Summary
L’utilisation d’une « puce olfactive » adaptée pour l’imagerie calcique efficace de c. elegans mâles est décrite ici. Études sur l’exposition de glycérol et d’une phéromone mâle sont également indiqués.
Abstract
L’utilisation d’indicateurs de calcium a grandement amélioré notre compréhension de la dynamique des neurones et de la réglementation. Le nématode Caenorhabditis elegans, avec ses entièrement cartographiée du système nerveux et l’anatomie transparent, présente un modèle idéal pour comprendre la dynamique neuronale en temps réel en utilisant des indicateurs de calcium. En combinaison avec les technologies microfluidiques et expérimentaux, les études d’imagerie calcique à l’aide de ces indicateurs sont réalisées chez l’animal de mouvement libre et pris au piège. Cependant, la plupart des études précédentes utilisant des dispositifs de piégeage, tels que la puce olfactive décrit dans Chronis et al., d’appareils conçus pour utilisation dans l’hermaphrodite plus commun, le mâle moins commun est à la fois structurellement et morphologiquement dissemblables. Une puce olfactive adaptée a été conçue et fabriquée pour une efficacité accrue dans l’imagerie neuronale mâle avec l’aide de jeunes animaux adultes. Un virage a été incorporé dans le ver port pour faire pivoter les animaux et pour permettre la séparation des neurones individuels au sein d’une paire bilatérale en imagerie 2D de chargement. Vers sont exposés à un écoulement contrôlé de substance odorante au sein du dispositif microfluidique, tel que décrit dans les précédentes études hermaphrodites. Transitoires de calcium sont ensuite analysées en utilisant le logiciel open source ImageJ. La procédure décrite ci-après devrait permettre une plus grande quantité de base mâle c. elegans calcium imagerie, approfondir notre compréhension des mécanismes de signalisation neuronale spécifique au sexe.
Introduction
Dispositifs microfluidiques fournissent un accès accru à précisément les environnements maîtrisés, où animaux, tels que le nématode c. elegans, peut être manipulée expérimentalement1. Ces études comprennent des tests comportements, études d’imagerie calcique ou même des projections pour les phénotypes spécifiques, résultant en des mesures plus exactes des résultats expérimentaux1,2,3,4, 5,6. Microfluidique offrent des conditions liquides à petite échelle à travers lequel les expériences détaillées peuvent être exécutées tout en utilisant des quantités minimales de réactifs. Il y a une production constante de nouvelles conceptions de dispositif microfluidique, et l’utilisation de chacun varie, entre les arènes permettant le mouvement naturel sinusoïdal de c. elegans , des essais comportements et des études d’imagerie neuronales piéger les appareils utilisés en imagerie neurale et études olfactifs, aux appareils qui permettent de haut débit analyse phénotypique en génétique écrans4,5,6,7. Suite à la fabrication d’un moule maître, Dispositifs microfluidiques sont peu coûteux à construire, compte tenu de la réutilisabilité du maître — et facile à utiliser, permettant la génération de données rapide via des études de haut débit. La fabrication des dispositifs à l’aide de polymères comme le polydiméthylsiloxane (PDMS) permet la création de nouveaux dispositifs dans les heures.
Études d’imagerie calcique utilisent des indicateurs de calcium génétiquement encodé (GECIs) exprimés dans les cellules de cible pour mesurer la dynamique neuronale de ces cellules en temps réel8,9,10,11. La nature transparente de c. elegans permet l’enregistrement des niveaux fluorescents de ces protéines dans les animaux vivants. Traditionnellement, GECIs dépendent de la protéine fluorescente verte (GFP)-base de capteur GFP-calmoduline-M13 Peptide (GCaMP), bien que des études plus récentes ont adapté ces capteurs permettant de meilleurs ratios signal-bruit et profils d’excitation décalée vers le rouge. Suite au développement de GCaMP3, avec ces spécifications, les protéines ont varié, y compris les capteurs tels que GCaMP6s et GCaMP6f (lent et rapide de fluorescence hors-taux, respectivement), ainsi que de la DP-calmoduline-M13 Peptide (Patriot04), qui a une décalée vers le rouge Profil de l’activation. La combinaison de ces GECIs avec séquences promotrices de c. elegans gène spécifique des cellules peut cibler des cellules d’intérêt, les neurones sensoriels en particulier12,13,14,15 , 16.
Alors que la facilité d’utilisation de c. elegans en microfluidique études est apparente, presque toutes les études ont porté sur les hermaphrodites. Malgré les hommes représentaient seulement 0,01-0,02 % de la population de souche sauvage, conclusions inestimable peuvent découler de leur caractérisation. Tandis que le connectome physique du système nerveux hermaphrodite a été entièrement localisé pour des décennies17, le mâle connectome reste incomplète, en particulier dans la région céphalique des animaux18. L’utilisation d’imagerie calcique chez les mâles aideront à créer une compréhension du système nerveux mâle et les différences qui surviennent entre les deux sexes. La petite taille des mâles adultes de c. elegans empêche un piégeage efficace et fiable dans les ports de chargement des appareils olfactifs traditionnels conçus pour agrandissement hermaphrodites. Pour y remédier, une version modifiée de la puce olfactif Chronis19 a été développée avec un orifice de chargement plus étroit, une hauteur inférieure à canal et se transforme dans l’orifice de chargement du ver (qui tournent l’animal), permettant la visualisation de bilatérale gauche/droite paires neuronales. Cette conception permet : (1) le recouvrement efficace de jeunes mâles adultes, (2) une orientation plus fiable de l’animal pour la visualisation des deux membres de neurones paires bilatérales et (3) l’imagerie précise de l’activité neuronale dans les neurones masculins.
De plus en plus, des études montrent que le c. elegans mâles réagissent différemment des hermaphrodites à une variété d’ascarosides (RRSA) ou nématode phéromones20,21,22,23 ,,24. Par conséquent, développer une compréhension de la dynamique neuronale et les représentations au sein de la connectome mâle est devenu encore plus pertinente. Mâles de c. elegans contiennent 87 sexe neurones non présents dans les hermaphrodites25,26, altérant la connectome en tant que-façons encore indéterminé. Être capable à l’image de ces dynamiques de neurones uniques nous permettra à mieux comprendre les réponses selon le sexe et représentations neurales.
Ce protocole décrit l’utilisation d’une puce olfactive adaptées au mâle pour l’imagerie neurale du mâle c. elegans chémosensation. Le neurone nociceptif QU'ASH répond sûrement à 1 M glycérol chez les mâles, conformes aux précédentes hermaphrodite études27. Exposition à ascarosides peut provoquer des réponses qui sont variables d’un animal à l’autre, nécessitant un plus grand nombre d’animaux à tester. La réponse des neurones spécifiques aux mâles CEM a déjà été démontrée, par électrophysiologie et de calcium, imagerie, répondre variablement à ascaroside #323.
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Protocol
1. Fabrication de dispositifs
Nota : voir référence 1.
Remarque : moules maîtres de silicium ont été fabriquées à l’aide de techniques photolithographiques standard pour le patterning SU-8 photorésine sur un silicium maître 1 , 7. Masques pour la structuration de la plaquette ont été imprimés à 25 000 dpi. Les fonctionnalités du dispositif adapté au mâle une puce olfactif Chronis conçoivent 19 avec un changement dans le ver port de chargement, d’adapter un dessin obtenu de M. Zimmer (correspondance personnelle, 2016). Un virage est inclus pour contrôler la rotation des animaux. La largeur du chenal du port de chargement ver est réduite à 50 μm. Tous les canaux sont hauteur 32 μm. Une fois un moule maître de silicium est disponible pour l’utilisateur, l’utilisateur peut suivre la suite du protocole, comme décrit plus haut 1.
- Agent PDMS Mix de base et polymérisation à un ratio de 10:1 en poids.
- Bien les mélanger avec des pipettes de transfert.
- Une solution contenant le mélange dans un dessiccateur à vide pendant 1 h, jusqu'à ce que toutes les bulles visibles sont enlevés.
- Verser le mélange sur un maître de moule silicone dans un plat de diamètre 150 mm, jusqu'à ce qu’il est de 5 mm d’épaisseur (100 g). Utiliser une pipette Pasteur pour enlever les bulles ou poussières qui ont été introduits dans le mélange.
- Cuire au four à 65 ° C pendant au moins 3 h, ou toute la nuit.
- Coupe le PDMS loin du moule à l’aide d’un scalpel et coupe les appareils séparés dehors à l’aide d’une lame de rasoir.
- , Percez des trous d’entrée et de sortie avec un coup de poing par voie cutanée de 1 mm.
- Rincer les trous avec dH 2 O, éthanol et encore une fois avec dH 2 O pour enlever les particules des coups de poing. Séchez l’appareil dans une impulsion de flux d’air.
- Nettoyer les côtés du canal et le dessus de l’appareil avec du ruban adhésif, enlever toute poussière ou débris restant sur l’appareil pour permettre une liaison réussie.
- Plasma-bond le dispositif, canal-vers le bas, d’un couvercle en verre n ° 1.
Lamelle couvre-objet
- exposer et dispositif (canal vers le haut) à plasma d’air à l’aide de conditions permettant une bonne adhérence, par exemple 100 W pendant 30 s ou 24 W pour 60 s.
Remarque : Les paramètres est réglable pour améliorer l’efficacité du collage. Les conditions de liaison plasma ne sont pas aussi critiques que nettoyage correct lorsque vous tentez d’améliorer l’efficacité du collage. Un dispositif insuffisamment nettoyé vouloir pas le bon, même dans des conditions idéales de plasma. - Inverser la lamelle couvre-objet sur le côté du chenal de l’appareil et appuyez vers le bas avec le pouce pendant 5 s.
- exposer et dispositif (canal vers le haut) à plasma d’air à l’aide de conditions permettant une bonne adhérence, par exemple 100 W pendant 30 s ou 24 W pour 60 s.
2. Préparation de la mémoire tampon
- diluer 1 x S Basal (100 mM NaCl et 0,05 M KPO 4, pH 6,0) provenant d’un stock stérile 10 x.
- Diluer 1 M Tétramisole stock à une concentration finale de 1 mM, 1 x S Basal pour tous mettre en mémoire tampon des solutions.
- Ajouter fluorescéine à la fois la " contrôle de flux " et " tampon " réservoirs.
- Créer un stock de 100 mg/mL de fluorescéine dans 1 x Basal de S.
- Diluer le stock à la concentration finale de 1 µg/mL dans le contrôle de flux et de 0,1 µg/mL dans le tampon.
- Créer les stimuli.
- Glycérol dilué à une concentration finale de 1 M dans 1 X Basal de S.
- Diluée ascaroside #3 (RRSA #3) à une concentration finale de 1 µM dans 1 X Basal de S.
3. Device Setup
Nota : voir 1.
figure 1. Installation de dispositif microfluidique. (A) réservoirs et tuyauterie. Un 30 mL seringue sans un piston sert le " réservoir. " ceci est attenant à une vanne Luer avec trois options de flux. Une sortie est reliée à une seringue de 3 mL avec un piston, tandis que l’autre est reliée à une aiguille (orange) qui s’insère dans le tuyau qui se connecte à l’appareil de la microfluidique. (B), l’ensemble le programme d’installation de la microfluidique imaging experiment. Le dispositif est placé sur une scène d’un microscope à épifluorescence inversé, au-dessus de l’objectif. Le " contrôle de flux " tampon se déplace à travers une vanne 3 voies qui est commandée par une unité sur l’étagère au-dessus de l’installation. Les lignes contenant des tampons sont ensuite insérés dans les ports de périphérique approprié. (C) les ports du dispositif microfluidique. Le " contrôle de flux " ports flanquent les autres ports d’entrée : le " stimulation " et " tampon " ports. La " prise " port est le plus à droite. En raison de l’emplacement de l’arène de chargement de ver, le " ver chargement " port est le port plus centrale sur l’appareil. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Préparer trois réservoirs de liquides en joignant une seringue de 30 ou 60 mL Luer vanne à 3 voies, avec une seringue de 3 mL et une aiguille attachée à la valve de Luer ainsi (comme dans la Figure 1 a). Connecter l’aiguille à un tube qui s’étend au dispositif microfluidique (comme dans la Figure 1 a -B).
- Enlever les bulles d’air du réservoir et tube.
- Remplir la seringue de 3 mL avec tubulure avec 1 x S Basal et insérez-le dans la prise de port
- Exercez une légère pression sur la seringue jusqu'à ce que la mémoire tampon apparaît en haut des orifices d’admission.
- Connecter le contrôle de flux, de tampon et tubes de stimulation sur les trous d’entrée approprié (comme dans la Figure 1 b -C), veiller à ce que les gouttes de liquides sont présents sur les deux orifice de chargement du trou et le tube de tampon à apposer.
- Encore une fois, exercez une légère pression à la seringue qui est raccordée à l’orifice de sortie jusqu'à ce que les gouttelettes apparaissent dans le ver à l’entrée du port de chargement.
- Insérer une goupille de blocage solide dans le ver chargement port.
- Retirer la seringue de l’orifice de sortie et de fixer la ligne de sortie connectée au vide maison (-670 Torr).
- Inspecter l’appareil pour toutes les bulles dans le flux des chaînes, visuellement et par le biais de confirmation vidéo via un logiciel compatible avec l’appareil photo utilisé, par exemple le logiciel open source Micro-crèche. Voir l’étape 6 pour obtenir des conseils sur l’utilisation des Micro-Manager.
- Si les bulles sont présentes, attendez que les déloger ou être absorbés par le PDMS mur avant le chargement de tous les animaux, la présence de bulles perturbera le bon écoulement des fluides à travers le dispositif.
- à l’aide d’un filtre GFP, confirmer la dynamique de l’écoulement approprié au sein de l’appareil avant chargement en actionnant le robinet à 3 voies et en observant la commutation des tampons de ver.
- Déterminer la dynamique de l’écoulement : observer la fluorescéine présente dans les solutions de contrôle et de la mémoire tampon de débit ( Figure 2D -2E) changer lorsque la valeur de contrôle de flux est modifiée en appuyant sur la commande bouton correspondant à la vanne 3 voies sur le lien de la soupape ( Figure 1 b).
- Après ouverture Micro-Manager, cliquez sur " Live " pour observer une image en direct de l’appareil. Allumez la source de lumière fluorescente d’observer le flux des tampons dans le dispositif ( Figure 2D -2E).
Figure 2 : Une mâle adaptés olfactif puce microfluidique. Patrons de (A), le débit de l’appareil quand le ver est exposé au tampon. Tampon (B) apparaît en marron, tandis que le mousseur (FC) est indiqué en jaune, avec relance (S) en blanc. Le ver à l’orifice de chargement a été adapté pour inclure une courbe qui permet de mieux contrôler l’orientation ver. Modèles (B), le débit de l’appareil quand le ver est exposé au stimulus. Tampon (B) apparaît en marron, tandis que le mousseur (FC) est indiqué en jaune, avec relance (S) en blanc. (C) des mesures de l’appareil adapté comme mécano. Le ver à l’orifice de chargement se termine par un 42 µm d’ouverture, avec un canal µm 50, conçu pour la largeur de sexe masculine. La hauteur mesurée des canaux est 32 µm, malgré une cible de 25 µm dans la conception. (D-E) A pris au piège les hommes exprimant p sra-6 :: GCaMP3. Le promoteur sra-6 n’est pas spécifique au frêne, et certaines expressions peuvent être observé dans le neurone ASI, mais aucun transitoires de calcium ont été observés dans l’ASI. L’image est (D), une combinaison de l’éclairement lumineux-zone et fluorescent, tandis que (E) n’est fluorescent. Les barres d’échelle indiquent 42 The ASH µm. (F), neurone répond à la stimulation de glycérol de 1 M avec activité neurale robuste. La zone bleue désigne le temps de l’impulsion de glycérol de 1 M. La région ombrée indique l’écart-type, avec n = 20 impulsions de sept vers. Les traces rouges correspondent aux réponses dépolarisantes. Les axes des ordonnées montrent ΔF/F 0. La barre d’échelle représente 5 s. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
4. préparation de l’animal
Nota : voir référence 23.
- Réponses ASH imaging au glycérol de 1 M.
- Place environ 20 c. elegans mâles qui sont positifs pour p sra-6 :: expression tableau GCaMP3 sur une nématode croissance moyenne (NGM) Gélose ensemencée avec une pelouse de OP50 e. coli. Utiliser les expressions du GECI fluorescente ou un marqueur de coinjection pour l’identification des animaux séropositifs au tableau.
NOTE : Les animaux positifs Array seront réagissent en selon le GECI utilisé (c.-à-d. animaux exprimant GCaMP sera réagissant en vert sous la stimulation de la lumière bleue, tandis que les Patriot04 animaux est réagissant en rouge sous stimulation feu vert). Marqueurs de coinjection peuvent varier entre autres protéines fluorescentes, comme GFP et DP, et marqueurs phénotypiques comme rol-6, ou peuvent sauver un phénotype dominant, tels que la mutation de pha-1 28.- Si la cueillette immédiatement avant l’essai, les jeunes hommes adultes pick. Si la cueillette le jour avant le test, choisissez les larves mâles L4.
- Place environ 20 c. elegans mâles qui sont positifs pour p sra-6 :: expression tableau GCaMP3 sur une nématode croissance moyenne (NGM) Gélose ensemencée avec une pelouse de OP50 e. coli. Utiliser les expressions du GECI fluorescente ou un marqueur de coinjection pour l’identification des animaux séropositifs au tableau.
- Imaging les réponses CEM à 1 µM RRSA #3.
- Pick environ 20 L4 c. elegans mâles (fkEx98 [p pkd-2 ::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1] ; Pha-1 (e2123ts) ; lui-5 (e1490) ; Lite-1 (ce314)) qui sont positifs pour l’expression de marqueurs coinjection dsRed.
NOTE : expression dsRed dans les neurones de ray du conte mâle est plus facile à observer et à confirmer que l’expression GCaMP dans les neurones CEM quatre. - Isoler ces mâles de hermaphrodites sur une gélose au NGM ensemencé avec une pelouse de OP50 e. coli pour les 5-14 h avant de procéder à l’expérimentation d’imagerie.
NOTE : Mâles non isolés pendant au moins 5 h ne réagissent pas sur le plan comportemental au RRSA #3 et donc susceptible de présenter encore moins transitoires de calcium à l’ascaroside que celle observée ici.
- Pick environ 20 L4 c. elegans mâles (fkEx98 [p pkd-2 ::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1] ; Pha-1 (e2123ts) ; lui-5 (e1490) ; Lite-1 (ce314)) qui sont positifs pour l’expression de marqueurs coinjection dsRed.
5. Chargement animal
Nota : voir refefence 1.
- Choisir un ver sur une gélose ensemencée NGM utilisant des techniques de maintenance standard ver.
- Pick worms par flambage d’une pioche (en fil de platine aplati), cueillette de bactéries sur le choix, et " tamponnant " un ver pour le ramasser. Placez délicatement le ver sur la plaque de nouveau, ce qui lui permet de ramper hors sur sa propre.
- Ajouter environ 5 mL 1 x S basale à la plaque non ensemencée, telle que la plaque est inondée.
- Tirer le ver dans une seringue de chargement (c'est-à-dire, seringue de 3 mL avec tubulure) qui a été pré-rempli avec 1 x baso S.
- N’oubliez pas de sucer le ver uniquement dans le tube, pas complètement dans la seringue.
Remarque : Si le ver se rend dans la seringue, il est presque impossible de le récupérer dans la tubulure.
- N’oubliez pas de sucer le ver uniquement dans le tube, pas complètement dans la seringue.
- Éteindre l’aspirateur pour arrêter l’écoulement en tournant la vanne Luer.
- Retirez la tige solide bloquant le ver chargement port.
- Tourner la soupape de Luer raccordée à l’orifice de sortie ( Figure 1 b) pour qu’il est ventilation.
Remarque : Utiliser une vidéo en direct pendant le chargement de la vis sans fin d’alimentation pour confirmer l’emplacement et l’orientation de l’animal (étapes 5,8-5,13). - Insérer le ver tube dans le ver port de chargement de chargement
- Exercez une légère pression sur la seringue jusqu'à ce que le ver s’affiche dans le canal de chargement.
- Si le ver commence à entrer dans le chenal de queue en premier, tirez sur le piston de la seringue pour empêcher le ver dans le canal.
- Commutateur entre application et inverser la pression jusqu'à ce que la tête entre le canal première.
- Ouvrir le vide en tournant la vanne à 3 voies Luer raccordé à l’orifice de sortie de l’ouvrir de l’aspirateur au lieu de l’atmosphère.
- Presser manuellement en appuyant sur le piston de la seringue pour orienter et placer la tête de la vis sans fin telle qu’elle est exposée sur le canal d’écoulement de tampon, mais pas si loin que le chef peut se déplacer librement (D-2E de la Figure 2).
6. Stimulation et Acquisition
- à l’aide d’un logiciel open source microscopie, tels que Micro-Manager, enregistrer en capturant des images comme une pile TIFF à 10 images/s, utilisant l’excitation de la lumière bleue (470 nm) pendant 30 s.
- Régler l’exposition sur le menu principal pour Mme 100
- Open " multi-D Acq. " dans le menu principal du logiciel. Définir la " nombre " à " 300, " et le " intervalle " à " 0. " cliquez " Acquire ! " pour acquérir la vidéo.
- Appliquer une impulsion de 10 s de stimulation 5 s après le lancement d’acquisition. Ajuster la durée d’application de la stimulation comme vous le souhaitez.
- Après l’acquisition de 5 s de vidéo, changer la vanne 3 voies contrôlant le tampon de contrôle de flux pour appliquer le stimulus à l’animal mis à l’essai. Cliquez sur le bouton le plus à gauche sur le lien de la soupape ( Figure 1 b).
- Après 10 s de l’exposition de relance (ce temps peut être ajusté comme souhaité par l’utilisateur), modifier le flux des tampons de nouveau en appuyant sur le bouton le plus à gauche sur le lien de la vanne.
- Record sous tampon seulement jusqu'à la fin de la fenêtre de 30 s pour permettre la fluorescence de GECI revenir au niveau de référence.
- Répéter comme vous le souhaitez. Attendre 30 s entre la fin de l’acquisition et l’ouverture du procès suivant.
7. Analyse d’image
- ouvrir la pile TIFF avec le logiciel open-source, ImageJ, en faisant glisser le fichier dans la fenêtre de ImageJ.
- Cliquez sur l’aide du curseur et faites glisser pour définir la zone d’intérêt (ROI) dans le neurone d’intérêt. Définir la zone d’inclure le soma des neurones d’intérêt (comme dans la Figure 3 a).
- Tracer la z-pile de l’intensité de la fluorescence du ROI dans l’ensemble de piles en cliquant sur Ouvrir-> Image - > piles - > tracer le profil z.
- Click " liste " dans la fenêtre qui s’ouvre. Cliquez sur Edit - > copier pour copier les valeurs. Coller les valeurs dans un tableur.
- Analyser la fluorescence de fond pour chaque impulsion en faisant glisser le ROI à une région du ver qui ne contient-elle pas d’expression GCaMP.
- Exécuter la soustraction de fond pour chaque impulsion en soustrayant la valeur background de fluorescence de la valeur d’intensité de fluorescence neuron.
- Calculer ΔF/F 0 pour chaque image de chaque impulsion.
- Calculer F 0 comme valeur moyenne intensité du ROI pour 1 première s d’acquisition (par exemple, les cadres de 1-10).
- Calculer ΔF/F 0 en divisant la valeur soustraite à l’arrière-plan de l’image d’intérêt par la valeur calculée de 0 F.
- Répétez pour chaque neurone imagé et chaque impulsion de stimulus.
- De neurones avec des profils de réponse cohérente, tels que les cendres, en moyenne toutes les impulsions de chaque neurone et calculer le SEM (comme dans la Figure 2F).
- Tracer la moyenne ΔF/F 0 avec SEM au fil du temps pour chaque neurone.
Remarque : Dans ce cas, il est pratique courante d’inclure les heatmaps des réponses neuronales individuels de chaque essai aussi bien. Dans les neurones qui ne montrent pas compatibles changements transitoires de calcium lors de l’exposition à des stimuli à travers des stimulations répétées, ou dans différents individus 23, il peut être plus il y a lieu de montrer des traces d’impulsion (comme dans la figure 4). Voir la Discussion pour plus d’informations sur déterminer comment afficher les données.
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Representative Results
Un exemple de la configuration du dispositif global peut être vu dans la Figure 1 a-B. Figure 1 a dépeint la construction correcte de réservoir et configuration. Figure 1 b montre les connexions des réservoirs pour le dispositif microfluidique. La figure 1 représente un dispositif microfluidique avec différents ports étiquetés pour plus de clarté.
La conception du dispositif microfluidique adaptées au mâle contient une courbe dans le port de chargement, mais la dynamique de l’écoulement est identique à l’appareil conçu par Chronis et al.,19(Figure 2 a-2 C). Le flux des tampons peut être contrôlé en modifiant quel régulateur de débit est ouverte (Figure 2 a-2 b). Les mesures de l’appareil comme fabriqué varient selon le fichier conçu. Les mesures fournies dans la Figure 2 sont des mesures « aussi fabriqués ».
Après le chargement de mâle c. elegans dans l’appareil olfactif adaptées au mâle, leur placement et orientation, ainsi que dynamique des écoulements canal, peuvent être vérifiées par imagerie de fluorescence et lumineux-terrain (Figure 2D-2E). L’exposition vers exprimant GCaMP3 dans le neurone nociceptif, ASH, à 1 M glycérol entraîne des changements visibles en fluorescence dans le neurone de cendres, indicatif de l’activité neuronale (Figure 2F). Des changements subtils dans la fluorescence n’est peut-être pas visibles par le œil, mais le logiciel peut être utilisé pour quantifier ces changements. Le logiciel gratuit de ImageJ permet d’analyser et de quantifier l’intensité de fluorescence des neurones de cendres lors de l’exposition au glycérol 1 M au fil du temps (Figure 2F). Ceci est similaire à ce qui est observé dans les hermaphrodites27 et, en raison de la robustesse de la réponse neuronale de cendres au glycérol, c’est observé chez tous les animaux testés.
Une petite quantité de mouvement axial ou rotation est attendue chez les animaux unparalyzed, nécessitant souvent un algorithme de suivi des neurones au cours de l’analyse vidéo (Figure 3 a). L’ajout d’un paralytique dans les mémoires tampons (par exemple, 1 mM Tétramisole) élimine presque cet effet, bien que certains animaux (~ 10 %) se déplacent encore au cours du procès. Ceci peut être contourné par : (a) à l’aide des mâles plus âgés, qui sont plus efficacement piégés ; (b) diminue la largeur ou l’épaisseur du ver chargement port encore plus loin ; ou (c), soit en augmentant la concentration du paralytique utilisé ou en utilisant un autre paralytique. Il veillera également à ce qu’il n'ya pas trop de la tête au-delà de la fin du piège et exposés sur le canal de l’odeur. En cas d’un procès avec le mouvement de la vis sans fin, le domaine de l’analyse peut être déplacé et relire à partir du nouvel emplacement neuronal, à partir de la trame, après quoi le mouvement produit (Figure 3 b). Une reconstruction manuelle des traces neuronales par l’utilisateur est requise dans cette instance. Scripts qui analysent les modifications fluorescentes dans le neurone et qui suivent le centre de neurone lorsqu’il se déplace peut aussi être écrit19.
Mâles de c. elegans sens attractifs phéromones biogéniques appelées ascarosides par les quatre sexe CEM neurones23. Lorsqu’on observe des transitoires de calcium chez les mâles, les réponses sont variables en forme, signe et ampleur entre les neurones et les animaux (Figure 4 a-B). Cependant, réponse masculine aux phéromones n’est pas aussi fiable observé comme transitoires de calcium chez beaucoup d’animaux (Figure 4). Ce n’est pas décourageant, car la plupart ascarosides ne pas permis d’obtenir des transitoires de calcium à sensation13,14,15.
Figure 3 : adressage mouvement ver au cours de la période d’acquisition image. (A) ΔF/F0 (changement dans l’intensité de fluorescence divisée par l’intensité de fluorescence de fond moyenne pour 1 première s d’acquisition) a été calculé à l’aide de ImageJ en définissant une zone où le neurone d’intérêt était fiable statique pour 1 s. Pendant les impulsions de stimulation (zone bleue), l’animal déplacé, comme on le voit dans les images au-dessus de la trace de calcium, ce qui entraîne le neurone n’est plus contenu dans la zone étudiée (boîte jaune). Les barres d’échelle indiquent 42 µm. le spectacle de lignes pointillées la région de la courbe correspondant à l’emplacement du ver dans chaque image. (B) si le domaine de l’analyse est déplacé à suivre le neurone pendant le procès et que les traces individuelles sont reconstruits pour transmettre la dynamique réelle de neurones, la trace s’affiche comme si l’animal ne bougea pas. Les lignes tiretées indiquent la région de la trace qui a été corrigée pour le mouvement de la vis sans fin. Traces pour les cendres neurones, gauche et droite (ASHL (rouge) et ASHR (bleu), respectivement) sont indiquées. Les axes des ordonnées montrent ΔF/F0. La barre d’échelle représente 5 s. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Mâle c. elegans CEM réponse à 1 μM RRSA #3 est la variable. Les neurones CEM spécifiques aux mâles affichent des motifs uniques de la réponse aux phéromones biogéniques. (A) les réponses observées dans chaque neurone CEM pour une impulsion chez un animal sensible sont indiqués. Il y a quatre neurones CEM : dorsale droite (DR CEM), dorsale gauche (CEM DL), ventral droit (CEM VR) et ventrale gauche (CEM VL). Trois des quatre neurones répondent par des dépolarisations de différentes forme et ampleur, avec la quatrième ne répond ne pas à l’ascaroside. (B) environ un tiers des animaux pris au piège (2/7 testés dans cette étude) résultat dans seulement trois neurones capables d’être photographié. Les réponses d’un ver dans cette orientation a entraîné transitoires de calcium CEM qui différaient de celles observées chez le premier ver. Ce n’était pas dû au changement de l’orientation du ver, comme DR CEM est visible dans les deux orientations et expositions réponse variable entre les animaux. (C) vers beaucoup ne pas réagir avec n’importe quel transitoires de calcium détectable (5/7 testés dans cette étude). Des traces individuelles montrés sont représentant des animaux simples présentés dans les images ci-dessus les parcelles. Lebarres d’échelle indiquent 42 µm. Traces : la zone bleue désigne le temps d’exposition de RRSA #3 1 μM. Les traces rouges indiquent la réponse dépolarisante. Les traces noires ne dénotent aucune réponse observée. Les axes des ordonnées montrent ΔF/F0. La barre d’échelle représente 5 s. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La puce olfactive adaptées au mâle incorpore un virage dans un orifice de chargement plus étroit, qui permet plus de contrôle de l’orientation et le piégeage efficace des hommes c. elegans. Cela permet la visualisation des deux membres gauche et droite du neuronales paires bilatérales, sans besoin de z d’empilage. Cette courbe conduit à une orientation loin vertical 100 % du temps à worms où seule paire bilatérale s’adresse à un marqueur fluorescent, tels que les cendres (Figure 2D-E)29,30. Toutefois, dans les classes neuronales avec quatre neurones radialement symétriques, comme CEM, tous les quatre neurones sont visibles seulement un tiers du temps. Un autre tiers de worms testés ont seulement trois des quatre neurones visibles et pour le tiers restant, la différence seulement distingue entre les corps cellulaires dorsaux et ventraux, pas l’asymétrie gauche-droite (données non présentées). Le port plus étroit est associé à une hauteur inférieure à canal pour empêcher le ver fluctuation dans l’ensemble de l’axe z. Cette conception permet l’imagerie des mâles à l’avenir des études, qui, lorsqu’il est combiné avec la connaissance sans cesse croissante des mâles connectome25,31, permettra une meilleure compréhension de la fonction neurale spécifique au sexe.
L’analyse effectuée dans le présent protocole utilise le logiciel gratuit ImageJ pour mesurer les variations de fluorescence dans le neurone d’intérêt. Avec la conception actuelle, Tétramisole 1 mM dans la mémoire tampon efficace paralyse les vers et empêche le mouvement des neurones étant imagé. Si le mouvement n’est pas évitable, ou si l’utilisateur souhaite éviter l’utilisation d’un paralytique, scripts plus complexes de suivi doivent être écrits qui trace les neurones qui déplacent7. Toutefois, dans ce protocole, vers mâles seulement se déplacent quand ils étaient trop petits pour être efficacement limités par l’orifice de chargement et lorsqu’un stimulus aversif extrêmement, comme le glycérol. Même dans ces cas, le mouvement est court et ne nécessite pas de grandes quantités d’ajustements de suivi — définissant un retour sur investissement dans le nouvel emplacement de neurone soulage les afficheurs fluorescents incorrectes (Figure 2).
Une limitation du single-ver, imagerie piège est que ce qu’un ver peut être photographiée à un temps de1. Une autre limitation de ces pièges, c’est que les vers peuvent se coincer dans l’appareil, causant des dispositifs pour être bouché et « utilisées » après seulement quelques vers l’imagerie. Toutefois, le délai d’exécution rapide pour la fabrication de nouveaux appareils à partir d’un moule maître atténue cet inconvénient. Illumination prolongée de lumière bleue a aussi démontrée pour induire le photovieillissement dans c. elegans32,,33. Le délai relativement court expérimental du présent protocole (30 s) permet d’imagerie sans photoblanchiment mesurable. Toutefois, pour éviter le photoblanchiment et photovieillissement dans des expériences de plus de temps, la source lumineuse peut être pulsé7. Par exemple, lors de chaque exposition de 100 ms, la lumière peut être pulsée pour 10 Mme ceci a été démontré pour éliminer autofluorescence corps accrue au fil du temps,7.
Afin de bien tester les hommes pour leurs réponses à l’ascarosides, 4 (L4) mâles de stade larvaire doivent être isolées pour la première des hermaphrodites, pendant au moins 5 h, afin d’atteindre une réponse près de naïfs au phéromones23. Isolation pour moins que cette durée peut provoquer des animaux ne répondent pas à l’ascarosides. Cependant, cet isolement n’est pas nécessaire lors de l’essai des signaux non-ascaroside, comme le glycérol. Par souci de cohérence, toutefois, animaux étaient toujours isolés au moins 5 h avant l’imagerie calcique. Dans certains neurones, tels que le CEM, pas chaque stimulation va déclencher une réponse neuronale, et chaque SCE répondant fait pour générer un certain « code » de représentation neuronale. Ce phénomène en CEM a été observé par des études électrophysiologiques, ainsi qu’avec calcium, études d’imagerie comme ceux décrits ici23. Ainsi, transitoires mesurables de calcium dans les neurones de la CEM dans tous les animaux exposés au ascaroside ne sont pas garantis23. En fait, beaucoup d'entre les ascarosides étudiés à ce jour ne pas susciter calcium mesurables transitoires13,15,34,35. L’élicitation réussie de mesurables transitoires a été observée pendant que l’une des trois impulsions de phéromone dans deux des cinq animaux exposés à l’ascaroside d’intérêt (Figure 3). Cela correspond le taux de réussite observé antérieurement dans d’autres laboratoires23. Cette variabilité est une limitation lorsqu’il étudiait la réponse de phéromone et n’est pas en raison de l’emphase axée sur les hommes du présent protocole.
Lors d’enquêtes sur des transitoires de calcium obtenues en réponse à ascarosides, un ne devrait pas rejeter un manque de réponse cohérente sans complément d’enquête. Cela peut être vérifiée grâce à des expériences telles que les études électrophysiologiques afin de confirmer la réponse variable au sein d’une classe neuronale. Pour les neurones, tels que les cendres, qui répondent de façon fiable, une absence de réponse cohérente pourrait être révélateur de problèmes expérimentaux plus importants, tels que les erreurs de contrôle de stimulus. Le pic d’intensité des réponses peut également être étudiée si la variabilité est attendue dans la réponse. Les traces peuvent être tracées avec l’écart-type ou écart-type (comme dans la Figure 2F). Si l’écart est faible, les traces peuvent être tracées et analysés comme tels. S’il y a une quantité notable de variation menant à des écarts modérés, les données peuvent être tracées à la même chose, avec accompagnement heatmaps triées par réponse « type » pour montrer la variation de la réponse-par-réponse. S’il y a des variations significatives (Figure 3), dans laquelle les sommets ne peuvent être distribuées d’une manière gaussienne, les réponses peuvent être classés en réponse « types » (p. ex., dépolarisant, hyperpolarisant ou non polarisant)23. Les réponses qui correspondent à un certain « type » peuvent être tracées et analysés ensemble. De même, les heatmaps doit accompagner cette analyse aussi bien.
Aller de l’avant, ce dispositif peut être adapté afin de permettre l’imagerie des nématodes larvaires mis en scène par un rétrécissement de l’orifice de chargement encore plus loin. Outre un rétrécissement de l’extrémité de l’orifice de chargement permettra la contrainte de l’animal permettant l’imagerie de juste les cils des neurones sensoriels, par opposition au corps cellulaire. Tandis que d’autres dispositifs sont conçus pour la plus couramment étudiée hermaphrodite, cette puce olfactive adaptée permet l’imagerie de l’activité neuronale dans les circuits neurones mâles. Comme le connectome du mâle est encore être élucidé, étant capable de mesurer des neurones dynamique dans les réseaux de sexe est essentiel pour bien comprendre la signalisation neuronale. Différences entre les réponses des hermaphrodites et mâles peuvent maintenant être testés et mesuré à l’aide de cet appareil.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Manuel Zimmer pour nous avoir fourni le fichier de conception initiale qui a été adapté pour une utilisation avec des mâles ; Frank Schroeder de synthèse et de fourniture de RRSA #3 ; Ross Lagoy de perspicacité et d’assistance avec l’imagerie et l’analyse ; et Laura Aurilio pour la fabrication de maître et qui, aux côtés de Christopher Chute, a contribué à l’examen de ce manuscrit. Ce travail a été financé sous le 1R01DC016058-01 de subvention du National Institutes of Health (J.S.), la National Science Foundation grant CBET 1605679 (D.R.A.) et le Burroughs Wellcome Career Award à l’Interface scientifiques (D.R.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | - | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | - | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | - | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | - | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | - | - | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | - | - | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | - | - | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
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