interaktioner och är ett kraftfullt verktyg vid växtomvandling och växtteknik 10 , 11 , 12 , 13 , 14 .
Molekylära växt- Agrobacterium- interaktioner har studerats väl i flera årtionden, och den nuvarande förståelsen av Agrobacterium- patogeniciteten är omfattande 9 ,F "> 11 , 15 , 16. Agrobacteriumpatogeniteten är till stor del hänförlig till dess utvecklade förmåga att uppleva växtgenererade signaler, vilket resulterar i finmoduleringen av dess virulensprogram och cell-till-cell-kommunikation, så kallad kvorumavkänning 17 . Agrobacterium virulence-programmet regleras av flera signaler som finns tillgängliga i rhizosfären och innefattar två uppsättningar av 2-komponentsystem, ChvG / I-systemet och VirA / G-systemet. Syrabetingelser i rhizosfären aktiverar transkriptionen av chvG / I , virA / G , Och flera andra gener som är involverade i Agrobacterium- patogenitet, inklusive virE0 , virE1 , virH1 , virH2 och gener av typ VI-sekretionssystemet (T6SS) 18. Växtgenererade fenoliska föreningar, innefattande acetosyringon (4'-hydroxi-3 ', 5 '-dimetoxiacetofenon), aktivera VIrA / G 2-komponentsystem genom fosforyleringssignalmekanismer 19 . VirA / G aktiverar sedan hela vir- regulon, vilket resulterar i överföring och integration av ett ~ 20 kb bakteriellt DNA-fragment som kallas överförings-DNA (T-DNA) från sin tumörinducerande (Ti) plasmid i växtkärnan 16 . T-DNA bär gener ansvarig för syntesen av växthormonerna indol-3-ättiksyra (IAA) ( iaaM och iaaH ) och cytokinin ( ipt ) och en gång uttryckt i växtceller produceras stora mängder av dessa fytohormoner. Detta resulterar i onormal vävnadsproliferation och utveckling av växttumörer, känd som krongallsjukdom, vilket är ett kroniskt och återkommande problem för växter 9 , 11 , 20 . IAA verkar också gemensamt med salicylsyra och gamma-amino-smörsyra för att undertrycka Agrobacterium virulens eller för att minska Agrobacteriu M kvorumavkänning (QS) 17 , 21 , 22 . För att motverka denna repression, bär T-DNA också gener för opinbiosyntes, vilken aktiverar agrobacteriumkvumumavkännande för att främja Agrobacterium- patogenicitet och tjänar också som en näringskälla för patogenen 22 , 23 .
Trots en övergripande djup förståelse för Agrobacterium- plant interaktioner och den resulterande T-DNA-överföringen i växtvärden är de komplexa signaleringshändelserna vid det inledande skedet av interaktion mindre väl förstådda. Detta beror delvis på begränsningarna av konventionella tillvägagångssätt för att undersöka Agrobacterium- plantsignalering. Växtcellssuspensionskulturer och artificiell platsspecifik sårning används vanligen för att studera molekylära växt-mikrobe-interaktioner 24 ,Ef "> 26 , 27. Cellsuspensioner saknar typiskt växtmorfologi, i synnerhet har plantesuspensionsceller inte rotstrukturer och rotutsöndringar, vilka är mycket viktiga för aktivering av mikrobiell kemotax och virulens 28 , 29. Behållandet av växtmorfologi Och rotstruktur har behandlats av artificiellt sårande växter, vilket underlättar platsspecifik infektion, vilket resulterar i detektion av inducerade växtförsvarsrelaterade gener i direkt infekterad vävnad 30 , 31. Men artificiell sårning skiljer sig signifikant från patogeninfektion i naturen , Speciellt som att sår leder till ackumulering av jasmonsyra (JA), som systemiskt stör naturligt växtsignalering och försvar 26. Dessutom används syntetiska kemikalier typiskt för att artificiellt inducera växtvärdesreaktionerEller patogen virulens. Även om tillägget av sådana kemiska föreningar som reflekterar koncentrationer i plantan är möjligt, svarar sådant tillskott inte för diffusion av rotutsprutning gradvis i den omgivande rhizosfären, vilken alstrar en kemotaktisk gradient som avkännes av mikrober 28 , 32 . Med tanke på begränsningarna av konventionella metoder för att studera växelmikroskopiska interaktioner kan noggrannheten och djupet hos de erhållna data hindras och begränsas, och kunskapen som genereras av konventionella metoder kan inte översättas direkt i plantan . Många aspekter av växt- Agrobacterium- signaleringen är ännu inte helt förstådda, särskilt i det tidiga skedet av interaktioner, när sjukdomssymptomerna ännu inte har utvecklats.
För att ändra gränserna för konventionella tillvägagångssätt presenterar detta arbete en billig, tätt kontrollerbar och flexibel hydroponisk cOdlingssystem som gör det möjligt för forskare att få djupare insikter i de komplexa signal- och reaktionsvägarna vid det inledande skedet av molekylära växtmikro-interaktioner. Hydroponics har använts i stor utsträckning för att studera växtnäringsämnen, rotutsöndringar, tillväxtförhållanden och effekterna av metallisk toxicitet på växter 33 , 34 . Det finns flera fördelar med hydroponiska modeller, inklusive de små rumsliga kraven, tillgången till olika vävnader, den täta kontrollen av näringsämnen / miljöförhållandena och skadedjursbekämpningen. Hydroponiska system är också mindre begränsande för växttillväxt i jämförelse med agar / fytoagarpläteringstekniker, som typiskt begränsar tillväxten efter 2-3 veckor. Viktigt är att underhållet av helplanta strukturer underlättar den naturliga rotsekretionen som är nödvändig för mikrobiell kemotax och virulensinduktion 8 , 29 . Systemet beskrivsSängen här är enklare och mindre arbetsintensiv än alternativen 33 , 34 . Det använder färre delar och kräver inga andra verktyg än standard sax. Det använder metallnät (i motsats till nylon 33 ) som ett starkt stöd för växttillväxt och en enkel metod för luftning under sterila betingelser genom att skaka för att stödja mikrobiell tillväxt. Dessutom kan systemet använda metallnät av olika storlekar för att stödja växttillväxt, vilket rymmer olika växtarter utan att begränsa bredden på sina rötter.
I det hydroponiska odlingssystemet som presenteras här odlas växter i ett sterilt hydroponiskt system där växtrötterna utsöndrar organiska föreningar som stöder tillväxten av inokulerade bakterier. I detta odlingssystem kompletteras inga konstgjorda kemikalier, såsom växthormoner, försvar elicitor eller virulence-inducerande kemikalier, vilket återspeglar den naturliga cellenSignalerande homeostas under interaktioner mellan växter och mikroorganismer. Med detta hydroponiska kultiveringssystem var det möjligt att samtidigt bestämma genuttryck i Arabidopsis thaliana Col-0-vävnad vid infektion med Agrobacterium , såväl som aktiveringen av Agrobacterium- gener vid odling med Arabidopsis . Det visades vidare att detta system är lämpligt att studera Agrobacterium- bindning till växtrotsar, liksom växtrodssekretomprofilen, vid odling (infektion) med Agrobacterium ( Figur 1 ).
Figur 1: Översikt över det hydroponiska kultiveringssystemet, med provanalyser. Växter odlas på nätet (skott över nätet), med rötterna nedsänkta i hydroponiskt medium som sedan inokuleras med bakterier fEller odling. Växtvävnader och bakterier separeras sedan för samtidiga extraktioner och analyser. Denna siffra har ändrats från referens 35 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentell planering
- Bestäm experimentets specifika mål.
- Läs igenom hela protokollet nedan. Bestäm vilka avsnitt som är relevanta för de specifika målen och om några ändringar behöver göras. Se nedan för exempel.
- Tänk på om experimenten kommer att använda A. thaliana växter och A. tumefaciens bakterier, som nedan, eller en annan växt-mikrobe kombination.
OBS! Medan olika växtarter kan användas kan växtrots tjocklek kräva ett nät med olika storlek (steg 3.3), och tillväxtparametrarna (steg 3.10-3.11 och 4.4) och hydroponisk tankstorlek och medelvolym (steg 4.2) kan också kräva justering ( Figur 2 ). Mikrober kan enkelt ympas som rena kulturer, blandade arter (konsortier) eller från miljöprover (mikrobiomer), men några förändringar kan påverka protokollet, särskilt steg 4.5. - ÖvervägaTyper av experiment som kommer att användas för att analysera proverna.
OBS: Fluorescensmikroskopi (steg 5) kräver organismer som är märkta med en fluorescerande reporterkonstruktion.
- Tänk på om experimenten kommer att använda A. thaliana växter och A. tumefaciens bakterier, som nedan, eller en annan växt-mikrobe kombination.
- Utforma lämpliga kontroller. Inkludera hydroponiska tankar utan plantor som inokuleras med kontrollbakterier och tankar med kontrollplantor som inte inokuleras med bakterier.
- Planera experiment med lämpligt antal frön och hydroponiska tankar. Tänk på kontroller, biologiska replikat (minst 3) och mängder vävnad som krävs för alla analyser.
- Bestäm lämplig längd av kultivering för de experimentella målen (steg 4.8).
- Ändra några steg nedan, efter behov.
Figur 2. Exempel på andra växter som kan odlas i det hydroponiska systemet, med stöd av en P Latform av Metal Mesh. Kompatibilitet hos en uppsättning metallnät för en mängd växtfrön och odling. ( A ) Rostfritt stål typ 304 svetsmesh 3 × 3 mesh × .047 "dia tråd för Vicia faba . ( B ) Rostfritt stål typ 304 svetsmask 4 × 4 mesh × .035" dia tråd för Zea mays . ( C ) Rostfritt stål typ 304 svetsmask 4 × 4 mesh × .032 "dia tråd för glycin max (sojabönor). ( D ) Rostfritt stål typ 304 svetsmask 6 × 6 mesh × .047" dia tråd för Raphanus sativus (vinter rädisa). ( E ) Rostfritt stål typ 304 svetsmask 6 × 6 mesh × .047 "dia tråd för Triticum spp. ( F ) Typ 304 svetsmask 6 × 6 mesh × .035" dia tråd för Cucumis sativus . Denna siffra har ändrats från referens 35 .955fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Sterilisering av växtfrösyta
- Vortex (vid hög hastighet) cirka 200 frön av A. thaliana med 500 μl avjoniserat vatten i ett mikrocentrifugrör. För växtarter med större frön, använd ett stort rör för att underlätta ytsteriliseringen.
- Centrifugera detta vid ungefär 9 000 xg i 30 s i en bords-mikrocentrifug. Ta bort vattnet (supernatanten) med en pipett.
- Tillsätt 300 μL 2% natriumhypoklorit till fröna och virvel. Lämna i rumstemperatur i 1 min. För växtarter med större frön, använd större volymer för att täcka frön.
- Centrifugera vid ungefär 9 000 xg i 30 s i en bords-mikrocentrifug. Ta bort natriumhypokloritlösningen med en pipett.
- Tillsätt 500 μL sterilt, avjoniserat vatten till fröna och virvel. Centrifugera ca 9 000 xg för30 s och avlägsna vattnet med en steril pipett.
- Upprepa steg 2.5 ytterligare 4 gånger.
- Tillsätt 500 μL 70% etanol till fröna och virvel. Lämna i rumstemperatur i 1 min.
- Centrifugera vid ungefär 9 000 xg i 30 s i en bords-mikrocentrifug. Ta bort 70% etanol med en pipett.
- Upprepa steg 2.5 ytterligare 5 gånger.
- Resuspendera de steriliserade frön i 500 | il steril, ultralätt vatten.
3. Frösprutning och halvfast odling av växter
- Förbered halvfast Murashige och Skoog (MS) medium: 2.165 g / L MS basala salter; 10 g / 1 sackaros; 0,25 g / 1 MES; Och 59 ml / L B5 vitaminblandning, pH 5,75, med 4 g / 1 phytoagar.
- Autoklavera MS-mediet. Häll 25 ml av det i varje steril djup petriskål (100 x 25 mm 2 ).
- Skär ut en 90 x 90 mm kvadrat med rostfritt stål i varje petriskål.
OBS: Det rekommenderade nätet för A. thaliana < / Em> har en klass av 304 (standardkvalitet), maskstorlek (antal hål per linjär tum) på 40 x 40 och en tråddiameter av 0,01 tum (0,0254 cm). En större maskstorlek krävs för större hydropinktankar Eller högre plattformar. - Böj hörnen på varje fyrkantigt nät så mycket att nätet passar inuti Petri-plattan. Böj hörnen i 90 ° vinkel mot huvuddelen av nätet för att tillåta att nätet läggs upp av hörnen, vilket ger tillräckligt med utrymme nedan för rotutveckling ( Figur 3a ).
- Lägg de skärna rutkorgarna i en bägare, täcka med aluminiumfolie och sterilisera genom autoklavering med en 30 minuters torrcykel.
- När mediet har stelnat i petriskålarna och nätet är sterilt, placera varje steriliserad mesh-kvadrat ovanpå det halvfasta mediet, med de böjda hörnen vända nedåt.
- Skjut in nätet så att hörnen tränger in i mediet och huvuddelen av nätet berör den övre ytan av mediet (> Figur 3b).
- Använd en 200 μL överföringspipett för att skapa individuella ytsteriliserade A. thaliana frön (frön kommer att vara på pipettspetsen på grund av vakuumkraft) och försiktigt överföra varje frö ovanpå nätet. Placera frön så att de är ordentligt åtskilda för experimentella behov ( t.ex. 4 6 frön / tallrik).
- Försegla Petri-plattorna med lock, placera poröst kirurgiskt tejp runt kanterna.
- Stratifiera fröet genom att placera hela petriskålen vid 4 ° C i 2 d i mörkret (t ex vikla in för att simulera mörkret.)
- Odla fröna i petriskålen vid 22-24 ° C med en 16 h fotoperiod under 10-14 dagar ( Figur 3c ).
Figur 3: Kokultiveringssystem för hydroponisk växt-mikrobi. Vänster paNel representerar ett flödesschema som beskriver de sex nyckelstegen vid montering och drift av det hydroponiska samodlingssystemet. Den högra panelen visar det faktiska experimentella materialet, utrustningen och operativa förfarandena för det hydroponiska odlingssystemet vid studier av Arabidopsis-Agrobacterium- interaktioner. Inokuleringssteget och slutsteget för växt- eller bakterieprovtagning visas nu. Denna siffra har ändrats från referens 35 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Hydroponic Cocultivation System
- Förbered flytande Murashige och Skoog (MS) medium: 2,155 g / L MS basal salter, 10 g / 1 sackaros, 0,25 g / L MES och 59 ml / L B5 vitaminblandning, pH 5,75.
- Autoklavera mediet. Häll 18 ml av det i varje sterilt cylindriskt glas eller en klar plastbehållare (kristalliseringsdisk, 100 x 80 mm2) med sterila lock.
OBS: Presterilisera behållarna och locken genom att förpacka dem i aluminiumfolie och autoklavera. - Använd sterila tångar för att försiktigt överföra varje maskstorg med 10-14 daggamla plantor från det halvfasta mediet till en hydroponisk cylindrisk tank ( Figur 3d ). Försegla locken på tankarna med hjälp av poröst kirurgiskt tejp.
- Odla plantorna på nätet i tanken i 72 h vid 22-24 ° C, med en 16 h fotoperiod och skaka vid 50 rpm för luftning ( Figur 3e ).
OBS: Detta gör det möjligt för växter att anpassa sig till den hydroponiska miljön före inokulering (odling) med mikroorganismer. Denna väntetid tillåter också oavsiktlig mikrobiell förorening att vara uppenbar före inokuleringen.- Börja nästa steg dagen före slutet av inkubationsperioden.
- Växa A. tumefaciens i AB-medium(0,5% vikt / volym jästextrakt, 0,5% vikt / volym trypton, 0,5% vikt / volym sackaros, 50 mM MgSO 4, pH 7,0) vid 28 ° C under skakning över natten tills odlingen når en slutlig optisk densitet av 1,0 vid 600 Nm (OD 600 ), mätt med användning av en spektrofotometer, med oinokulerat AB-medium som ett ämne.
OBS: En OD 600 på 1,0 motsvarar ungefär 10 9 celler / ml. - Tvätta A. tumefaciens tre gånger i en lika stor volym av 0,85% NaCl. Resuspenderas i en lika stor volym sterilt dubbeldestillerat vatten.
- Före inokuleringen, undersök tanken med plantor noggrant för att säkerställa att det inte finns någon förorening. Mediet i de oförorenade tankarna ska vara tydligt och transparent.
- Kassera eventuella tankar med grumlig vätska (kontaminering) och nummer resten av tankarna. Prova en liten mängd (20 μL) hydroponiskt medium från varje numrerad tank och placera den på en petriskål fylld med Luria buljong (LB). InkuberaDisken vid 28 ° C.
- Lägg omedelbart 50 μl av A. tumefaciens- suspensionen (ungefär 5 x 107 celler, uppskattade från OD 600 ) i varje numrerad hydroponisk tank. Cocultivate A. thaliana plantor och A. tumefaciens vid 22-24 ° C med en 16 h fotoperiod och skaka vid 50 rpm ( Figur 3f ).
- Undersök den fläckiga LB-plattan från steg 4.7.1. Efter 12 och 28 h inkubation för att verifiera tankernas sterilitet. Om det finns någon förorening, använd inte motsvarande nummererade tank (inokulerad med bakterier) för ytterligare nedströms analyser.
- Om så önskas, övervaka tillväxten av A. tumefaciens med jämna mellanrum genom att avlägsna ett prov av medium från tanken och mäta OD 600 med användning av en spektrofotometer med medium från en ej inokulerad kontroll som ett ämne ( Figur 4 ).
NEJTE: Sjukdomssymptom ska vara uppenbart efter 7 d ( Figur 5 ). - Separata A. thaliana rötter från bakteriesuspensionen genom att lyfta nätplattan; Tidpunkten för detta steg beror på processer i efterhand. Se steg 5-8 för detaljer.
- Skölj rötterna i dubbeldestillerat vatten om du använder rötter för efterföljande analyser. Om du använder blad eller annan vävnad, skära av vävnaden. För RNA-analyser, fortsätt genast till steg 7.1.
Figur 4: Agrobacterium Growth i Hydroponic Cocultivation System. Agrobacteriumtillväxt i närvaro eller frånvaro av en växtvärd ( Arabidopsis ) övervakades var 4: e timme. Agrobacteriumceller odlades i AB-medium O / N, tvättades 3x med 0,85% NaCl och inokulerades i det hydroponiska systemet, med eller wtan att Arabidopsis samodling, från en initial OD 600 på cirka 0,1. OD 600- värdena är medel för tre biologiska replikat med standardavvikelser ( OD 600 av 1,0 = 1 x 10 9 celler / ml).
Figur 5: Representativa växtfenotyper och observerbara sjukdomssymptom under kultivering. Inom 4 d efter inokulering är inga sjukdomssymptom synliga ( A ) jämfört med icke-inokulerade växter ( B ). Efter 7 d av Cocultivation (infektion) observeras sjukdomssymtom hos infekterade växter ( C ), medan icke-inokulerade växter förblir friska ( D ).
5. Fluorescensmikroskopi
- Använd A. tumefaciens som hyser en reporterkonstruktion för ett autofluorescerande protein förCocultivation setup i steg 4.5 .
ANMÄRKNING: En modifierad pJP2-plasmiduttryckande pCherry, ett derivat av dsRed 36 , används här. - Efter en lämplig samodling ( t.ex. 48 h) i steg 4.8, separera individuella sekundära rötter (huvudgrenens sidogrenar) med steril sax.
- Skölj rötterna i dubbeldestillerat vatten för att avlägsna löst bunden material. Dunk varje rot i 30 μl vatten på ett mikroskopglas och täck med en glasöverdrag.
- Försegla kanterna på täckglaset med nagellack för att förhindra uttorkning av rötterna.
- Visualisera bifogandet av A. tumefaciens till A. thaliana rötter genom fluorescensmikroskopi.
OBS! Här används ett konfokalmikroskop med excitation från en helium-neon (He-Ne) 543/594 nm laser för att visualisera pCherry röd fluorescens vid 590-630 nm under ett inverterat 63X vattenlinsmål med en numerisk öppning på 1,4 (
Figur 6: Agrobacterium root attachment, bestämd av konfokal mikroskopi. Den pCherry-röda fluorescensmärkta Agrobacterium visualiserades vid 590-630 nm, med excitation från en helium-neon (He-Ne) 543/594 nm laser. Visualisering utfördes under ett inverterat 63X vattenlinsmål med en numerisk bländare på 1,4. Skalstänger = 11 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Bakteriella transkriptanalyser
- Efter en lämplig samodling ( t.ex. 8 h) i steg 4.8, separera rötterna från det hydroponiska mediet som i steg 4.9. Överför 1,5 ml av det hydroponiska mediet till en 1,5 ml mikroCentrifugrör och centrifug vid 12 000 xg under 2 min för att pelleta cellerna.
- Ta bort supernatanten. Överför ytterligare 1,5 ml av det hydroponiska mediet till samma 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 12 000 g under 2 min för att pelleta cellerna.
- Ta bort supernatanten.
OBS: Protokollet kan pausas här genom att frysa proverna vid -80 ° C tills användning. - Extrahera RNA från A. tumefaciens- cellerna med användning av standardmetoder 37 eller ett lämpligt kommersiellt RNA-isolerings- och reningskit med DNas-behandling för att undvika DNA-förorening.
OBS: Protokollet kan pausas här genom att frysa alikvoter av RNA vid -80 ° C tills användning. - Använd det isolerade RNA för en rad olika analyser med användning av standardmetoder, inklusive följande.
- Använd en kommersiell mikroarray enligt tillverkarens protokoll för att detektera genuppsättningar som differentiellt uttrycks i kultiverad versus kontrollkultur.
- Använd kvantitativ realtid polymeraserkedjereaktion (qRT-PCR) för att detektera uttrycket av specifika gener eller att validera microarray-data 38 .
7. Analys av växtavskrivning
- Efter en lämplig kultivering ( t.ex. 8 h) i steg 4.8, separera rötterna från det hydroponiska mediet, som i steg 4.9, eller separera andra vävnader efter behov. Placera omedelbart cirka 150 mg rötter eller annan vävnad i flytande kväve.
OBS: Protokollet kan pausas här genom att frysa proverna vid -80 ° C tills användning. - Mala de frysta proverna till ett pulver i flytande kväve med en mortel och pestle.
- Extrahera RNA från pulvret med användning av standardmetoder 39 eller ett lämpligt kommersiellt RNA-isolerings- och reningskit med DNas-behandling för att undvika DNA-förorening.
OBS: Protokollet kan pausas här genom att frysa alikvoter av RNA vid-80 ° C tills användning. - Använd det isolerade RNA för en rad olika analyser med användning av standardmetoder, inklusive följande.
- Använd en kommersiell mikroarray enligt tillverkarens protokoll för att detektera genuppsättningar som är differentiellt uttryckta i samodlade kontra kontrollanläggningar.
- Använd qRT-PCR för att detektera differentialuttryck av specifika gener eller att validera microarray-data 38 .
8. Sekretessprofilering
- Efter en lämplig samodling ( t.ex. 72 h) i steg 4.8, separera rötterna från det hydroponiska mediet som i steg 4.9. Sterilisera 18 ml hydroponiskt medium genom att passera det genom ett 0,2 μm porfilter i 50 ml koniska rör.
- Frys proverna vid -80 ° C / N.
- Lossa kåporna på de 50 ml koniska rören och placera dem i en frystorkmaskin under 36 timmar. Fortsätt att lagra eller bearbeta proverna (som desBeskrivs nedan) för HPLC-analys och föreningdetektering.
OBS! Protokollet kan pausas här. - Resuspendera varje prov i 5 ml dubbeldestillerat vatten i ett förseglingsbart provrör.
- Tillsätt 5 ml etylacetat och blanda genom att invertera röret flera gånger.
- Låt faserna separeras vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Överför toppen (organisk fas) till en ny behållare genom pipettering. Om så krävs, pool flera organiska fraktioner.
- Torka under en mild ström av kvävgas (~ 45 min).
- Återupptag provet i en lämplig lösning för HPLC ( t.ex. 100% metanol).
- Utför HPLC enligt standardmetoderna 40 .
- Detektera föreningar med lämpliga medel.
OBS: Elektrosprayjonisering Time-of-Flight Mass Spectrometry (ESI-TOF-MS) 40 används här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillväxt i det hydroponiska samodlingssystemet
Tillväxtkurvan för A. tumefaciens C58 uppvisade en signifikant fördröjningsfas under de första 16 timmarna av kultivering, följt av en väldigt stabil tillväxt när samkulturerades med A. thaliana Col-0, upp till en maximal OD 600 av ca 0,9 med utgångspunkt från 48 timmar efter inokulering. Däremot observerades väsentligen ingen bakteriell tillväxt i kontrollkulturen utan A. thaliana ( Figur 4 ). Dessa resultat tyder på att, utan ytterligare näringsämnen som levereras konstgjort, kan växtroddsekretade kemiska föreningar kunna stödja Agrobacterium- tillväxten i kultiveringssystemet för hydroponics. Den signifikanta fördröjningsfasen under de första 16 timmarna av kultivering kan tillskrivas den ganska komplexa värduppfattningen och gradvis rotsekretion vid kultivering med patogenen. </ P>
Kokultiverade A. thaliana- växter visade inga sjukdomssymptom under de första 3 dagarna, i förhållande till kontrollplantor odlade i frånvaro av A. tumefaciens ( Figur 5a , 5b ). Efter 5 dagars odling blev skillnaderna emellertid gradvis synliga och de mock-behandlade kontrollplantorna var grönare och hälsosammare. Efter 7 dagar odling med Agrobacterium visade växtvävnad kloros och nekros, liksom tidigt blommande ( Figur 5c, 5 d ). Tidig blomning i Arabidopsis är en allmän följd av infektion med en rad filogenetiskt olika patogener 41 , 42 .
Mikroskopisk visualisering av Agrobacterium- bindning till växtrötter
A. tumefaciens märkt med pCherry röd fluorescens lokaliserad till växtrotstrukturen med en typisk stavliknande eller trådformad form, ungefärlig 0,5 μm i bredd och 3-5 μm i längd ( Figur 6 ). De flesta bakteriecellerna fästes vertikalt på ytan av rotcellväggen, i enlighet med tidigare upptäckter att Agrobacterium binder till cellväggen på ett polärt sätt 32 .
Dessa resultat tyder på att det hydroponiska kultiveringssystemet kan användas för att studera bakteriedynamik i plantan , såsom bindning till rotstrukturen och infektionsprocessen, i realtid. I själva verket, i frånvaro av andra mikrober, ger detta kultiveringssystem en ljudfri plattform för direkt observation av bakterieplantaanslutning i planta . Aktivering av Agrobacterium virulens transkript
Efter 8 timmars samkultivering skördades A. tumefaciens- celler för RNA-isolering och transkriptionsnivåerna för de representativa virulensgenema utvärderades med qRT-PCR ( Figur 7 ). Expressionen av virulensgenerna ropB, virA, virDl, virH1, virE0 och chvG uppstod signifikant under samodling med växtvärden jämfört med kontrollen utan A. thaliana . Specifikt ökade mRNA-mängden med 100% för chvG , med 70% för virD1 , med 94% för virA , med 40% för virE0 , med 330% för ropB och med 48% för virH1 .
Dessa resultat tyder på att utan supplemeNtation med syntetiska virulensinducerande kemikalier, växtsekretande kemikalier i det hydroponiska kultiveringssystemet kan aktivera Agrobacterium virulensprogrammering. Induktionen av Agrobacterium virulensgener är indicativ för Agrobacteria- svaret på växt-härledda signaler i det hydroponiska kultiveringssystemet. Det är väldigt intressant att Agrobacterium ropB och chvG induceras vid odling med Arabidopsis, eftersom tidigare studier har indikerat att dessa gener induceras av sura betingelser 18 , men inte av acetosyringon, en välkänd virulensinducerande förening 19 . Detta resultat antyder att oidentifierade föreningar från Arabidopsis- rötter kan framkalla ropB- och chvG- uttryck. Sådana virulensinducerande kemikalier måste emellertid identifieras ytterligare.
Figur 7. Aktivering av Agrobacterium Virulence i Hydroponic Cocultivation System. MRNA-nivåerna av sex Agrobacterium virulensfaktorer mättes kvantitativt med qRT-PCR. Överflödet av virulensfaktor-transkript normaliserades till det hos 16S-rRNA-transkriptionerna. Data representerar medelvärdet ± standardavvikelse (felstänger) av 3 biologiska replikat, med P- värden erhållna genom studentens t-test.
Uttryck av växtutskrifter
QRT-PCR-analys utfördes för fem gener som tidigare visade sig vara differentiellt uttryckta i A. thaliana (opublicerade data). Som förväntat bekräftade qRT-PCR att AGP 30 (AT2G33790) och NAS 1 (AT5G04950) nedreglerade (med 97 respektive 89%) medan HSP21 (AT4G27670), PGIP 1 (AT5G06860) och ELIP 1 (AT3G22840) uppreglerades (med 3 800, 540 respektive 510%) i var och en av de 3 replikaten jämfört med kontrollerna ( Figur 8 ).
Figur 8: qRT-PCR av A. thaliana Root Transcripts. Överflödet av varje mRNA-transkript normaliserades till det för At ACTIN II-transkript. Uppgifterna är medelvärdena för 3 biologiska replikat ± standardavvikelsen (felstänger), med P- värden erhållna genom studentens t-test.
Förändringar av värdsekretionsprofiler
Röt-härledda föreningar har visat sig i stor utsträckning skilja mellan växtarterna 6 , 8 . roOt-exudater inkluderar molekylära signaler som framkallar olika signalreaktioner under växt-mikrobe-interaktionerna 1 , 43 . Progressiva skillnader i värdsekretionsprofiler över tiden efter mikrobeinteraktion är emellertid långt mindre förstådda, förutom att rotutsöndrade föreningar är nödvändiga för attraktionen av fördelaktiga bakterier 29 . Efter 72 timmars odling med A. tumefaciens C58 fastställdes skillnader i A. thaliana Col-0-sekretprofiler med användning av positiv jonläges-LC-MS-analys och jämförelser med ej inokulerad A. thaliana Col-0 ( dvs i frånvaro av Agrobacterium ). Ett tydligt skift i sekretomen observerades, med nya föreningar som framkom som ett resultat av Agrobacterium- inokulering ( Figur 9 ). Sammantaget förbättrades 35 föreningar jämförelsevis i sekretomen av Agrobacterium- inokulerad planTs, medan 76 förbättrades i sekretomen hos icke-inokulerade växter ( Figur 9 ). De senare representerar sannolikt föreningar som A. tumefaciens C58 skulle mötas före infektion. Fastän dessa föreningar inte identifierades och skillnadssekretionen av specifika rot-härledda föreningar inte bestämdes inom ramen för denna studie visade sekretomenalysen detekterbara skillnader i värdsekretionsprofiler med användning av detta hydroponiska odlingssystem.
Figur 9: A. thaliana Col-0 Root Secretome Analysis. Analys av A. thaliana Col-0-sekretprofiler avslutades i triplikat för mock-inoculated och inoculated samples. Toppvärden för de 138 unika masssignalerna (föreningar) som hittades i utsöndringsprofilerna i varje behandlingsgrupp var genomsnittliga ochMedelvärdena användes för att beräkna skillnaden i överflöd av varje förening (mock-inoculated minus inoculated) för att visualisera skillnader i detekterbara föreningar. Föreningar med stora negativa skillnadsvärden var mer rikliga i sekretomen hos inokulerade växter, medan de med stora positiva skillnader var mer rikliga i sekretomen hos mock-inoculated plants.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med tanke på den gradvisa karaktären av rotsekretion förekommer koncentrationen av virulensinducerande kemikalier som produceras i plantan och deras effekter på dynamiska växelmikro-interaktioner i rumsliga och temporala gradienter. I detta hydroponiska samodlingssystem kompletteras ingen syntetisk fytohormon eller kemikalie som inducerar mikrobiell virulens eller växtskydd. I motsats härtill skapar tillsatsen av syntetiska kemikalier, såsom acetosyringon, en plötslig artificiell spik i koncentrationer med konventionella tillvägagångssätt. Därför härmerar detta hydroponiska kultiveringssystem mer noggrant den naturliga miljön, där mikrober och värdväxter känner igen och svarar på rumsligt och tidsmässigt sätt.
Här var det möjligt att visa att Agrobacterium virulensgener aktiverades vid samodling med Arabidopsis . Detta tyder på att naturliga växtgenererade kemikalier inducerar Agrobacterium virulens. Framtida eFfort behövs för att identifiera dessa kemikalier och för att verifiera huruvida virulensinducerande förening acetosyringon är bland dem. Vidare observerades väsentliga förändringar av Arabidopsis- rotgenuttryck och sekreta profiler vid odling med Agrobacterium , vilket demonstrerade potentialen hos det hydroponiska kultiveringssystemet för att studera växtvärdesreaktioner och utsöndringsprofiler under växtmikro-interaktioner. Genom att använda den hydroponiska kultiveringsmetoden kan genuttryck och sekretsprofiler av växtvärdar studeras vid vilket som helst stadium som leder fram till och efter mikrobiell interaktion, vilket kommer att bidra till att belysa hur dessa transkriptionella eller sekreta förändringar underlättar eller avskräcker efterföljande växt-mikrobe interaktioner .
Förutom att studera Arabidopsis- Agrobacterium- signaleringen, kan det hydroponiska odlingssystemet anpassas för att studera andra viktiga växtmikrosystem. Det kan användas tillBelysa växtresponser på ett stort antal patogena eller fördelaktiga mikroorganismer, som verkar individuellt eller kollektivt, och studerar mikrobiell bindning och svar på olika växtvärdar i relativt "naturliga" förhållanden. Behållandet av typiskt plantmorfologi är viktigt för att klargöra molekylära växter mellan mikro och växter. När det gäller andra bakterier, svampar eller herbivoriska patogener kan ytterligare näringsämnen kompletteras för att stödja mikrobiell tillväxt under odlingen.
Det finns emellertid några parametrar att överväga för odling med olika växtmikro-system. Beroende på utsädesstorlek och rotmorfologi kan metallnät med större hål och en större tillväxtbehållare krävas för större frön och plantor för att säkerställa att rotstrukturerna utvecklas fullt under maskytan och att skottvävnaderna sprider sig ovanför. Inställningen kan också behöva ändras för att inkludera en högre plattform. Detta kan uppnås bY skär en större kvadrat av nät och böja den längre från hörnen, för att höja meshytan högre från behållarens botten eller genom att skära nätet i form av ett grekiskt kors och böja varje flik vid inskärningarna. Naturligtvis finns det begränsningar för varje system, och den som presenteras här kommer inte att vara användbar för större växter som odlas i längre perioder ( t.ex. mogen majs). Dessutom kan vissa organismer kräva mer luftning än det som tillhandahålls av skakningar vid användning av detta system.
Visserligen är det mycket svårt eller till och med omöjligt att designa ett system i ett laboratorium som exakt och perfekt replikerar de dynamiska växtmikro-interaktionerna som uppträder i naturen. Även om den hydroponiska kultiveringen närmare representerar naturliga förhållanden i rhizosfären, åtminstone konceptuellt, med intakta rotstrukturer och plantmorfologi, finns det inga jord- eller jordmikroorganismer i systemet. Detta system kan dock anpassasFör att möta olika behov, såsom att studera mikrobiomer i en kontrollerbar miljö och att lära sig hur växter eller mikrober uppfattar och svarar mot olika biotiska eller abiotiska stimuli. Detta hydroponiska odlingssystem kan också underlätta förståelsen av mikrobiomer och deras funktioner i hydroponics eller ekosystem. Detta är mycket viktigt för sjukdomshantering och växtskydd för den hydroponiska växthusindustrin eller för akvatisk ekologi hos växter och mikrober.
Dessutom kan detta hydroponiska odlingssystem anpassas för att studera bioremediering och att belysa relevanta metaboliska processer och reglerande vägar i mikrober eller växter. Dessutom underlättar detta hydroponiska odlingssystem undersökningen av effekterna av redan existerande (allelokemikalier) och / eller applicerade (syntetiska) näringsämnen och kemiska signaler / föreningar på mikrober eller växtvärdar 44 . Tillgången till indirekt påverkan på växtvävnader ( dvs.0; Blad, skott) i det hydroponiska kultiveringssystemet ger möjlighet att utforska andra växtskyddande processer, såsom växtpriming, och hur dessa signaler transduceras.
Den mest kritiska delen av detta samodlingssystem är att förhindra förorening. I synnerhet måste överföringen av växter från det halvfasta mediet till tanken ske mycket noggrant för att förhindra förorening av det hydropiska mediet. Det är därför nödvändigt att detta försökssteg genomförs under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp, och experimenter måste vänta 2-3 dagar efter överföringen innan några mikroorganismer inokuleras för experimentet.
Sammanfattningsvis förbättrar det hydroponiska kultiveringssystemet olika begränsningar av konventionella tillvägagångssätt genom upprätthållande av typisk växtmorfologi och integriteten hos växtrotstrukturer under hela experimentprocessen. Dessutom undviker systemet supplementatetPå syntetiska kemikalier, såsom växthormoner eller försvars- / virulensinducerande kemikalier. Således mimar den närmare den naturliga miljön, där mikrober och värdväxter känner igen och svarar på rumsligt och temporärt sätt. Detta kultiveringssystem kan anpassas för att studera olika växtmikrosystem i mer "naturliga" och hanterbara förhållanden, inklusive med endofytiska eller epifytiska mikrober. Olika aspekter av växelverkan i plantan , såsom patogenes, symbios eller växttillväxt, kan undersökas. Det hydroponiska odlingssystemet kan erbjuda nya insikter i de fysiologiska, biokemiska och molekylära reaktionerna hos både växter och mikrober. Vid varje given tidpunkt / intervall eller tillväxtstadium kan bakterier eller växter som odlas i det hydroponiska odlingssystemet samplas separat för olika "omics" -analyser, inklusive växt- och mikrobiell transkriptomik, växt- och mikrobiell metabolomik, växt- och mikrobiell sekret och bioremediatpå. Dessutom kan detta hydroponiska samodlingssystem anpassas för att studera växelverkan mellan växtvärdar och mikrobiomer i en kontrollerbar miljö. Sammanfattningsvis exemplifierar fördelarna med den hydroponiska kultiveringen ett överlägset system för att avslöja molekylär växt-mikrobe interaktion och signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Brian Weselowski och Alexander W. Eastman för deras hjälp och användbara diskussioner. Vi vill också tacka Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui och Greg Thorn för deras hjälp, användbara diskussioner och kritisk läsning av manuskriptet. Denna forskning finansierades av Agriculture and Agri-Food Canada, Growing Forward-AgriFlex (RBPI nummer 2555) och Growing Forward II-projekt nummer 1670, som författarna utför som en del av sina uppgifter. Denna studie finansierades också delvis av Canadian Science and Engineering Research Council (NSERC) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 tilldelad ZC Yuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) | University of Washington | N/A | |
| labeled bacteria | in-house | optional, depends on downstream analyses | |
| vortex | (various) | ||
| microcentrifuge tubes | (various) | ||
| microcentrifuge | (various) | ||
| 5% sodium hypochlorite | (various) | ||
| double distilled water | (various) | ||
| autoclave | (various) | ||
| micropipette | (various) | ||
| 70% ethanol | (various) | ||
| Murashige and Skoog (MS) basal salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| sucrose | (various) | ||
| MES | (various) | ||
| B5 vitamin mix | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| phytoagar | (various) | ||
| Deep Petri dishes | (various) | ||
| stainless steel mesh | Ferrier Wire Goods Company Ltd | N/A | grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01 |
| micropore tape, 1" | 3M | 1530-1 | |
| diurnal growth chamber | (various) | ||
| cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm | Pyrex | 3250 | other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment |
| flow hood | (various) | ||
| forcepts | (various) | ||
| yeast extract | (various) | ||
| tryptone | (various) | ||
| MgSO4 | (various) | ||
| shaking incubator | (various) | ||
| spectrophotometer | (various) | ||
| NaCl | (various) | ||
| shaker | (various) | ||
| scissors | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| fluorescence microscope | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| microscope slides and cover slips | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nail polish | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| Bacterial RNA extraction kit | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 or 74904 | optional, depends on downstream analyses |
| material and equipment for qRT-PCR | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for microarray analysis | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| liquid nitrogen | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| mortar and pestle | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 0.2 µm pore filter | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 50 mL conical tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| freeze dryer | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| sealable test tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| ethyl acetate | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nitrogen gas | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for HPLC | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for ESI-TOF-MS | (various) | optional, depends on downstream analyses |
References
- Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
- Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
- Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Zhang, J., Zhou, J. -M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
- Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
- Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
- Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
- Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Binns, A. N., Costantino, P. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Springer International Publishing AG. Cham, Switzerland. (1998).
- Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. Lindsey, K. , Harwood Academic. Amsterdam, Netherlands. (1998).
- Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283 (1999).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- Gelvin, S. B.
- Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322 (2014).
- Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
- Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
- Yuan, Z. -C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
- Yuan, Z. -C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
- Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
- Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
- Veena,, Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
- León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J.
- Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
- Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
- Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
- Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252 (2014).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69 (2014).
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4 (2013).
- Nathoo, N. Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , University of Western Ontario. (2015).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
- Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
- Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
- Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699 (2015).
- Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
- Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).
