Summary
Kvantificering af donor-afledte celler er forpligtet til at overvåge engraftment efter stamcelletransplantation hos patienter med hemoglobinopathies. En kombination af flow flowcytometri-baserede celle sortering, koloni dannelse assay og efterfølgende analyse af korte tandem gentagelser kan bruges til at vurdere spredning og differentiering af stamfaderen i erythroid rum.
Abstract
Tilstedeværelsen af ufuldstændige kimærisme bemærkes, i en stor del af patienterne efter knoglemarvstransplantation for thalassemia større eller seglcelleanæmi. Denne observation har enorme konsekvenser, som efterfølgende terapeutiske immunomodulation strategier kan forbedre kliniske udfald. Konventionelt, bruges polymerase kædereaktion-baseret analyse af korte tandem gentagelser til at identificere kimærisme i donor-stammer blodlegemer. Men denne metode er begrænset til nukleeret celler og kan ikke skelne mellem dissocierede encellede lineages. Vi anvendes analyse af korte tandem gentagelser til flow cytometric-sorteret hæmatopoietisk stamceller og sammenlignede dette med analyse af korte tandem gentagelser fremstillet af udvalgte burst-dannende enhed - erythroid kolonier, både indsamlet fra knoglen marv. Med denne metode er vi i stand til at demonstrere forskellige spredning og differentiering af donor celler i erythroid rum. Denne teknik er berettiget til at fuldføre nuværende overvågning af kimærisme i stamcelletransplantation indstilling og dermed kan blive anvendt i fremtidige kliniske studier, forskning i stamceller og design af gene therapy forsøg.
Introduction
Allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) er den eneste tilgængelige helbredende tilgang til en række medfødte genetiske sygdomme af hæmatopoietisk systemet, at opnå sygdomsfri overlevelsesrater på mere end 90%, for ellers stærkt kompromitteret og begrænset levetid patienter1. Effekten af dette vigtigt terapeutisk redskab er optimeret ved at begrænse toksiciteten af pre- og efter transplantationen regimer2, men også af interventionerne sigter mod at opretholde stabile graft funktion, som skal være talbestemt ved nøje overvågning af donor-afledte celler3,4,5.
I almindelighed, indebærer komplet kimærisme (CC) den samlede udskiftning af lymphohematopoietic til kabinen af donor-afledte celler, hvorimod udtrykket blandet kimærisme (MC) bruges når donor - og modtager-afledte celler findes samtidig i forskellige proportioner. Split kimærisme (SC) betegner sameksistensen af blandet kimærisme observeret i encellede slægter, som i erythroid rum. Hurtig bestemmelse af kimærisme status efter HSCT er kritisk, da det kan hjælpe med at identificere patienter modtagelige for sygdom tilbagefald og indlede efterfølgende immunmodulerende strategier, som donor lymfocytter infusioner eller reduktion af immunosuppressive behandlingsformer6.
Flere metoder er blevet udviklet for at overvåge engraftment efter HSCT. Isotyping af immunoglobuliner og analyse af cytogenetisk har ringe følsomhed og er begrænsede i deres evne til at detektere polymorfi7,8. Indførelsen af fluorescerende i situ hybridisering (FISH) kan øge følsomheden i kimærisme overvågning efter HSCT, men er begrænset til sex-uoverensstemmende allografts9. I øjeblikket, polymerase kædereaktion (PCR) er den mest udbredte metode til at registrere kimærisme og er baseret på konventionelle Agarosen-acrylamid gelelektroforese af variable number tandem gentagelser (VNTRs) eller korte tandem gentager (mistænkelige). Rutinemæssigt anvendes er kvantitativ PCR købedygtig opdager en meget lille del af de resterende donor celler efter HSCT. De store begrænsning af undersøgelserne hidtil er at MC opdagelse er næsten udelukkende begrænset til tilstedeværelsen af nukleeret celler i stedet for modne erythrocytter, nemlig celler at funktionelt afgørende for patienter påvirkes af hemoglobinopathies. Hos patienter med forskellige blodtyper er det værd at huske at cytofluorometric analyse er købedygtig identificere kimærisme i røde blodlegemer ved hjælp af monoklonale antistoffer rettet mod erytrocyt antigener ABO og C, c, D, E og e10 , 11. en anderledes, men meget interessant middel til vurdering af kimærisme i erythroid afstamning er kombinationen af flow cytometric sortering af erythroid ophav og udsnit af forskellige erythroid stamfader ved dyrkning i clonogenic assays, efterfulgt af en analyse af STR12. Denne tilgang er i stand til at kvantificere relative proportioner af donor-versus-modtageren kimærisme i erythroid rum og kan udnyttes i strategien for at opretholde knoglemarv graft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolation af hæmatopoietisk knoglemarv celler af multi-parameter-fluorescens-aktiveret celle sortering
- prøve farvning
- før du starter processen, de følgende punkter skal indsamles og rede:
- Gradient medier til fremstilling af mononukleære celler (GM), 50 mL konisk rør
- 12 x 75 mm flow rør til farvning celler
- farvning buffer: fosfatbufferet saltopløsning (PBS) + 3% føtalt kalveserum (FCS)
- pipetter < / l Jeg >
- FC blok og farvning antistoffer (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Med denne fluorokrom kombination der er ubetydelig afsmitning til andre kanaler, men enhver anden egnet fluorokrom kombination er også mulige.
- Kompensation perler (hvis nødvendigt)
- Suspension buffer: Hank ' s Balanced Salt løsning (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
- Trypan blå og hemocytometer
- Indsamling rør: ethvert rige medium med høje serum rør (indeholdende 1 mL FCS + 25 mM HEPES) kan bruges til indsamlingen af sorterede celler.
- Knoglemarven prøve: informeret samtykke til knoglemarvsbiopsi fra hoftebenskammen af bagsiden af hoftebenet er typisk kræves. Knoglemarven prøven er holdt i heparinized sprøjter på RT indtil farvning. Følgende protokol trin udføres i overensstemmelse med retningslinjerne i institutionen ' s menneskelige videnskabsetisk Komité for menneskelig velfærd.
- Generere en enkelt cellesuspension af knoglemarven prøven. Tilføj 3 mL af GM til centrifugeglasset. Omhyggeligt layer 4 mL af enkelt cellesuspension på GM-løsning. Der centrifugeres ved 550 g i 30 min. ved 20 ° Celsius (C) (bremse er slukket). Trække i det øverste lag, der indeholder plasma og trombocytter ved hjælp af en steril pipette, forlader den mononukleære cellelag uforstyrret på grænsefladen. Overføre lag af mononukleære celler til en steril centrifugeglasset ved hjælp af en steril pipette.
- Efter vask med 5 mL farvning buffer, resuspend celler i 2 mL suspension bufferen og bestemme den celle koncentration. Sted 5 µL af cellesuspension i et skruelåg reagensglas. Tilføje 95 µL af 0,2% Trypan blå plet. Blandes grundigt. Lad den stå i 5 min ved stuetemperatur. Udfylde en hemocytometer for celle optælling. Under et mikroskop, observere hvis ikke-levedygtige farves og tælle de levedygtige celler.
- Centrifugeres celler ved 250 g i 10 min. ved 20 ° C, supernatanten og resuspend celler i farvning buffer i en koncentration på op til 1 x 10 6 pr. 100 µL.
- Blok FcR ved brug af 2,5 µg Fc blok pr. 1 x 10 6 celler i isbad i 10-15 min.
- Tilføj den passende kombination af 10 µg mAb pletten 1 x 10 6 celler og Ruger i 20 min. ved 4 ° C i mørke, efterfulgt af en vask skridt med 3 mL farvning buffer. For korrekt kompensation farves små prøver af de celler (eller helst kompensation perler) med enkelt antistoffer hver; en alikvot resterende unstained.
- Justere koncentrationen til 20 x 10 6 celler/mL.
- Sæt op og optimere celle sorteringsanlæg. Processen med oprettelse af et flow Flowcytometret og software er standardiseret med en detaljeret instruktion fastsat af selskabet og skal udføres af passende uddannet personale.
- før du starter processen, de følgende punkter skal indsamles og rede:
- Sortering på celle sorteringsanlæg
- forberede indsamling rør fra trin 1.1.1.9.
- Oprette en skabelon, der indeholder en bivariate plot til at vise forward scatter (FSC) og side scatter (SSC).
- Køre cellerne og justere FSC/SSC for at placere befolkning af interesse på skalaen
- Optage negativ kontrol tube.
- Køre enkelt positiv kontrol rør; registrere data for hver tube.
- Beregning af kompensationen enten manuelt eller automatisk med funktionen forudsat erhvervelsen software.
- Erhverve den eksperimentelle prøve og gate dem på en bivariate FSC/SSC dot plot ( figur 1A) til at omfatte både lymfatisk og myeloide celler. Udelukke dubletter og aggregater ved at sammenligne de forskellige signaler af FSC (dvs., højde, bredde og område) ( figur 1B). Visualisere en bivariate dot plot viser CD45 og CD36 singlet cellerne ( figur 1 c). Begivenheder positive for CD45 er leukocytter (herunder deres ophav), de negative for CD45 og positiv for CD36 er erythroid ophav. Bruge gating værktøjer til at definere CD36 + (hvis ønskes, disse celler kan opdeles yderligere i CD36 højt og lavt udtrykte celler) og CD45 + celler. Visualisere CD45 + begivenheder i en anden dot plot viser CD34 og SSC parametre. Brug gating værktøjer for at definere CD34 + celler (leukocyt stamfaderen) og SSC høj celler (myeloide celler på forskellige stadier af differentiering).
- Når gates har været bestemt, porte kan vælges til sortering i eksterne indsamling rør.
- Fortsæt med sortering ved 4 ° C indtil det krævede antal celler er opnået
- Udføre en post slags analyse for at bestemme renheden af de sorterede cellepopulationer ( figur 1E, 1F).
2. Clonogenic analyse
- forberedelse af reagenser
før du starter processen, følgende elementer skal være indsamlet og udarbejdet:- pipetter, 100 mm plader
- Trypan blå og hemocytometer
- rekonstruere humane rekombinante erythropoietin (EPO) på 500 U/mL i sterilt PBS, som indeholder mindst 0,1% human serum albumin. Opdele denne løsning i små prøver og holde på-20 ° C for at undgå gentagne fryse-tø.
- Forbered komplet Iscove ' s ændret Dulbecco ' s Medium (IMDM) med endelige koncentrationer af 5% FCS, 2 mM glutamin, 100 enheder/mL Penicillin/Streptomycin (PS). Tilføje humane rekombinante erythropoietin (EPO) ved forskellige koncentrationer i separate brønde til komplet IMDM medium: 3 enheder EPO/nå, 6 enheder EPO/brønd og 12 EPO enheder/brønd (1 x, 2 x, 4 x EPO henholdsvis).
- Forberedelse af knoglemarv celler
- 10 mL af knoglemarven prøven fortyndes med 20 mL PBS er langsomt lag oven på 15 mL tæthed gradient medium i en 50 mL konisk slange, opretholde klar grænseflade mellem de to faser og du nder sterile forhold. Derefter centrifugeres 15 mL konisk rør på 550 x g i 30 min. ved stuetemperatur (RT) med som 9-acceleration og deceleration indstillet som 0 (eller bremse OFF).
- Efter centrifugering, fjerne grænsefladen i en ny 50 mL tube og tilføje PBS til en endelige rumfang paa 50 mL.
- Efter centrifugering med 250 g i 10 min. ved 10 ° C fjernes supernatanten og resuspend celler i komplet IMDM medium på ca 0,5 x 10 6 celler/mL. Tages en microtube 10 µL af cellesuspension, blandes med den samme mængde af Trypan blå løsning (0,4%) og tæller ved hjælp af en hemocytometer.
- Optional: CD34 + celler er beriget af magnetiske celle sortering med Milteny CD34 perler efter anvisningerne af fremstillingen. Den største fordel ved denne berigelse trin er at registrere kvaliteten af hæmatopoietisk stamceller, der dyrkes på en semi-solid matrix tilføjet med 50 ng/mL stamcelle faktor (SCF), 20 ng/mL granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), 20 ng/mL interleukin-3 (IL-3), 20 ng/mL interleukin-6 (IL-6), 20 ng/mL granulocyt koloni-stimulerende faktor (G-CSF), og 3 forskellige koncentrationer af EPO som 1.4.
- Fortyndes celler til 0,1 - 0,15 x 10 6 mononukleære celler/mL eller 2 x 10 3 CD34 + celler/mL ved at tilføje komplet IMDM medium suppleret med EPO og overførsel 300 µL til 3 mL Methocult H4434 medium. Efter agitation og en kort inkubation i 5 min plade tre gange 1,1 mL på en 35 mm parabol. To af disse kultur retter sammen med en tredje - fyldt med vand - er placeret i 100 mm plader.
- Celler er kulturperler i en fugtig 37 ° C kuvøse med 5% CO 2 til 14 dage.
- Analyse af kolonier
- kolonier er scoret efter deres morfologi med en inverteret mikroskop på 40 X forstørrelse i en kultur parabol er markeret med en scoring gitter. Med henblik på vores assay koloni danner enheder (CFU) er inddelt i 4 kategorier: multipotential stamceller (CFU-CLAUSS), granulocyt-makrofag stamceller (CFU-GM), brast-dannende enhed-erythroid (BFU-E) og kolonidannende enhed-erythroid (CFU-E). Se producent ' s instruktioner for yderligere koloni underklassifikation.
- For yderligere analyse, celler fra CFU assay plade er inddrevet separat efter de 4 kategorier ved at suspendere i stuetemperatur 4 mL PBS, som indeholder 2% FCS/IMDM. Efter centrifugering ved 400 g i 10 min. ved 4 ° C, cellerne er genopslemmes i PBS, tælles, og forarbejdet til DNA-ekstraktion.
3. Analyse af kimærisme
- DNA isoleret
- sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 400 g i 10 min.
- Isolere DNA ved hjælp af en blod DNA udvinding kit (QIAmp DNA blod udvinding kit). Pre varm eluering buffer (AE) ved 37 ° C til at forbedre udbyttet af elueret DNA.
- Måle DNA-koncentrationen med Nanodrop ND-1000 spectra fotometer. Prøver med OD 260/280 mellem 1,8-2,0 der bruges til yderligere analyse.
- Fortyndes DNA med DNAase gratis H 2 O til 0,1 ng/µL i en samlet maengde paa 50 µL.
- STR-analyse
- oprettet PCR reaktion ved at blande mastermix, AmplTaq guld DNA Polymerase og Profiler Plus Primer sæt med 20 µL genomisk DNA (0,1 ng/µL) Ifølge manualen (primer kit indeholder den umærkede primere i buffer til at forstærke STR loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, og D7S820 og køn markør amelogenin). Omfatte nukleasen-gratis vand som negativ kontrol og 9947A som positiv kontrol. En forudgående DNA fra donors og recipients er også inkluderet.
- Udføre PCR reaktion ved hjælp af Eppendorf mastercycler gradient med følgende betingelser: 95 ° C for 11 min, 28 forstærkning cyklusser af 95 ° C i 1 minut, 59 ° C i 1 min og 72 ° C i 1 min, efterfulgt af 60° C i 45 min.
- Sæt op fragment analyse reaktion ved at tilføje 12 µL Hi-Di Formamid og 0,5 µL GeneScan 500 ROX størrelse Standard (alle anvendes Biosystems) til 1 µL PCR produkt. På første og sidste position er behov for en allel stigen (Genotyper Amp Fl STR blå, grøn II og gul, anvendes Biosystems).
- Start elektroforese og erhvervelse med elektroforese instrument.
- Analysere Loci, alleler og tophøjder af prøver og kontroller med software 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adskillelse af lymphohematopoietic ophav af FACS celle sortering
Her viser vi resultater fra sortering de nødvendige cellepopulationer for downstream STR analyse. Knoglemarv celler var plettet med V450-konjugerede anti-CD45, FITC-konjugeret anti-CD36 og APC-konjugerede anti-CD34. Befolkningens interesse er de megakaryocyte erythroid ophav (MEP), nukleeret celler ansvarlig for udviklingen af erytrocytter. Disse celler express CD36, men er negative for leukocyt fælles antigen CD45 (figur 1 c). Hvis det er nødvendigt, kan disse celler yderligere differentieres baseret på deres CD36 udtryk niveau. Flere ekstra befolkninger kan sorteres for at tjene som kontrol. Vi sorteret CD45 + CD34 + lymfoide/myeloide prækursorer som en anden stamfader celle befolkning og CD45 + celler med høj SSC signal som modne myeloide celler (fig. 1 d). Sortering blev udført med en BD FACSAria jeg instrument. Efter sortering, erythroid stamfader celle renhed var > 85% (figur 1E) og myeloide celler renhed var > 95% (figur 1F).
Figur 1 . Sortering af Erythroid stamceller og myeloide stamceller efter FACS. Figur 1A/1B viser på FSC-A vs SSC-A, FSC-H vs FSC-A og brugen af en polygon gate værktøj at vælge befolkningens interesse. 1 C angiver MEP på CD45 vs CD36; 1 D viser modne myeloide celler. Procentdelen af positive celler i 1E og 1F er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Generation af burst-dannende enheder - erythroid kolonier
Nogle celler stammer fra knoglemarven og adskilt af CD34-specifikke magnetiske perler synes at formere sig og differentiere. Efter en 14-dages inkubationstid på de halvfaste mellemstore kolonier er dannet. Stimulation med forskellige koncentrationer af EPO augmented stærkt dannelsen af fremtrædende rød (erythroid) kolonier (figur 2).
Figur 2. Generation af en Burst-dannende enhed-erythroid (BFU-E). Vist er en repræsentativ energibesparende photomicrograph af en BFU-E koloni. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| MNC: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| CFU-E | 2 | 2 | 2 |
| BFU-E | 9 | 10 | 8 |
| CFU-GM | 30 | 30 | 29 |
| CFU-CLAUSS | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ celler: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| CFU-E | 1 | 1 | 0 |
| BFU-E | 5 | 11 | 6 |
| CFU-GM | 25 | 26 | 32 |
| CFU-CLAUSS | 0 | 2 | 3 |
Tabel 1. Analyse af kolonier i usorterede knoglemarv celler og CD34 + markerede celler. Kolonier er scoret efter deres morfologi med en inverteret mikroskop på 40 X forstørrelse i en kultur parabol er markeret med en scoring gitter. Med henblik på vores analyse kolonierne, der er klassificeret i fire kategorier: kolonidannende enhed-erythroid (CFU-E), burst-dannende enhed-erythroid (BFU-E), granulocyt-makrofag stamceller (CFU-GM) og multipotential stamceller (CFU-CLAUSS).
Analyse af kimærisme
Kimærisme analyse udføres ved hjælp af AmpFlSTR Profiler Plus Kit (anvendt Biosystems, California) efter producentens protokol på ABI prisme 310 genetiske Analyzer (anvendt Biosystems, California). Analysen er udført med GeneMapper Software (anvendt Biosystems, California). Loci D21S11, D7S820, FGA og vWA blev brugt til at beregne resultater (procentdel af modtager og donor-specifikke DNA).
| Stikprøve | Modtagerens DNA | Donor DNA |
| CD45 | 25% | 75% |
| CD36hi | 25% | 75% |
| CD36lo | 55% | 45% |
| CD34 | 25% | 75% |
Tabel 2. Procent modtager og Donor DNA i celler fremstillet af fluorescens-aktiveret celle sortering af knoglemarv celler. Kimærisme donor celler i specifikke cellulære lineages af lymphohematopoietic rum er givet.
| Stikprøve | Modtagerens DNA | Donor DNA |
| BM-MNC | 24.71% | 75.29% |
| BM-CD34 |
Tabel 3. Procent modtager og Donor DNA i celler fra Clonogenic Assay. Kimærisme donor celler i specifikke cellulære lineages af lymphohematopoietic rum er givet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med den aktuelle undersøgelse er at give publikum en kombination af to tilgange til analyse af donor/recipient kimærisme i erythroid progenitorceller efter HSCT hos patienter behandlet for hemoglobinopathies: 1.) Fluorescens-aktiveret celle sortering af hæmatopoietisk stamceller i knoglemarven prøver efterfulgt af en analyse af korte tandem gentagelser og 2.) kolonidannende enhed vokser af knoglemarv celler, klassificering af kolonier i forskellige stamfader typer efterfulgt af en analyse af korte tandem gentagelser. Nyhed af denne tilgang ligger i kombinerer teknikker i en protokol til at evaluere donor/recipient kimærisme i enkelte kolonier.
Den særlige betydning af denne tilgang kan findes i forbindelse med blandet kimærisme efter HSCT for patienter behandlet for hemoglobinopathies. Flere undersøgelser har vist, at en betydelig andel af patienter udtrykke en lav procentdel af donor myeloide celler, der korrelerer med at af erythroid forløber celler und resulterer i langvarig stabil blandet hæmatopoietisk kimærisme3, 11; derimod i de samme patienter en høj procentdel af donor-stammer røde blodlegemer (2 til 5 gange højere end i modne leukocytter) er noteret og tyder på, at de ineffektive erythropoiesen finder sted på et senere stadium af erythroid udvikling. Disse bemærkninger er blevet tilskrevet tilbøjelighed for accelereret apoptose i donor erythroblasts og persistens af T og B resterende lymfocytter ansvarlige for at tillade en blandet allograft14,15. I forbindelse med immunomodulation efter hæmatopoietisk stamcelletransplantation vi for nylig vist, at ændring af immunsupprimerende behandling efter hæmatopoietisk transplantation ß-thalassæmi resultater i en selektiv fordel for den genetisk korrigeret erythroid rum, at give en 2 til 2.5 gange forstærkning af resterende donor stilken celler12. Denne observation understøtter hjælpeprogrammet til bestemmelse af donor-versus-resterende erythroid progenitorceller, da det giver en forståelse af dette fænomen og understøtter fremtidige kliniske forsøg at studere genterapi til behandling af hemoglobinopathies. Faktisk, kan andelen af gen-modificerede nukleeret celler for at opnå en terapeutisk niveau af cirkulerende røde blodlegemer være samme som observeret i patienter behandlet med stamcelletransplantation for hemoglobinopathies.
For at bestemme det fulde billede af donor erythropoiesen vi ændret protokollen og giver en detaljeret, trinvis eksperimenterende tilgang. Den kritiske trin i denne protokol er processen med at oprette et flow forskellige og software, som er standardiseret med detaljerede instruktioner og skal udføres af passende uddannet personale. Præsentation af vores protokol i formatet visualiseret gør det muligt for publikum at følge vores protokol nemt. Vi sammenlignet vores PCR resultater ved hjælp af genomisk DNA fra erythroid ophav fra kolonidannende enheder i BM prøver versus DNA udvundet FACS-sorteret erythroid knoglemarv stamceller. Donor engraftment data fra de to tilgange er dybest set konsekvent. Dog normalt mindre variation blev fundet i prøver fra kolonidannende enheder. Dette er sandsynligvis på grund af forbedret overlevelse af donor røde blodlegemer prækursorer i in vitro-analysen i forhold til ubehandlede og sorterede donor modstykker. I dette lys, kan denne protokol udvides ved kunstigt at skabe blandede kimære kombinationer med kendte proportioner af sunde ophav og ophav fra en vifte af patienter med forskellige hemoglobinopathies. Clonogenic analyse og vurdering af kimærisme bør nøjagtigt afspejle i læg proportioner.
Selv om en præcis forståelse af de mekanismer, der er involveret i denne særlige indstilling mangler, er den metode, der præsenteres her af afgørende betydning for at give relevante oplysninger til rutineovervågning engraftment og prognostiske oplysninger i klinisk praksis. Forsøg på at redde graft funktion er begrænset af risikoen for at udvikle graft - versus - host-sygdommen og kan være styret af serielle engraftment overvågning. Endelig, denne metode kan også udgøre et nyttigt grundlag for forskningsområder forpligtet til at forbedre plejen af patienter med hemoglobinopathies, især dem, der rammes af akut transplantat - versus host klovesyge og autoimmun sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
