Summary
दाता के ठहराव-व्युत्पन्न कोशिकाओं hemoglobinopathies के साथ रोगियों में स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के बाद engraftment पर नजर रखने के लिए आवश्यक है. प्रवाह cytometry का एक संयोजन आधारित सेल छंटाई, कॉलोनी गठन परख, और लघु मिलकर दोहराता के बाद के विश्लेषण के प्रसार और erythroid डिब्बे में progenitors के भेदभाव का आकलन किया जा सकता है ।
Abstract
अपूर्ण chimerism की उपस्थिति thalassemia प्रमुख या सिकल सेल रोग के लिए अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद रोगियों के एक बड़े अनुपात में उल्लेख किया है । इस अवलोकन जबरदस्त निहितार्थ है, के रूप में बाद में चिकित्सीय चुहियों रणनीतियों नैदानिक परिणाम में सुधार कर सकते हैं । पारंपरिक, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया-लघु मिलकर दोहराया के विश्लेषण के आधार पर दाता में chimerism की पहचान रक्त कोशिकाओं को प्राप्त किया जाता है । हालांकि, इस विधि nucleated कक्षों के लिए प्रतिबंधित है और असंबद्ध एकल-कक्ष वंश के बीच भेद नहीं कर सकता । हम लघु मिलकर दोहराता के विश्लेषण के लिए cytometric-टेम जनक कोशिकाओं के प्रवाह को लागू किया और लघु मिलकर चुना फट इकाई-erythroid कालोनियों, दोनों की हड्डी से एकत्र से प्राप्त दोहराता के विश्लेषण के साथ तुलना मज्जा. इस विधि के साथ हम erythroid डिब्बे में विभिंन प्रसार और दाता कोशिकाओं के भेदभाव का प्रदर्शन कर रहे हैं । यह तकनीक स्टेम सेल प्रत्यारोपण की स्थापना में chimerism की वर्तमान निगरानी को पूरा करने के लिए पात्र है और इस प्रकार भविष्य नैदानिक अध्ययन में लागू किया जा सकता है, स्टेम सेल अनुसंधान और जीन चिकित्सा परीक्षणों के डिजाइन ।
Introduction
Allogeneic टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (HSCT) टेम प्रणाली के अजन्मे आनुवंशिक विकारों की एक किस्म के लिए ही उपलब्ध उपचारात्मक दृष्टिकोण है, अंयथा अत्यधिक समझौता और के लिए ९०% से अधिक की बीमारी मुक्त जीवित रहने की दर को प्राप्त करने जीवन सीमित रोगियों1. इस महत्वपूर्ण चिकित्सीय उपकरण की प्रभावकारिता पूर्व और बाद प्रत्यारोपण परहेजों की विषाक्तता को सीमित द्वारा अनुकूलित किया गया है2, लेकिन यह भी स्थिर भ्रष्टाचार समारोह, जो की करीब निगरानी द्वारा मात्रा है बनाए रखने के उद्देश्य से हस्तक्षेप द्वारा दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं3,4,5.
सामांय में, पूर्ण chimerism (CC) दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं द्वारा lymphohematopoietic डिब्बे की कुल प्रतिस्थापन का तात्पर्य है, जबकि मिश्रित chimerism (MC) का प्रयोग तब किया जाता है जब दाता-और प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न कोशिकाएं एक साथ विभिंन अनुपात. स्प्लिट chimerism (SC), एकल-कक्ष वंश में स्वीकार्य मिश्रित chimerism के सह-अस्तित्व को नोट करता है, जैसे erythroid डिब्बे में । chimerism स्थिति का शीघ्र निर्धारण HSCT के बाद महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह रोग पतन के लिए अतिसंवेदनशील रोगियों की पहचान और दाता लिम्फोसाइट सुई लेनी या गुर्दे की कमी के रूप में बाद में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी रणनीतियों, आरंभ करने में मदद कर सकते है 6चिकित्सा ।
HSCT के बाद engraftment की निगरानी के लिए कई विधियाँ विकसित की गई हैं. इम्युनोग्लोबुलिन और cytogenetics के विश्लेषण के Isotyping गरीब संवेदनशीलता है और बहुरूपता7,8का पता लगाने की क्षमता में सीमित हैं । सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट की शुरूआत HSCT के बाद chimerism की निगरानी में संवेदनशीलता को बढ़ा सकती है, लेकिन सेक्स-बेमेल allografts9तक ही सीमित है । वर्तमान में, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) सबसे व्यापक chimerism का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया विधि है और पारंपरिक agarose पर आधारित है acrylamide जेल ट्रो के चर संख्या मिलकर दोहराता है (VNTRs) या कम मिलकर दोहराता है (STRs) । नियमित रूप से इस्तेमाल मात्रात्मक पीसीआर HSCT निंनलिखित अवशिष्ट दाता कोशिकाओं के एक अत्यंत छोटे अनुपात का पता लगाने में सक्षम है । अध्ययन की अब तक की प्रमुख सीमा है कि MC पता लगाने लगभग अनंय रूप से nucleated कोशिकाओं की उपस्थिति के बजाय परिपक्व एरिथ्रोसाइट्स, अर्थात् कोशिकाओं है कि hemoglobinopathies से प्रभावित रोगियों के लिए कार्यात्मक महत्वपूर्ण है सीमित है । विभिन्न रक्त समूहों के साथ रोगियों में, यह याद रखने योग्य है कि cytofluorometric विश्लेषण लाल रक्त कोशिकाओं में chimerism की पहचान करने में सक्षम है मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए निर्देशित एरिथ्रोसाइट प्रतिजनों के ऊपर और सी, सी, डी, ई, और ई10 , 11. एक अलग है, लेकिन erythroid वंश में chimerism का आकलन करने का बहुत ही दिलचस्प साधन progenitors की परख में erythroid द्वारा erythroid जनक और विभिन्न संवर्धन clonogenic प्रकारों के चयन की छंटाई cytometric प्रवाह का संयोजन है, 12STR के विश्लेषण के बाद । इस दृष्टिकोण को दाता के सापेक्ष अनुपात-बनाम erythroid डिब्बे में प्राप्तकर्ता chimerism है और रणनीति में उपयोग के लिए अस्थि मज्जा भ्रष्टाचार को बनाए रखने में सक्षम हो सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- नमूना धुंधला
- प्रक्रिया शुरू करने से पहले, निंन आइटमों को एकत्रित करने की आवश्यकता है और तैयार:
- ढाल मीडिया mononuclear कोशिकाओं (जीएम) की तैयारी के लिए, ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों
- 12 x ७५ mm प्रवाह ट्यूबों के लिए धुंधला कोशिकाओं
- धुंधला बफर: फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) + 3% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS)
- पिपेट
- एफसी ब्लॉक और धुंधला एंटीबॉडी (CD34 सुरक्ष, CD36 FITC, CD45 V450, बीडी सी साइंस). इस fluorochrome संयोजन के साथ अन्य चैनलों में नगण्य spillover है, लेकिन किसी भी अन्य उपयुक्त fluorochrome संयोजन भी संभव है.
- मुआवजा मोती (यदि आवश्यक हो तो)
- निलंबन बफर: हांक & #39; s balanced नमक समाधान (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
- Trypan नीला और hemocytometer
- संग्रह ट्यूबों: उच्च सीरम ट्यूबों के साथ किसी भी अमीर माध्यम (1 मिलीलीटर FCS + 25 मिमी HEPES) क्रमबद्ध कोशिकाओं के संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- अस्थि मज्जा नमूना: कूल्हे की हड्डी के पीछे की श्रोणि शिखा से अस्थि मज्जा बायोप्सी के लिए सूचित सहमति आम तौर पर आवश्यक है । अस्थि मज्जा नमूना से heparinized सिरिंजों में आरटी तक रखा है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल चरण संस्था के दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए जाते हैं & #39; एस मानव कल्याण के लिए मानव अनुसंधान आचार समिति.
- अस्थि मज्जा नमूना के एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करते हैं । इस केंद्रापसारक ट्यूब के लिए जीएम के 3 मिलीलीटर जोड़ें । ध्यान से जीएम समाधान पर एक सेल निलंबन के 4 मिलीलीटर परत । ५५० g पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर 20 & #176; सेल्सियस (C) (ब्रेक बंद कर दिया है) । प्लाज्मा और प्लेटलेट्स युक्त ऊपरी परत के ड्रा एक बाँझ पिपेट का उपयोग कर, mononuclear सेल परत इंटरफ़ेस पर परेशान छोड़ने. एक बाँझ पिपेट. का उपयोग करने के लिए mononuclear कोशिकाओं की परत को हस्तांतरण
- 5 मिलीलीटर धुंधला बफर के साथ धोने के बाद, 2 मिलीलीटर निलंबन बफर में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित और सेल एकाग्रता निर्धारित करते हैं । जगह 5 & #181; एक पेंच कैप टेस्ट ट्यूब में सेल निलंबन के एल । Add ९५ & #181; L का ०.२% Trypan नीला दाग. अच्छी तरह से मिलाएं । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए खड़े होने की अनुमति दें । सेल काउंटिंग के लिए एक hemocytometer भरें । एक खुर्दबीन के नीचे, निरीक्षण अगर गैर व्यवहार्य है दाग और व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती ।
- 10 मिनट के लिए २५० g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक पर 20 & #176; सी, supernatant त्यागें और कोशिकाओं को एक एकाग्रता पर धुंधला बफर में reसस्पैंड करने के लिए 1 x 10 6 प्रति १०० & #181; L.
- ब्लॉक FcR के उपयोग द्वारा २.५ & #181; छ एफसी ब्लॉक प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं के लिए बर्फ पर 10-15 min.
- 10 & #181 के उपयुक्त संयोजन को जोड़ें; g मॉब 1 x 10 6 कोशिकाओं और 20 मिनट के लिए मशीन में 4 & #176; सी अंधेरे में, 3 मिलीलीटर धुंधला बफर के साथ एक धुलाई कदम के बाद । सही क्षतिपूर्ति के लिए, कोशिकाओं के छोटे aliquots (या अधिमानतः मुआवजा मोती) एक एंटीबॉडी प्रत्येक के साथ दाग रहे हैं; एक aliquot बाँकी दाग.
- 20 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल के लिए एकाग्रता समायोजित
- सेट अप और कक्ष सॉर्टर ऑप्टिमाइज़ करें । एक प्रवाह cytometer और सॉफ्टवेयर की स्थापना की प्रक्रिया कंपनी द्वारा प्रदान की एक विस्तृत अनुदेश के साथ मानकीकृत है और उचित प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया जा करने की जरूरत है ।
- प्रक्रिया शुरू करने से पहले, निंन आइटमों को एकत्रित करने की आवश्यकता है और तैयार:
- सेल पर छँटाई सॉर्टर
- तैयार संग्रह ट्यूबों से कदम 1.1.1.9.
- आगे तितर बितर (FSC) और साइड स्कैटर (एसएससी) को प्रदर्शित करने के लिए एक bivariate प्लॉट शामिल है एक टेम्पलेट सेट करें ।
- रन कोशिकाओं और समायोजित FSC/एसएससी पैमाने पर ब्याज की जनसंख्या जगह के लिए
- रर द निगेटिव कंट्रोल ट्यूब.
- एक सकारात्मक नियंत्रण ट्यूबों भागो; प्रत्येक ट्यूब के लिए डेटा रिकॉर्ड.
- मुआवजा की गणना या तो मैंयुअल रूप से या स्वचालित रूप से अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की समारोह के साथ ।
- प्रयोगात्मक नमूना प्राप्त करने और उन्हें एक bivariate FSC/SSC डॉट प्लॉट पर गेट (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ) दोनों लिम्फोसाईटिक और माइलॉयड कोशिकाओं को शामिल करने के लिए । FSC ( यानी , ऊँचाई, चौड़ाई, और क्षेत्र) के विभिन्न संकेतों की तुलना करके दोहरी और समुच्चय को बाहर निकालें (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 1b ). किसी bivariate डॉट प्लॉट पर स्वेटर कक्षों को विज़ुअलाइज़ करना CD45 और CD36 (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 1C ) प्रदर्शित करना. CD45 के लिए सकारात्मक घटनाक्रम leucocytes है (उनके progenitors सहित), CD45 के लिए नकारात्मक और CD36 के लिए सकारात्मक erythroid progenitors हैं । CD36 + को परिभाषित करने के लिए गेटिंग टूल्स का उपयोग करें (यदि चाहें, तो इन कोशिकाओं को CD36 उच्च और कम व्यक्त कोशिकाओं में विभाजित किया जा सकता है) और CD45 + कोशिकाओं । CD34 और एसएससी मापदंडों को प्रदर्शित एक और डॉट साजिश में CD45 + घटनाओं कल्पना । CD34 + कोशिकाओं (ल्युकोसैट progenitors) और एसएससी उच्च कोशिकाओं (भेदभाव के विभिंन चरणों में माइलॉयड कोशिकाओं) को परिभाषित करने के लिए गेटिंग उपकरण का प्रयोग करें ।
- एक बार गेट्स निर्धारित किया गया है, गेट्स बाहरी संग्रह ट्यूबों में छंटाई के लिए चुना जा सकता है ।
- 4 & #176 पर छँटाई के साथ आगे बढ़ें; C जब तक कि कक्षों की अपेक्षित संख्या प्राप्त नहीं की गई है
- सॉर्ट किए गए कक्ष की शुद्धता निर्धारित करने के लिए एक पोस्ट-सॉर्ट विश्लेषण निष्पादित करें जनसंख्या (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E , 1F ).
- रिएजेंटों की तैयारी
प्रक्रिया शुरू करने से पहले, निंन आइटमों को एकत्रित और तैयार करने की आवश्यकता है:- पिपेट, १०० एमएम प्लेट्स
- Trypan ब्ल्यू र hemocytometer
- पुनर्गठित मानव संयोजक erythropoietin (ईपीओ) से कम ०.१% मानव सीरम एल्ब्युमिन युक्त बाँझ पंजाब में ५०० U/ इस घोल को छोटे aliquots में बांट लें और-20 & #176; C दोहराए गए फ्रीज से बचने के लिए-गल.
- तैयार पूरा Iscove & #39; s संशोधित Dulbecco & #39; एस मीडियम (IMDM) के अंतिम सांद्रता के साथ 5% FCS, 2 mM Glutamine, १०० यूनिट्स/mL पेनिसिलिन/Streptomycin (PS). अलग-अलग कुओं में विभिन्ना सांद्रता पर मानव संयोजक erythropoietin (ईपीओ) को सम्पूर्ण IMDM माध्यम से जोड़ें: ३ इकाइयाँ ईपीओ/खैर, ६ इकाइयाँ ईपीओ/खैर और १२ ईपीओ इकाइयाँ/खैर (१ एक्स, २ एक्स, ४ एक्स ईपीओ क्रमशः).
- अस्थि मज्जा कोशिकाओं की तैयारी
- 20 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ पतला अस्थि मज्जा के नमूने के 10 मिलीलीटर धीरे एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 15 मिलीलीटर घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर स्तरित हैं, दो चरणों के बीच स्पष्ट इंटरफेस बनाए रखने और आप nder बाँझो अटी । फिर 15 एमएल शंकु ट्यूबों को ५५० x g पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (RT) में 9 के रूप में सेट और मंदी के रूप में सेट के साथ 0 (या ब्रेक ऑफ) ।
- के बाद, एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब में अंतरफलक को हटाने और ५० मिलीलीटर के एक अंतिम मात्रा में पंजाबियों को जोड़ने । 10 मिनट के लिए २५० g के साथ
- के बाद 10 & #176; C supernatant निकालें और पूर्ण IMDM मध्यम में लगभग ०.५ x 10 6 कोशिकाओं/एमएल में कोशिकाओं को reसस्पैंड । ले 10 & #181; एक microtube में सेल निलंबन के एल, Trypan ब्लू समाधान (०.४%) और एक hemocytometer. का उपयोग कर गिनती की एक ही मात्रा के साथ मिश्रण
- हेptional: CD34 + कोशिकाओं के निर्माण द्वारा दिए गए निर्देशों के अनुसार Milteny CD34 मोतियों के साथ छंटाई चुंबकीय कोशिका से समृद्ध कर रहे हैं । इस संवर्धन कदम का मुख्य लाभ टेम स्टेम कोशिकाओं की गुणवत्ता का पता लगाने के लिए है, जो एक अर्द्ध ठोस मैट्रिक्स पर उगाया जाता है ५० एनजी के साथ जोड़ा/एमएल स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), 20 एनजी/एमएल granulocyte-macrophage कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ), 20 एनजी/ interleukin-3 (il-3), 20 एनजी/एमएल interleukin-6 (आईएल-6), 20 एनजी/एमएल granulocyte कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जी सीएसएफ), और १.४ के रूप में ईपीओ के 3 अलग सांद्रता.
- कोशिकाओं को पतला करने के लिए ०.१-०.१५ x 10 6 mononuclear कोशिकाओं/एमएल या 2 x 10 3 CD34 + कोशिकाओं/एमएल के साथ पूरा IMDM मीडियम सप्लीमेंट जोड़कर ईपीओ और ट्रांसफर ३०० & #181; एल टू 3 एमएल Methocult H4434 मीडियम. आंदोलन के बाद और 5 मिनट प्लेट के लिए एक छोटी सी मशीन तीन बार 1, एक ३५ mm डिश पर 1 मिलीलीटर । इनमें से दो कल्चर व्यंजन एक साथ एक तिहाई पानी से भरे-१०० एमएम प्लेट्स में रखे गए हैं.
- कोशिकाओं एक humidified ३७ & #176; सी मशीन के साथ 5% सह 2 14 दिनों के लिए में संस्कृति रहे हैं ।
- कालोनियों का विश्लेषण
- कालोनियों एक स्कोरिंग ग्रिड के साथ चिह्नित एक संस्कृति पकवान में 40X आवर्धन पर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ उनकी आकृति विज्ञान के अनुसार बनाए जाते हैं । हमारे परख के प्रयोजनों के लिए, कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) 4 श्रेणियों में वर्गीकृत कर रहे हैं: multipotential जनक कोशिकाओं (CFU-GEMM), granulocyte-macrophage जनक कोशिकाओं (CFU-जीएम), फट बनाने इकाई-erythroid (BFU-E) और कॉलोनी बनाने इकाई-erythroid (CFU-इ) । आगे कॉलोनी उपवर्गीकरण के लिए निर्माता & #39; s निर्देश देखें आगे विश्लेषण के लिए
- , CFU परख प्लेट से कोशिकाओं को अलग से 4 मिलीलीटर कमरे के तापमान में 2% FCS/IMDM युक्त में सस्पैंड द्वारा चार श्रेणियों के अनुसार बरामद कर रहे हैं । ४०० g पर 10 मिनट के लिए 4 & #176 में केंद्रापसारक के बाद, कोशिकाओं, पंजाबियों में reसस्पैंड कर रहे हैं, गिना, और डीएनए निष्कर्षण के लिए कार्रवाई की ।
- डीएनए अलगाव
- के विश्लेषण 10 मिनट के लिए ४०० ग्राम में केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं.
- एक रक्त डीएनए निष्कर्षण किट (QIAmp डीएनए रक्त निष्कर्षण किट) का उपयोग डीएनए को अलग । प्री-वार्म रेफरेंस बफर (AE) at ३७ & #176; सी eluted डीएनए की पैदावार बढ़ाने के लिए.
- Nanodrop एन डी-१००० स्पेक्ट्रा फोटोमीटर के साथ डीएनए एकाग्रता को मापने । १.८-२.० के बीच आयुध डिपो 260/280 के साथ नमूने आगे विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है ।
- पतला डीएनए विथ DNAase फ्री एच 2 ओ टू ०.१ एनजी/& #181; l कुल मात्रा में ५० & #181; l.
- STR-विश्लेषण
- को मिलाकर पीसीआर रिएक्शन सेट करें रिएक्शन मिक्स, AmplTaq गोल्ड डीएनए पोलीमरेज़ और Profiler प्लस प्राइमरी सेट विथ 20 & #181; l जीनोमिक dna (०.१ एनजी/& #181; l) मैनुअल के अनुसार (प्राइमरी किट में बफर में unलेबलेड प्राइमरों STR loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, और D7S820, और लिंग मार्कर amelogenin बढ़ाना) । नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 9947A के रूप में nuclease-मुक्त पानी शामिल करें । दाता और प्राप्तकर्ता दोनों से पूर्व प्रत्यारोपण डीएनए भी शामिल है ।
- निंनलिखित शर्तों के साथ Eppendorf mastercycler ढाल का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रिया करते हैं: ९५ & #176; ग के लिए 11 मिन, 28 प्रवर्धन चक्र के लिए ९५ & #176; c 1 मिनट के लिए, ५९ & #176; c 1 मिनट के लिए और ७२ & #176; c 1 मिनट के लिए, उसके बाद ६० & #176; c के लिए ४५ min.
- सेट अप अंश विश्लेषण प्रतिक्रिया जोड़कर 12 & #181; l Hi-Di Formamid and ०.५ & #181; l GeneScan ५०० ROX आकार मानक (सभी एप्लाइड-सिस्टम) को 1 & #181 के लिए, पीसीआर प्रोडक् ट्स की l. पहले और पिछले positon एक Allelic सीढ़ी (Genotyper Amp Fl STR ब्लू, ग्रीन द्वितीय और पीला, एप्लाइड सिस्टम) की जरूरत है ।
- ट्रो साधन के साथ ट्रो और अधिग्रहण शुरू.
- विश्लेषण Loci, alleles और पीक हाइट्स के नमूने और सॉफ्टवेयर के साथ नियंत्रण < सुप वर्ग = "xref" > १३ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS कक्ष छँटाई द्वारा lymphohematopoietic progenitors की जुदाई
हम यहां बहाव STR विश्लेषण के लिए आवश्यक कोशिका आबादी छंटाई से परिणाम प्रदर्शित करता है । अस्थि मज्जा कोशिकाओं V450-संयुग्मित विरोधी CD45, FITC-संयुग्मित विरोधी CD36 और APC-संयुग्मित विरोधी CD34 के साथ दाग थे । ब्याज की जनसंख्या nucleated के विकास के लिए जिम्मेदार megakaryocyte erythroid progenitors (एमईपी), एरिथ्रोसाइट्स कोशिकाओं है । इन कोशिकाओं CD36 एक्सप्रेस, लेकिन ल्युकोसैट आम प्रतिजन CD45 (चित्रा 1C) के लिए नकारात्मक हैं । यदि आवश्यक हो, इन कोशिकाओं को और अधिक उनके CD36 अभिव्यक्ति स्तर के आधार पर विभेदित किया जा सकता है । कई अतिरिक्त आबादी नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए हल किया जा सकता । हम CD45 + CD34 + लसीकावत्/माइलॉयड अग्रदूतों एक और जनक सेल जनसंख्या और CD45 + कोशिकाओं के रूप में उच्च एसएससी संकेत के रूप में परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं (चित्र 1 d) के रूप में हल । छंटाई एक BD FACSAria मैं साधन के साथ प्रदर्शन किया गया था । छँटाई के बाद erythroid जनक सेल शुद्धता भनेको & #62; ८५% (फिगर 1E) और माइलॉयड कोशिका शुद्धता थी & #62; ९५% (फिगर 1F).
चित्र 1 . FACS के बाद Erythroid जनक कोशिकाओं और माइलॉयड जनक कोशिकाओं की छंटाई । FSC-a बनाम SSC-a, FSC-H बनाम FSC-a और ब्याज की जनसंख्या का चयन करने के लिए एक बहुभुज गेट उपकरण के उपयोग पर चित्र 1a/1b प्रदर्शित करता है । 1C CD45 बनाम CD36 पर एमईपी इंगित करता है; 1 डी परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है । 1E और 1F में धनात्मक कक्षों का प्रतिशत दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
फट बनाने इकाइयों की पीढ़ी - erythroid कालोन ियां
कुछ अस्थि मज्जा से व्युत्पंन कोशिकाओं और CD34-विशिष्ट चुंबकीय मोतियों से अलग करने के लिए पैदा और अंतर दिखाई देते हैं । अर्द्ध ठोस मध्यम कालोनियों पर एक 14 दिन की मशीन की अवधि के बाद बना रहे हैं । ईपीओ के विभिंन सांद्रता के साथ उत्तेजना बहुत प्रमुख लाल (erythroid) कालोनियों (चित्रा 2) के गठन संवर्धित ।
चित्र 2। एक फट बनाने इकाई-erythroid (BFU-E) की पीढ़ी। दखाया गया एक BFU-E कॉलोनी का एक प्रतिनिधि कम पावर photomicrograph है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| mnc: | |||
| 1x ईपीओ | 2x ईपीओ | 4x ईपीओ | |
| CFU-ए | 2 | 2 | 2 |
| BFU-ए | 9 | 10 | 8 |
| CFU-जीएम | 30 | 30 | 29 |
| CFU-GEMM | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ कक्ष: | |||
| 1x ईपीओ | 2x ईपीओ | 4x ईपीओ | |
| CFU-ए | 1 | 1 | 0 |
| BFU-ए | 5 | 11 | 6 |
| CFU-जीएम | 25 | 26 | ३२ |
| CFU-GEMM | 0 | 2 | 3 |
तालिका 1. क्रमबद्ध अस्थि मज्जा कोशिकाओं और CD34 + चयनित कोशिकाओं में कालोनियों का विश्लेषण । कालोनियों एक स्कोरिंग ग्रिड के साथ चिह्नित एक संस्कृति पकवान में 40X आवर्धन पर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ उनकी आकृति विज्ञान के अनुसार बनाए जाते हैं । हमारे परख के प्रयोजनों के लिए, कालोनियों चार श्रेणियों में वर्गीकृत कर रहे हैं: कॉलोनी बनाने इकाई-erythroid (CFU-e), फट बनाने इकाई-erythroid (BFU-e), granulocyte-macrophage जनक कोशिकाओं (CFU-जीएम) और multipotential जनक कोशिकाओं (CFU-GEMM) ।
chimerism का विश्लेषण
Chimerism विश्लेषण AmpFlSTR Profiler प्लस किट (एप्लाइड सिस्टम, कैलिफोर्निया) अबी चश्मे ३१० आनुवंशिक विश्लेषक (एप्लाइड सिस्टम, कैलिफोर्निया) पर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार का उपयोग किया जाता है । विश्लेषण GeneMapper सॉफ्टवेयर (एप्लाइड सिस्टम, कैलिफोर्निया) के साथ किया जाता है । Loci D21S11, D7S820, FGA और vWA परिणाम (प्राप्तकर्ता का प्रतिशत-और दाता-विशिष्ट डीएनए) की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।
| नमूना | प्राप्तकर्ता का डीएनए | दाता डीएनए |
| CD45 | 25% | ७५% |
| CD36hi | 25% | ७५% |
| CD36lo | ५५% | ४५% |
| CD34 | 25% | ७५% |
तालिका 2. प्रतिशत प्राप्तकर्ता और कोशिकाओं में दाता डीएनए प्रतिदीप्ति से प्राप्त-सक्रिय कोशिका अस्थि मज्जा कोशिकाओं की छंटाई । lymphohematopoietic डिब्बे की विशिष्ट सेलुलर वंशावली में दाता कोशिकाओं की Chimerism दी गई है.
| नमूना | प्राप्तकर्ता का डीएनए | दाता डीएनए |
| बीएम-बहुराष्ट्रीय कंपनी | २४.७१% | ७५.२९% |
| बीएम-CD34 |
तालिका 3. प्रतिशत प्राप्तकर्ता और Clonogenic परख से प्राप्त कोशिकाओं में दाता डीएनए । lymphohematopoietic डिब्बे की विशिष्ट सेलुलर वंशावली में दाता कोशिकाओं की Chimerism दी गई है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
वर्तमान अध्ययन के उद्देश्य के लिए दर्शकों को erythroid progenitors में दाता/प्राप्तकर्ता chimerism का विश्लेषण करने के लिए दो दृष्टिकोण का एक संयोजन प्रदान करना है hemoglobinopathies के लिए इलाज रोगियों में HSCT निंनलिखित: 1.) प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई टेम जनक कोशिकाओं की अस्थि मज्जा के नमूनों में लघु मिलकर दोहराया और 2 के विश्लेषण के बाद.) कॉलोनी बनाने इकाई अस्थि मज्जा कोशिकाओं की बढ़ती, विभिंन जनक लघु मिलकर दोहराता के विश्लेषण के बाद प्रकार में कालोनियों का वर्गीकरण । इस दृष्टिकोण की नवीनता एक प्रोटोकॉल में तकनीक के संयोजन के लिए व्यक्तिगत कालोनियों में दाता का मूल्यांकन/
इस दृष्टिकोण के विशेष महत्व hemoglobinopathies के लिए इलाज रोगियों के लिए HSCT के बाद मिश्रित chimerism के संदर्भ में पाया जा सकता है । कई अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि रोगियों का एक महत्वपूर्ण अनुपात दाता माइलॉयड कोशिकाओं का एक कम प्रतिशत व्यक्त है कि erythroid के साथ संबद्ध करता है, लंबे समय से स्थाई स्थिर मिश्रित टेम chimerism में und परिणाम कोशिकाओं के लिए3, 11; इसके विपरीत, एक ही रोगियों में दाता के एक उच्च प्रतिशत-लाल रक्त कोशिकाओं को व्युत्पंन (2-5 के लिए परिपक्व ल्यूकोसाइट्स की तुलना में अधिक गुना) और पता चलता है कि अप्रभावी erythropoiesis erythroid विकास के बाद के चरण में जगह लेता है । इन टिप्पणियों दाता erythroblasts में त्वरित apoptosis के लिए प्रवृत्ति को जिंमेदार ठहराया गया है और टी और बी अवशिष्ट लिम्फोसाइटों के हठ एक मिश्रित allograft14,15की अनुमति के लिए जिंमेदार है । चुहियों निंनलिखित टेम स्टेम सेल प्रत्यारोपण के संदर्भ में हम हाल ही में प्रदर्शन किया है कि गुर्दे चिकित्सा के संशोधन के लिए टेम प्रत्यारोपण के बाद ß-thalassemia के लिए एक चयनात्मक लाभ में परिणाम आनुवंशिक रूप से-erythroid डिब्बे को सही, एक 2-२.५-अवशिष्ट दाता स्टेम कोशिकाओं के12गुना प्रवर्धन दे । इस प्रेक्षण दाता का निर्धारण-बनाम अवशिष्ट erythroid progenitors की उपयोगिता का समर्थन करता है, क्योंकि यह इस घटना की समझ प्रदान करता है और भविष्य नैदानिक hemoglobinopathies के उपचार के लिए जीन थेरेपी का अध्ययन परीक्षण का समर्थन । वास्तव में, जीन संशोधित nucleated कोशिकाओं को परिचालित लाल रक्त कोशिकाओं के एक चिकित्सीय स्तर को प्राप्त करने की जरूरत के अनुपात के समान हो सकता है कि hemoglobinopathies के लिए स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन के साथ इलाज रोगियों में मनाया ।
आदेश में दाता erythropoiesis की पूरी तस्वीर का निर्धारण करने के लिए हम प्रोटोकॉल संशोधित और एक विस्तृत, कदम दर कदम प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम एक प्रवाह cytometer और सॉफ्टवेयर है, जो विस्तृत निर्देशों के साथ मानकीकृत है और उचित प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए स्थापित करने की प्रक्रिया है । दृश्य स्वरूप में हमारे प्रोटोकॉल की प्रस्तुति दर्शकों को हमारे प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए आसानी से अनुमति देता है । हम अपनी पीसीआर erythroid से प्राप्त progenitors से जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर परिणामों की तुलना में बीएम नमूनों बनाम डीएनए FACS-क्रमबद्ध erythroid अस्थि मज्जा progenitors से प्राप्त की इकाइयों के गठन । दो दृष्टिकोण से दाता engraftment डेटा मूल रूप से लगातार कर रहे हैं । तथापि, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों से प्राप्त नमूनों में आमतौर पर कम भिन्नता पाई गई. इस में दाता लाल रक्त कोशिका के अग्रदूतों में सुधार के कारण की संभावना है इन विट्रो परख में के रूप में अनुपचारित और हल दाता समकक्षों की तुलना में । इस रोशनी में, इस प्रोटोकॉल कृत्रिम रूप से विभिंन hemoglobinopathies के साथ रोगियों की एक सीमा से स्वस्थ progenitors और progenitors के ज्ञात अनुपात के साथ मिश्रित chimeric संयोजन बनाने के द्वारा विस्तारित किया जा सकता है । clonogenic परख और chimerism का आकलन सही में डाल अनुपात को प्रतिबिंबित करना चाहिए ।
हालांकि इस विशेष सेटिंग में शामिल तंत्र की एक सटीक समझ कमी है, यहां प्रस्तुत विधि engraftment और शकुन जानकारी की नियमित निगरानी के लिए प्रासंगिक जानकारी प्रदान करने के लिए सर्वोपरि महत्व का है नैदानिक अभ्यास । भ्रष्टाचार समारोह से बचाव के प्रयास भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग के विकास के जोखिम से सीमित है और धारावाहिक engraftment निगरानी द्वारा निर्देशित किया जा सकता है । अंत में, इस विधि भी अनुसंधान hemoglobinopathies के साथ रोगियों की देखभाल में सुधार करने के लिए प्रतिबद्ध क्षेत्रों के लिए एक उपयोगी आधार प्रदान हो सकता है, विशेष रूप से तीव्र भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग और स्व-प्रतिरक्षित रोग से प्रभावित लोगों.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
