Summary
線虫男性の効率的なカルシウム イメージング用適応「嗅覚チップ」をご紹介します。グリセロールとフェロモンに男性露出の研究も示しています。
Abstract
カルシウム指標の使用に神経回路のダイナミクスとその制御の私達の理解が高まります。マップを完全に神経系と透明な解剖学、線虫線虫は、カルシウムの指標を使用してリアルタイムのダイナミクスを理解するための理想的なモデルを示します。マイクロ流体技術や実験のデザインと組み合わせて、これらの指標を用いたカルシウム イメージング研究は自由移動と閉じ込められた動物で実行されます。しかし、ヴォックストロットらで説明されている嗅覚のチップなどの捕集装置を利用した前の調査があるより少なく共通の男性、両方の形態学的および構造的より一般的な両性具有者で使用するために設計されたデバイス異種。適応嗅覚チップを設計、若い大人動物を用いた男性神経イメージングにおける効率性の向上のために作製します。ターンは、動物を回転し、2 D イメージングで二国間ペア内で個々 のニューロンの分離を可能にするポートをロード ワームに組み込まれました。ワームは、以前両性研究に従ってマイクロ流体デバイス内での匂いの流れを制御する公開されます。カルシウム濃度は ImageJ のオープン ソース ソフトウェアを使用して分析しています。男性ベースのc. の elegansの量の増加対応記載手順必要がありますカルシウム イメージング研究、セックスに固有の神経信号のメカニズムの私達の理解を深めます。
Introduction
マイクロ流体デバイスなどを提供正確に制御された環境へのアクセス増加前記動物、線虫C. elegans、実験操作1をすることができます。これらの研究は、行動アッセイ、カルシウム イメージング、または実験結果1,2,3,4より正確な測定の結果、特定の表現型にも上映 5,6。マイクロは、試薬の最小限の量を活用しながら、詳細な実験を実行できる小規模液体条件を提供します。新しいマイクロ流体デバイス設計の一定の生産、アリーナ自然正弦波運動線虫の行動と神経イメージング研究における神経イメージング デバイスをトラップすることができるから、それぞれの使用方法が異なります・高スループットによる遺伝的形質解析画面4,5,6,7は、デバイスへの嗅覚研究。次のマスター型の製作、マイクロ流体デバイスが構築する高価な-マスターの再利用性を与えられる- で使いやすい、高スループット研究を介して迅速なデータを生成することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) などの高分子材料を用いたデバイスの作製時間以内の新しいデバイスを作成できます。
カルシウム イメージング研究は、リアルタイム8,9,10,11にこれらの細胞のダイナミクスを測定するのに遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) ターゲット細胞で発現を使用します。線虫 c. エレガンスの透過的な性質は、生きている動物のこれらの蛋白質の蛍光レベルのレコーディングのためことができます。GECIs が伝統的に、緑色蛍光タンパク質 (GFP) に依存-用いたセンサー GFP カルモジュリン M13 ペプチド (GCaMP) より最近の研究より良い信号対雑音比と赤いシフト励起プロファイルを許可するこれらのセンサーを適応しています。GCaMP6s や GCaMP6f などのセンサーを含む、これらの仕様が付いている蛋白質を変化の次の GCaMP3 の開発 (低速と蛍光をオフ-料金をそれぞれ高速)、RFP カルモジュリン M13 ペプチド (RCaMP)、および赤いシフトがあります。活性化のプロフィール。線虫の細胞特異的遺伝子のプロモータ配列でこれら GECIs の組み合わせ興味、特にニューロン12,13,14,15のセルを対象します。,16。
マイクロ流体研究にc. の elegansの使いやすさを感じ取ることが、ほぼすべての研究が両性具有に焦点を当てた。男性のみは 0.01 0.02 にもかかわらず野生型人口の % は、非常に貴重な所見はその特性から生じる。両性系の物理のコネクトームは何十年も17に完全にマップされている、男性のコネクトームの動物18の頭部領域を中心に、不完全なままです。男性のカルシウム イメージングの使用は男性の神経系と 2 つの男女間の差異の理解を生成するのに役立ちます。線虫 c. エレガンスの成人男性のサイズを小さく大きいの両性具有の設計された伝統的な嗅覚デバイスの読み込みポートで効果的かつ信頼性の高いトラップを防ぎます。これに対処するためヴォックストロット嗅覚チップ19の修正版は開発された狭い読み込みポート、チャネル背の低いと、ワームのロードのポート (動物を回転)、二国間左/右の可視化が可能になります神経のペア。このデザインができます: 若い成人男性の (1) の有効なトラップ、二国間の対ニューロンの両方のメンバーと男性のニューロンの神経活動の (3) の精密な画像処理の可視化のための動物の (2) のより信頼性の高い向き。
ますます、研究は、線虫の男性が様々 な ascarosides (ascr) または線虫フェロモン20,21,22,23 に両性具有とは異なる応答を示す ,24。したがって、ダイナミクスと男性のコネクトーム内表現の理解を深めると、さらにもっと適切ななっています。男性c. の elegans含む両性25,26, に存在しない 87 セックス特定ニューロンとしてのコネクトームを変更-未定方法。これらのユニークなダイナミクスをイメージすることは、私たちはセックス固有の応答と脳内表現を理解しです。
このプロトコルは男性のc. の elegansの神経イメージングのため男性に適応した嗅覚チップの使用を説明しますその。灰は 1 M グリセリン男性、以前の雌雄同体に確実に応答する侵害受容ニューロンの研究27。Ascarosides への暴露は、テストされる動物の大きい数を必要とする動物から動物へ変数を応答を引き出すことがあります。男性固有の CEM ニューロンの応答以前示されている、電気生理学とイメージング研究、カルシウム ascaroside #323に必ず対応します。
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Protocol
1 ですデバイス作製
注: を参照してください参照 1。
。注: シリコン マスター 1 , 7 上の SU 8 フォトレジストをパターン化の標準的な写真平版の技術を使用してシリコン マスター金型を作製しました。ウェハ パターン形成用フォトマスクは、25,000 dpi で印刷されました。男性適合デバイス機能ヴォックストロット嗅覚チップ デザイン 19 ポートをロード、m. ジマー (個人的な対応、2016) から得られるデザインを適応させるワームに変更。ターンは、動物の回転を制御する含まれています。ポート チャネルの読み込みワームの幅は、50 μ m に狭められています。すべてのチャンネルが 32 μ m 背の高いです。ユーザーがその後に従うことができますシリコンモールド マスターがユーザーに利用可能なプロトコル、前述 1
。- 重量 10:1 の比率でミックス PDMS ベースと硬化剤 。
- 転送ピペットを徹底的にミックスします 。
- すべての目に見える気泡の除去まで、1 時間真空デシケータで混合物をドガします 。
- は、厚さ 5 mm (100 g) それまでに 150 mm 直径の皿にシリコン金型マスターに混合物を注ぐ。パスツール ピペットを使用して混合物に導入されているほこりや泡を削除します 。
- 65 ° c 少なくとも 3 時間または一晩焼く 。
- メスを使用して、金型から PDMS を切り取って、かみそりの刃を使用して別のデバイスを切ろう 。
- 1 mm の皮膚穿孔器の入口と出口の穴をパンチします 。
- フラッシュ dH の穴 2 O, エタノール, と再び dH 2 O パンチから粒子を除去します。乾燥空気ストリーム パルス デバイス 。
- 粘着テープ、ほこりや成功した結合を許可するデバイスの残りの破片の取り外しを使用してデバイスの上側とチャネルの側面をきれいします 。
- プラズマ結合デバイス第 1 カバー ガラスに、チャネル側。
- 公開カバーガラスとデバイス (チャネル側を) 30 の 100 W などの適切な接合を可能にする条件を使用して空気プラズマ s か 60 24 W s.
注: 結合効率を改善するために設定を調整できます。プラズマ接合条件が接着性能を改善するためにしようとしたときに、適切な洗浄として重要ではないです。理想的なプラズマ条件下でも不十分な洗浄装置が結合しません 。
- 5 の親指でダウン デバイスのチャネル側にカバーガラスを反転 s.
- 公開カバーガラスとデバイス (チャネル側を) 30 の 100 W などの適切な接合を可能にする条件を使用して空気プラズマ s か 60 24 W s.
2。バッファーの準備
- 滅菌 10 x の在庫から S 基底 (100 mM NaCl と 0.05 M KPO 4、pH 6.0) x 1 Dilute 。
- バッファー ソリューションはすべての 1 S 基底 x 1 mM の最終濃度 1 M tetramisole 株式を希薄化します 。
- 両方にフルオレセインを追加、" フロー制御 "、" バッファー " 貯水池。
- 1 x の S の基底のフルオレセインの 100 mg/mL 素材を作成します 。
- フロー制御で 1 μ G/ml と 0.1 μ g/mL のバッファー内の最終濃度に株式を希薄化します 。
- 刺激を作成します。
- S 基底 × 1 で 1 M の最終濃度に希釈グリセロール 。
- 1 X の S の基底に 1 μ M の最終濃度に希釈 ascaroside #3 (ascr #3).
3。デバイスのセットアップ
注: 1 を参照してください
。 
図 1。マイクロ流体デバイスのセットアップ。(A) タンクとチューブ。30 mL シリンジのプランジャーとして機能せず、" 貯水池。 " これは 3 つの流れオプション ルアーロック バルブに接続されています。1 つの出口は、マイクロ流体デバイスに接続するチューブが挿入針 (オレンジ) に接続されている他、プランジャー付き 3 mL の注射器に接続されます。(B) 全体的なマイクロ イメージング実験のセットアップ。デバイスは、対物レンズの上の逆落射蛍光顕微鏡のステージに配置されます。" フロー制御 " バッファーがセットアップ上の棚ユニットによって制御されている三方弁を通過。行バッファーは、デバイスの適切なポートに挿入されます。(C) マイクロ流体デバイスのポート。" フロー制御 " ポート側面他の入口ポート: " 刺激 " と " バッファー " ポート。" コンセント " ポートは、一番右。ワーム読み込みアリーナの場所のため、" ロード ワーム " ポートは、デバイスの中央のポート。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
- 準備 3 3 ウェイ ルアーロック バルブ、3 mL シリンジと同様 ( 図 1 a) のようにルアーロック バルブに付いている針に 30 または 60 mL シリンジをアタッチすることにより流体の貯水池。マイクロ流体デバイスに拡張管に針を接続 ( 図 1 a のように -B).
- タンクとチューブから空気の泡を削除します 。
- S 基底 x 1 に接続されているチューブで 3 mL シリンジを記入し、コンセントに差し込みますポート
- バッファーが入口の穴の上部に表示されるまで、ゆっくり注射器に圧力を適用します 。
- 適切な入口の穴にフロー制御、バッファー、および刺激のチューブを接続 ( 図 1 b のように -C)、滴の液体が両方読み込みポートであることを確保する穴と添付するバッファー チューブ 。
- もう一度、軽くポート入口を読み込みワームに水滴が表示されるまでに、出口ポートに接続されている注射器に圧力を適用します 。
- ポートの読み込みワームに固体ブロックのピンを挿入
- 出口ポートからシリンジを外し、家真空 (-670 Torr) に接続されているコンセントの線を取り付けます 。
- 検査フローの任意の気泡のデバイス チャンネルは、視覚的に、カメラと互換性のあるソフトウェアを介してビデオの確認を使用、オープン ソース ソフトウェア マイクロ マネージャーなど。マイクロ マネージャーの使用に関するヒントについて、手順 6 を参照してください。
- 任意の気泡が存在する場合を待つ壁の任意の動物をロードする前にそれらを追放したり、PDMS に吸収される; 気泡の存在は、デバイスを介して流体の適切な流れを邪魔します 。
- デバイス内の適切な流動を確認 GFP フィルターを用いたワーム三方弁を作動し、バッファーの切り替えを観察することによって読み込み前。
- を決定する適切な流動ダイナミクス: フロー コントロールと緩衝溶液内に存在のフルオレセインを観察 ( 図 2 D -2E) コントロールを押してフロー コントロールの値が変更されたときの変更バルブのリンク ( 図 1 b) を 3 方向バルブに対応するボタン 。
- マイクロ マネージャーを開くと後をつけ " ライブ " デバイスのライブ画像を観察します。デバイスでバッファーの流れを観察する蛍光光源をオンに ( 図 2 D -2E).
図 2: 男性適応マイクロ流体嗅覚チップ。 ワームが公開されている場合のデバイスの流れ (A) パターン バッファーにします。バッファー (B) はブラウンに示すように、フロー制御 (FC) は白で刺激 (S) を黄色で表示。ポートをロード ワームはワーム向きのよりよい制御を可能にする、曲線を含むように適応されています。ワームは、刺激にさらされている場合のデバイスの流れ (B) パターン。バッファー (B) はブラウンに示すように、フロー制御 (FC) は白で刺激 (S) を黄色で表示。適応デバイス試作としての (C) の測定。42 μ m 男性の幅用 50 μ m チャネルを開けるポートをロード ワームを終了します。チャンネルの高さの測定値は、設計で 25 μ m の目標にもかかわらず、32 μ m です。(D E)A トラップ男性表現する p スラ 6:: GCaMP3。スラ 6 プロモーターは灰固有ではなく、ASI のカルシウム濃度は認められなかったが、ASI ニューロンにいくつかの表現を発生可能性があります。画像は、明視野と蛍光照明の組み合わせ (D) (E) は蛍光灯だけ。スケール バーは、堅牢な神経活動と 42 μ m. (F)、灰ニューロン応答 1 M グリセリンの刺激を示します。青色の領域は、1 M グリセリンの刺激の時間を示します。灰色の領域を示す n の標準エラー 7 ワームから 20 パルスを =。赤の痕跡を示す脱分極応答。Y は、ΔF/F 0 を表示します。スケール バーを示します 5 s. この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
4 動物準備
注: を参照してください参照 23.
。- イメージング灰 1 M グリセリン レスポンス。
P スラ 6 の肯定的な
- 場所約 20 c. の elegans 男性:: 線虫成長媒体 (NGM) 寒天プレート上に GCaMP3 配列式は芝生の エシェリヒア属大腸菌 OP50 シードします。配列陽性動物の識別のため蛍光 GECI の式および/または共同のインジェクション マーカーを使用します
。 注: 配列の肯定的な動物、使用 GECI によると蛍光を発する (GCaMP を表現する動物 など 蛍光を発する青色光刺激の下で緑 RCaMP 動物、緑光刺激の下に赤に蛍光を発する中)。共射出マーカーは GFP と、RFP など、他の蛍光蛋白質から rol 6 などの表現型マーカーの範囲や pha 1 突然変異 28 などの支配的な表現型を救出することができます。- 直前の試金、ピック若い成人男性を選ぶ場合。アッセイの前日を選ぶ場合選ぶ L4 幼虫男性 。
- 場所約 20 c. の elegans 男性:: 線虫成長媒体 (NGM) 寒天プレート上に GCaMP3 配列式は芝生の エシェリヒア属大腸菌 OP50 シードします。配列陽性動物の識別のため蛍光 GECI の式および/または共同のインジェクション マーカーを使用します
- CEM 1 μ M ascr #3 レスポンスをイメージングします。
- ピック約 20 L4 線虫 男性 (fkEx98 [p pkd 2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX 1];pha 1(e2123ts);彼 5(e1490);ライト 1(ce314))した dsRed 共射出マーカー式の正である
。 注: 男性の話のレイ ニューロン内の下流式は観察し、4 つの CEM 細胞内 GCaMP 式より確認を容易にします 。
- イメージングの実験を実行する前に 5-14 h の OP50 エシェリヒア属大腸菌 の芝生とシード NGM 寒天プレート上の両性具有からこれらの男性を分離します
。 注: 5 h 以上の孤立していない男性行動 ascr #3 に応答しない、したがってここでの観測より、ascaroside をさらに少ないカルシウム濃度を示すことがあります 。
- ピック約 20 L4 線虫 男性 (fkEx98 [p pkd 2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX 1];pha 1(e2123ts);彼 5(e1490);ライト 1(ce314))した dsRed 共射出マーカー式の正である
5。動物読み込み
注: refefence 1 を参照してください
。- 標準ワーム メンテナンス技術を使用して、シードされていない NGM 寒天プレート上に 1 つのワームをピックアップします。
- ピック、ピックに細菌を拾うピック (白金線を平坦化製) を燃やすことによってワーム、" を軽くたたく " それを拾うには、ワーム。独自をクロールすることができます、新しいプレートの上にワームをそっと置きます 。
- シードされていないプレートに約 5 mL の S の基底 x 1 を追加、プレートが殺到 。
- S 基底 x 1 が入力されている読み込み注射器 (すなわち、 3 mL シリンジ添付チューブ付き) にワームを引く。
- ワームのみチューブに、注射器にすべての道を吸うしてください
。 注: ワームは、注射器に移動した場合、それはほぼ管にそれを取り戻すことは不可能です 。
- ワームのみチューブに、注射器にすべての道を吸うしてください
- アウトレット ルアーロック バルブを回すことによって流れが停止する真空をオフにします 。
- ポートの読み込みワームをブロック固体ピンを削除
- 出口ポート ( 図 1 b) に接続して、それはガス抜きルアーロック バルブを有効にします
。 注: 場所および動物 (ステップ 5.8 5.13) の向きを確認するライブ ビデオ フィード ワームの読み込み中を使用します 。
- ポートの読み込みワームにチューブを読み込みワームを挿入
- ワームは、チャンネルの読み込み中に表示されるまで、優しく注射器に圧力を適用します 。
- ワームがチャネルを入力するを防ぐためにシリンジのプランジャーを引いて、ワームに尾最初チャネルを入力する起動する場合 。
- を適用して頭最初チャネルに入るまで圧力を逆転を切り替える 。
- 3 ウェイ ルアーロック バルブを回して真空雰囲気ではなく真空を開いてする出口ポートに接続されているオープン 。
- 頭が自由に移動できる、方向を設定し、バッファーの流路がそう遠くないさらされているようなワームの頭を配置するシリンジのプランジャーを押すことによって手動で圧力を適用 ( 図 2 D 2E).
6。刺激と獲得
- マイクロ マネージャーなど顕微鏡によるオープン ソース ソフトウェアを使用して、青の光励起を使用して 10 フレーム/秒で TIFF スタックとして画像をキャプチャすることにより記録 (470 nm) 30 s. 100 さんにメイン メニューに露出を設定
- オープン
- " マルチ D Acq。 " ソフトウェアのメイン メニューから。設定、" 数 " に " 300、" と " 間隔 " に " 0 " をクリックして " 取得! " ビデオを取得する。 。
- 適用取得を開始した後刺激 5 s の 10 s パルス。必要に応じて刺激アプリケーションの期間を調整します。
- 5 を取得した後、ビデオの s 変更対象動物に刺激を適用するフロー制御バッファーを制御する三方弁です。弁リンク ( 図 1 b) の一番左のボタンをクリックします 。
- 刺激露出の後 10 秒 (この時間を調整することができますユーザーが望ましい)、バルブのリンクを一番左ボタンをもう一度クリックしてバッファーのフローの変更します 。
- 30 のウィンドウがベースラインに戻り GECI 蛍光できるように完了するまでのみバッファーの下で記録 。
- は、必要に応じて繰り返します。買収の終わりと次の試験の開始の間待機 30 s.
7。画像解析
- ImageJ、オープン ソース ソフトウェアと ImageJ ウィンドウにファイルをドラッグすると、TIFF スタックを開く 。
- カーソルを使用してドラッグして関心のニューロン (ROI) 関心の領域を設定します。( 図 3 a) のように関心のニューロンの相馬を含めるリージョンを設定します 。
- オープンをクリックしてスタックの間で投資収益率の蛍光強度の z スタックをプロット-> 画像 > スタック - > プロット z 軸プロファイル 。
- をクリックして " リスト " ウィンドウで開きます。[編集] - > 値をコピーするコピーします。値を貼り付けるスプレッドシート プログラムにします 。
- GCaMP 式が含まれていないワームの領域に投資収益率をドラッグすると、各パルスの背景の蛍光性を分析します 。
- ニューロンの蛍光強度の値からバック グラウンド蛍光値を減算して、パルスごとの背景差分を実行します 。
- ΔF/F 0 各パルスの各フレームを計算します。
- 最初の 1 の投資収益率の平均強度の値として計算 F 0 獲得 (例えば フレーム 1-10) の s 。
- ΔF/F 0 を計算 F 0 値によって興味のフレームの背景減算値で除して計算します 。
- イメージすべてのニューロンのすべての刺激パルスを繰り返します 。
- 灰, などの一貫した応答プロファイル ニューロン各ニューロンのすべてのパルスを平均し、( 図 2 f) のように SEM を計算します 。
- は、各ニューロンの時間をかけて sem 平均 ΔF/F 0 をプロットします
。 注: このインスタンスそれは同様にそれぞれの試験の個々 の神経細胞の反応のヒートマップなどを含めるの一般的です。繰り返しの刺激で刺激への露出にカルシウムのトランジェントの一貫した変更を示さないニューロンまたは異なる個人 23 では、それはよりのようにの個々 の脈拍のトレースの表示に該当する可能性 図 4)。データを表示する方法を決定する方法の詳細について の議論 を参照してください 。
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Representative Results
全体的なデバイスの設定の例は、図 1 aBで見ることができます。図 1 aは、適切な貯水池建設とセットアップを示しています。図 1 bは、マイクロ流体デバイスに貯水池の接続を示しています。図 1は、個々 のポートをわかりやすくするためのラベル付きのマイクロ流体デバイスを示しています。
男性に適応したマイクロ流体デバイスの設計に読み込みポートのカーブが含まれているが、流動、ヴォックストロットによって設計されたデバイスと同じら19(図 2 a-2 C)。どのフロー コントロール バルブが開いて変更することにより、バッファーの流れを制御できます (図 2 a-2B)。作製されたデバイスの測定は、設計されたファイルによって異なります。図 2は、測定は、「として偽造された」の測定です。
男性に適応した嗅覚デバイスの配置と向きと同様、チャネル流ダイナミクスに男性のc. の elegansをロードした後、明視野と蛍光イメージングを通じて検証できること (図 2 D-2E)。1 M グリセリンに侵害受容ニューロン、灰で GCaMP3 を表現するワームの露出は目に見える変化で結果灰のニューロンは、神経活動 (図 2 f) を示す蛍光に.蛍光の微妙な変化を目では表示できない場合がありますが、これらの変化を定量化するソフトウェアを使用することができます。分析 (図 2 f) 時間をかけて 1 M グリセロールへの露出に灰ニューロンの蛍光強度を定量化し、ImageJ フリーソフトを使用できます。これは両性具有27と、グリセロールの神経応答を灰の堅牢性のために観察されるものと同様です、これはテストのすべての動物で観察されます。
軸方向または回転運動の少量は、しばしばビデオ解析 (図 3 a) の間にニューロンの追跡アルゴリズムを施行した unparalyzed の動物の予定です。バッファー (例えば、 1 mM tetramisole) で麻痺の追加は、いくつかの動物 (~ 10%) はまだ試験中に移動がほぼこの効果を排除します。これによって回避されることができます: (a) はより効率的に閉じ込められている; 古い男性を使用して(b) 幅またはさらにポートをロード ワームの厚さを減少させます。または、(c) どちらか使用される麻痺または別中風の人を使用して濃度が増加します。これがまたあることを確認しないトラップの末尾の頭と臭気チャネルにさらされるはあまりにも多く。ワームの動きとトライアルが発生すると、解析部を移動し、動き (図 3 b) が実行されるフレームから始まる新しい神経の場所から再読み込みすることができます。このインスタンスでユーザーによる神経トレースの手動再構築が必要です。スクリプト、ニューロン内の蛍光の変化を分析することおよび19を書き込むこともできますを移動するニューロンのセンターに従うこと。
男性のc. の elegans 234 セックス固有 CEM ニューロンを介して ascarosides と呼ばれる魅力的な生体フェロモンを感じる。男性でカルシウム濃度を観測すると、応答は、形、記号、およびニューロンと動物 (図 4 aB) の両方の間の大きさの変数です。しかし、フェロモンへの男性の応答は多くの動物 (図 4) カルシウム過渡現象として確実に認められなかった。これは、ほとんど ascarosides を行う感覚13,14,15時にカルシウムの過渡現象を引き出すないと落胆するではありません。
図 3: イメージ取得期間中にアドレスのワーム動き。(A) ΔF/F0 (最初 1 の平均バック グラウンド蛍光強度で割った蛍光強度の変化買収の s) 興味のニューロンは確実に 1 の静的な領域を定義することで ImageJ で算出しました s です。刺激パルス (青い部分) の間に動物が移動すると、カルシウム トレース上の画像に見られるように結果としてもはや分析領域 (黄色のボックス) に含まれるニューロン。スケール バーを示す 42 μ m. 破線表示各イメージでワームの場所に対応するトレースの地域。(B) 解析の領域は、試用期間中に次のニューロンに移動し、個々 のトレースが実際のダイナミクスを伝えるために再構築される場合、トレースは、動物が移動しなかった場合に表示されます。破線は、ワームの動きに修正されたトレースの領域を表示します。両方灰ニューロン、左と右のトレース (ASHR (ブルー)、ASHL (赤) それぞれ) が表示されます。Y は、ΔF/F0を表示します。スケール バーを示します 5 s.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 男性線虫CEM 1 μ M ascr #3 への応答は可変です。男性固有の CEM 細胞生体フェロモン応答の独自のパターンを表示します。(A) 各 CEM ニューロンと、1 つのパルスで 1 つの応答性の高い動物にみられる応答が表示されます。4 つの CEM ニューロンがあります: 腹側左 (CEM VL) 腹側右 (CEM VR)、背側左 (CEM DL) 背右 (CEM DR)。3 つ 4 つのニューロンは、4 番目に応答していない、ascaroside でのさまざまな形や大きさ、したりで応答します。(B) 約 3 分の 1 (本研究では 2/7 テスト) トラップの動物のイメージを作成することができる唯一の 3 つのニューロンの結果。この向きでワームの応答は、最初のワームで観察されたものより異なっていた CEM カルシウム トランジェントで起因しました。CEM DR が両方の向きで表示されると動物の間の変数の応答を展示として、これはワームの方向を変更したためでした。(C) 多くのワームがない (本研究では 5/7 テスト) 任意の検出可能なカルシウム トランジェントで応答します。示されている個々 のトレース、プロット上の画像に示すように単一動物の代表です。、スケール バーを示す 42 μ m トレース: 青色の領域は、1 μ M ascr #3 露出の時間を示します。赤の痕跡を示す脱分極応答。黒のトレースを示す観測応答ありません。Y は、ΔF/F0を表示します。スケール バーを示します 5 s.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
男性に適応した嗅覚チップは、男性c. の elegansの効率的なトラップの方向のより詳細に制御でき狭いロードポートにターンを組み込みます。Z スタックを必要とせず、神経の二国間ペアの左と右の両方のメンバーの可視化が可能になります。この曲線は、アッシュ (2 D 図-e)29,30などの蛍光マーカーで 1 つだけの二国間のペアが割り当てられているワームの時間の垂直 100% から方向に します。ただし、CEM など 4 つの放射状に対称なニューロンと神経のクラスですべての 4 つのニューロンが表示されます時間の 3 分の 1 だけ。ワームをテストの 3 分の 1 3 つのだけ目に見える 4 つのニューロンと残りの 3 番目ののみ区別の違いは、背側と腹側の細胞体、左右非対称性 (データは示されていない) のいない間。狭いポートは、z 軸にワームの変動を防ぐためにより低いチャネル高さと結合されます。このデザインは、将来的に男性のイメージング研究、男性コネクトーム25,31の絶えず増加の知識と組み合わせると、性特異的神経機能の理解を深めるためになります。
このプロトコルに行われた分析は、関心のニューロンの蛍光の変化を測定するのに ImageJ の無料のソフトウェアを使用します。現在の設計では、バッファーに 1 mM tetramisole 効果的にワームを麻痺させるし、イメージされているニューロンの移動を防ぐことができます。運動は、予防ではない場合、またはユーザーが麻痺の使用を避けたい場合は、7を移動するニューロンを追跡するより複雑なトラッキング スクリプトを書かれてする必要があります。ただし、このプロトコルでは男性ワームのみ移動彼らが小さすぎて読み込みポート、グリセロールなどの非常に嫌悪刺激を提示されたときに効果的に拘束します。これらのインスタンスでも動きは簡単と大量のトラッキング調整を必要としない-不適切な蛍光読取 (図 2) を軽減する新しいニューロン周辺の投資収益率を設定します。
シングル ワームの制限、トラップ ベースのイメージングは、1時間で視覚化されるその 1 つだけのワームです。これらのトラップのもう一つの制限は、デバイス内ワームが動けなくことができますのみいくつかのワームをイメージングした後目詰まりするデバイスと「を使用」を引き起こしています。ただし、マスター型から新しいデバイスの作製を迅速な納期では、この欠点が軽減されます。拡張の青色光照明は、線虫32,33の光損傷を誘導するために示されています。この議定書の比較的短い実験時間枠 (30 s) 測定可能な退色せずイメージングが可能になります。しかし、長い実験で症状や退色を避けるためには、光源がパルス7をすることができます。たとえば、10 さんこれが7時間以上増加体蛍光を除去するために示されているため、各 100 ms 露光中に光をパルスできます。
Ascarosides への応答の男性を適切にテストするために幼虫の段階 4 (L4) 男性最初分離しなければなりません、少なくとも 5 時間の両性具有からフェロモン23に近い素朴な応答を達成するために。この期間よりより少しのための分離は、ascarosides に対応するため失敗する動物を引き起こす可能性があります。ただし、グリセロールなどの非 ascaroside キューをテストするとき、このような分離は必要ではありません。しかし、一貫性を保つのために、動物いたカルシウム イメージング、少なくとも 5 h 前に分離では常に。CEM など、いくつかのニューロンのすべての刺激は、ニューロンの応答を引き出すだろうし、応答は各 CEM は、特定の「コード」の神経表現を生成します。CEM のこの現象は、電気生理学研究を介してだけでなく、カルシウム イメージング研究ここで23で説明したもののように観察されています。したがって、ascaroside 露出のすべての動物の CEM 細胞で測定可能なカルシウム濃度23は保証されません。実際には、日付に調査した ascarosides の多くは測定カルシウム トランジェント13,15,34,35を引き出すないです。測定可能なトランジェントの成功の獲得していた中の 1 つだけ興味 (図 3) の ascaroside にさらされる 5 つの動物の 2 つのフェロモンの 3 パルス.これは以前他のラボの23の観察の成功率と一致します。この変動は、フェロモン応答を勉強するときは制約と男性ベースのフォーカスこのプロトコルのためではないです。
Ascarosides に応答を誘発するカルシウム濃度を調査するとき 1 つはより詳しい調査なしの一貫した応答の欠如を解任しないでください。これは、神経のクラス内で変数の応答を確認するための電気生理学研究などの実験をテストできます。灰などの神経細胞の応答、確実に一貫した応答の欠如は刺激性制御のエラーなどの大きな実験的問題を示すかもしれない。応答の変動が予想される場合、応答のピーク強度を検討もできます。トレースは、標準偏差と標準誤差 (図 2 f) のようにプロットできます。標準偏差が小さい場合トレースをプロットし、などを分析することができます。中程度の標準偏差につながる変化の顕著な量の場合は、データをすることができます応答応答-応答による変化を表示する「タイプ」によって並べ替えられてヒートマップなどを伴うと、同じプロット。応答を応答 (例えば、脱分極、過分極、または非偏光) の「種類」に分類できる有意な変化 (図 3)、前記ピークは、ガウスの方法で配布することはできません、がある場合23。「型」に分類される応答をプロットし一緒、分析できます。同様に、ヒートマップなどもこの分析を伴うべきであります。
前進して、このデバイスを読み込みポートをさらに狭くすることによって線虫の幼虫上演のイメージングを可能にするのに適応できます。ロードポートの末をさらに絞りこみに動物の制約の感覚ニューロンの細胞体ではなく繊毛だけのイメージングを可能になります。他のデバイスより一般に調査の両性具有者のようなこの適応の嗅覚チップ男性の神経回路における神経活動イメージング可能になります。男性のコネクトームはまだ解明されている、セックス固有のネットワークのダイナミクスを測定することができるという神経伝達を完全に理解する重要です。雌雄同体と男性の反応の違いは今テストすることができます、このデバイスを使用して測定します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
男性; に対応した初期設計ファイルをご提供するマヌエル · ジマーを感謝したいと思います合成と ascr; #3 の供給のためのフランク ・ シュレーダー洞察力とイメージングと分析支援のためロス Lagoyこの原稿のレビューに貢献したクリストファー ・ シュートと一緒に、マスターの作製とローラ Aurilio.この作業に資金は国立衛生研究所の助成金 1R01DC016058-01 (バッハ)、全米科学財団助成金あわせて 1605679 (D.R.A.)、バローズ Wellcome キャリア賞科学的なインターフェイス (D.R.A.) の下で提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | - | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | - | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | - | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | - | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | - | - | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | - | - | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | - | - | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
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